1、生物分子類實驗室常用實驗技術原理匯總一、GST pull-down 實驗基本原理：將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結合物后通過 SDS電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩 選相應的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達 系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。注：GST即谷胱甘肽疏基轉移酶(glutathione S-transferase) 二、足印法(Footprinting )足印法(

2、Footprinting )是一種用來測定 DNA金白質專一性結合的方法，用于檢測目的DNA序列與特定蛋白質的結合，也可展示蛋白質因子同特定DNM段之間的結合。其原理為：DNA和蛋白質結合后，DNA與蛋白的結合區域不能被 DNase (脫氧核糖核酸酶)分解，在對目的 DN際列進行檢測時便出現了一段無DN際列的空白區(即蛋白質結合區)，從而了解與蛋白質結合部位的核甘酸數目及其核甘酸序列。三、染色質免疫共沉淀技術( Chromatin Immunoprecipitation , ChIP)染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation , ChIP)是研究體內蛋白

3、質與 DNA相互作用的有力工具，利用該技術不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉錄因子與基因表達的關系。染色質免疫沉淀技術的原理是：在生理狀態下把細胞內的DNAW蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合白D DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯反應的逆轉，DNA勺純化及鑒定。四、基因芯片(又稱 DNA芯片、生物芯片)技術基因芯片指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子

4、的數量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定于2cnf的硅片、玻片等支持物上， 構成的一個二維 DN琳針陣列，被稱為基因芯片。 基因 芯片主要用于基因檢測工作?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序 列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核甘酸的探針。當溶液中帶有熒光標 記的核酸序列 TATGCAATCTAG基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補匹配時，通過確 定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據此可重組出靶核酸的序列。由臬交位置確定的一組組人楂甘

5、酸探針+雜交探針組*重組的互補序列,TATGCAATCTAGTATGCAATCTAG 輪序列 +基因芯片的測序原理五、高效液相色譜（HPL。高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論， 在技術上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。高壓泵將貯液罐的流動相經進樣器送入色譜柱中， 就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時, 行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器， 到液相色譜圖。然后從檢測器的出口流出， 這時整個系統 流經進樣器的流動

6、相將其帶入色譜柱中進 記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得六、酵母雙雜交（Y2H酵母雙雜交系統的建立酵母雙雜交系統的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認 識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉錄激活因子在結構上是組件式的，即這 些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有DNA結 合結構域（DNA binding domain,簡稱為BD）和轉錄激活結構域 （activation domain,簡稱為AD）,BD可識別DNA的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游；AD可同轉錄 曳合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。單獨的

7、BD雖然 能和啟動子結合，但是不能激活轉錄，不同轉錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激 ；舌轉錄的功能（如爵母細胞的GH4蛋包的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結構域 B42融合得到的雜合蛋且仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉錄）如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4 DNA結合結構 域和GAL4激活結構域就會相互作用，從而激活la cZ報道基因的表達。 所以我們可以通過轉化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相 互作用6圖5-31酵母雙雜交體系原理示意圖。(a)GAL4的DA-BD和蛋白質X結合形成的雜 種蛋白，同GAL1的UAS序列結合，但由于沒有同AD結合，故不

8、能啟動報道基因轉 錄：(b) GAL的AD同蛋白質Y結合形成的雜種蛋白，沒有同UAS序列結合，故不能 啟動報道基因轉錄；通過這兩個雜種蛋白中的X蛋白和Y蛋白之間的相互作用， 在細胞內庖建了GAL4M功能，結果啟動報道基因進行表達NLPE& P(rK酵母雙雜交系統通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報 告基因的轉錄激活來捕獲新的蛋白質，其大致步驟為：1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait),將其與DNA結合域夢合， 構建成誘餌質粒。2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉錄激活域融合，構建成文庫質粒。3、將這兩個質粒共轉化于酵母細胞中。4、酵母細胞中，已分離的DNA結合域和轉錄激活域不會相

9、互作用， 但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基 因的轉錄；反之，則不能。利用報告基因的表達，便可捕捉到新的蛋白質:母單雜交系統的原理用于醉母單雜交系統的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉錄因子。研 究表明GAL4的DNA結合結構域靠近殘基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵 母半乳楣首酶的上游激活位點(UAS);而轉錄激活結構域可與RNA聚合酣或 轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA 結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發揮作用。據此，我們可將GAL4的DNA結合結構域要換為其他蛋白，只要他能與 我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可

10、以通過其轉錄激活結構域激活 RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉錄。酵母三雜交的原理酵母三雜交系統的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細胞的GAL4 蛋白調節目的基因(半乳糖昔酶基因及His3基因)轉錄的特點，GAL4蛋白 具有兩個可分離的功能區，N端是DNA結合結構域，C端為轉錄激活結構 域.只要這兩個相對獨立的結構域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠 近(如借助其他分子的相互結合使其足夠靠近)，即使它們之間沒有共價結 合也可激活轉錄，這為9f究蛋白質與其他分子的相互作用提供了可能。七、噬菌體展示技術噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源

11、基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時 ，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬 菌體表面的生物技術。噬菌體展示技術是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體， 然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經過3輪5輪的“吸附

12、-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。 所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結合特性的目標噬菌體。噬菌體展示技術原理噬菌體展示技術是將外源DN A通過基因工程技術克隆到適當的 噬菌體載體上，使外源DNA片段對應的表達產物融合在噬菌體的衣 殼蛋白上形成融合蛋白，呈現在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可 保持相對的空間結構和生物活性，然后利用靶分子，采用適當的淘洗 方法洗去非特異結合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結合靶 分子的目的噬菌體：外源多肽或取白質表達在噬菌體的表面而其編 碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA序列測序出該技術的顯著特點是建立了基因型和表

13、現型之間的對應關系n八、RN砥?。═rizol 法）Trizol試劑中的主要成分為異硫鼠酸月瓜和苯酚，其中異硫鼠酸月瓜可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將 RNA!放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNAS入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和 DNA離開。水相層（無色）主要為RNA有機層（黃色）主要為 DNA和蛋白質。TRIzol法抽提總RNA組織100mgI加ImITRIzolI勻漿（要徹底，后轉至EP管）（組織勻漿量100mg時分裝1ml/每EP管）I顛倒混勻10下，室溫5分鐘（3（TC孵育）I加氯仿1

14、/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）X顛倒混勻15S,室溫2-5分鐘（30。（3孵育）I4,離心12000g, 15分鐘轉上層水相（約400ul）于另一 1.5mlEP管中加等體積異丙醇（約400 -500 ）,混勻室溫10分鐘4,離心12000g, 10分鐘（3O*C孵育）I棄上清1加冰預冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml4離心7500g, 5分鐘棄上清.空氣干燥570分鐘（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20 ul （10。-20打）（可在55-&TC水中，10分鐘助溶）實驗流程圖細胞IJ喀雌 寺懸浮細胞九、RT-PCRRT-PCR是將RNA的反轉錄（RT和cDNA的聚合酶鏈

15、式擴增（PCR相結合的技術。首先經 反轉錄酶的作用從 RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。實驗步驟：1、RNA的提?。?、反轉錄合成cDNA3、PC班增；4、產物的電泳和結果的測定。十、實時熒光定量 PCR(Q- PCR ( Real-time Quantitative PCR )利用熒光信號的變化實時檢測PCRF增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過 Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。閾值：是循環開始 315個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，設定在擴增曲線指數增長

16、期。C(t)值：熒光信號(擴增產物)到達閾值時所經過的擴增循環次數。電_ Q-PCR分四個階段平臺明 線性1曾長期指效增長期基線期如何定量? Ct值的概念, Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對 應的循環次數.BCA法測蛋白質濃度MM實驗原惻定蛋白質即在堿性條件下蛋白質與 向+絡合，并將其還原成Cu1+q Cul+和殖BC A試劑反應，使其由原來的革果綠形成CA （bicinchoninic acidr 二辛J酸）法穩定的 復合物，在562 nm有強烈的光吸收，旦吸光值和蛋白質濃度在 廣泛范圍內有良好的線性美系，因此可 用于蛋白質濃度測定口方法火敏度時間

17、原理干擾物質說明凱氏定鼠法t Kjedahl ji ）具域值低* i+0.2-1 Omg 期.誤差為12，*7。小時將蛋門城轉化為 次.用超吸收后淌 定茅景自氯E用 二期乙喂近就 IE白灰的分段J用于標準蛋白般含量的準確漓定 T 擾弧獨時大長，司縮睬法(Biuret 江其酸度假 kDOmg中速20-30 分耳城現一限性一廣T微色絡合物硝酸資TH*舞沖泡:臬些繳暴靛測定快速.但不太 鼠敢：不同蛋白場 顯色相似.些外1ftlitt法較為我坡悵K57仆分鐘量白原中的酪鼠醴 曲色亙府破M布 2KQnm處晌上暝收各護喋吟引唱薦杵核件酷用卜所梅住流出液 的椅泅；根除的吸 收可以校正。Folin-的試劑法L

18、c* i 法)靈峨度高*5四慢速4a60分鐘以割ii就反應；礴出翻一璘鴇酸試劑被Tyr和Ph匕汪跟磁橫鎮iTris /沖液;甘城底：各種硫附棘費時間長.捷作理尸珞*時；翻色現褪陂不同童 白質菱他考斗斯痛攏法(BratlRird 注)更嫌陵最高1噸快速575分鐘而馬斯亮獨軀耳 蛋白族轉臺時,其 XmK由465nm變為 EQfnrri強修性攜沖液FTrrLcnXlOO;SDS最好的，l it 物戰少；顏色熊定； 顏色淺法隔不同生 件質變化.十二、大腸桿菌感受態細胞( E.coli DH5 a )制備1、前夜接種受體菌(DH5或DH10B ,挑取單菌落于 LB培養基中37c搖床培養過夜(約16小時)

19、;2、取1ml過夜培養物轉接于 100ml LB培養基中，在37c搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時(250-300rpm );3、將0.1M CaCl 2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；4、吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5、4c下3000 g冷凍離心5分鐘；6、棄去上清，加入100微升預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置 20分鐘；7、4c下3000 g冷凍離心5分鐘；8 、棄去上清，加入100微升預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞 重新懸?。? 、細胞懸浮液可立

20、即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑(15%- 20%T油)后超低溫冷凍貯存備用(70C)。十三、堿變性提取質粒 DNA堿變性提取質粒 DN蝠基于染色體 DNA與質粒DNA勺變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體 DNA勺氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA勺大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其 pH至中性時，變性的質粒 DNAX恢復原來的構型，保存在溶液中，而 染色體DNA能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNAW不穩定的大分子 RNA蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。十

21、四、目的基因的連接、轉化及克隆篩選(1)總過程：分PCR分離目的基因切限制性內切酶切割接目的基因與載體相連轉轉入宿主細胞篩篩選陽性重組體(2)分PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選(3)切限制性內切酶切割：粘性末端、平末端(4)接目的基因與載體相連原 理：利用DNA聚合酶反應時都有在 PCR產物的3末端添加一個或者幾個 A堿基的特性 和利用T載體3末端的T堿基和PCRT物的A堿基互補配對，經連接酶作用，完成與載體的 連接。2.與T載體直接連接| (1) PCR產物兩個3,端一般都有一個A|Taq DNA聚合酶的特性：在DNA雙 鏈的于端再加上一個多余的核甘酸(優先加A ) 口(2

22、) T載體的兩個3,端人為地各加一個T利用T叫DNA聚合酶，當原料中只 有dTTP時，被迫在平端載體上添加T!(5)轉轉入宿主細胞感受態細胞：經過電擊、CaCl2、RuCl等化學試劑處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源 DNA分子通過時細胞的狀態。實驗流程感受態細菌（勿動連接產物混勻42（水浴lOOul10ul 冰浴中 30s900涂板加入500pl LB培養液培養過夜,沐浴L2 min 37。（3振蕩培養60min（6）篩篩選陽性重組體篩-一篩選陽性重組體 藍白斑試臆OPTCHXgal試驗）原理:基因的調控壽列和除146個氨基酸的編碼序列.在褊碼序列中插入了一個多克隆位點,不破壞閱

23、讀框架,酬E8-T Vector含有編碼B-半乳糖替BS基因（LacZ不雄嘀功能.當這種載體轉入的宿主細胞是含有B -半 乳糖昔薛逑嬪碼序列時，此酶的端序列和端序列可 以互苻（稱為。互補），產生具有酷活性的蛋白質（B 一半乳港音BE），從而使宿主細菌在含有IPTC （襄濤導 劑），X-al （生色底物）的培養基上呈藍色.然而外漏片段插入到質粒的多克隆位點后.破壞原有的閱讀檀.此同樣請次下，帶重組質粒的細菌形成白色藤落.十五、RNAT擾（RNAi）一些小的雙鏈RNA（siRNA）可以通過促使特定基因的mRNA條解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNAT擾

24、（RNAi）。RNA干擾研究的一般流程確定目的基因根據相對應的核酸序列設計出siRNA的序列獲得SiRNA用siRNA轉染細胞分析RNA干擾的效果十六、cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNAends,RACE)技術是一種基于 mRNAi 轉錄和PCR技術建立起來的、以部分的已知區域序列為起點，擴增基因轉錄本的未知區域 ，從cDNA5進而獲得獲得全長cDNA3RAC限術已逐漸取代了經典的cDNA文庫篩選技術，成為克隆全長cDNA序列的常用手段。而獲得

25、mRNA(cDNA)S整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐度轉錄本中快速增長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便效等優點，可同時獲得多個轉錄本。因此近年來RT fth ancfio Reporter Quencher5,荔林憶有加告息團(Reporter. R),髭FAM. VICf3 3玲城記南英光洋天臬團(Quencher. Q):捉針克兔，R所發射的次光能受找Q基團吸收,無臭光，R與Q分開，發繞光Taq鼎力5 -3仆切核改魘話忙，可米解探針FRETMolecule Beacon Principle實時熒光定量PCR的分類一一分子信標三標記熒光的發夾探針三環與目標序列互補X莖由互

26、補配對序列組成實時熒光定量PCR的分類一一分子信標二十四、雙分子熒光技術用別互在發目四、雙分子熒光互補技術(bimolecular fluorescence complementation, BIFC)BiFC技術是將熒光蛋白(GFP、YFP、 分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再 與目標蛋白連接。如果力個目標蛋【I因為有 作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片 空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因 出熒光。在發光顯微鏡下，就能直接觀察到 標蛋白是否具有相互作用，對研浣蛋白質相 用有重要意義。7雙分子熒光互補技術BiFC雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence co

27、mp 1 emen La t i on, BiFC)分析技術,利用綠色熒光 蛋白(green fluorescent protein, GFP)及其突變 體(YFP, CFP, BFP)的特性作為報告基因，將熒光蛋白 分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與H 標蛋白連接.如果兩個n標蛋白因為有相互.作用而靠 近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠 近，重新形成活性的熒光基團而發出熒光.在熒光顯 微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作 用，并“在最接近活細胞生理狀態的條件卜觀察到其 相互作用發生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質復 合體的穩定性，以及細胞信號分子對其相互作用的

28、影 響等,這些信息對研究蛋白質相互作用布一定意義。Principle of the BiFC assayAtesorpbcn (NoftuorcscrnctAbsorptionEmlssbriB4fore BiFCAtfterBiFC二十五、酶聯免疫吸附測定（ELISA）ELISA是一種免疫測定（immunoassay, IA ）。基礎：抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的 酶標記。加入酶反應的底物后， 底物被酶催化成為有色產物， 產物的量與標本中受檢物質的 量直接相關，由此進行定性或定量分析。用于臨床檢驗的ELIS A主要幾種類型：落整雙抗體夾心法測抗M I常病夾心法二1雙抗原夾心法測抗體 間接

29、法測抗體（常用）一競爭法測抗原競爭法工、競爭法測抗體捕獲包被法測抗體親和素生物素ELISA法雙抗體夾心法測抗原a憂體史包被特異性抗體洗滌加入待測樣品孵肓 洗滌加酶標特異性抗底孵肓 洗海底物顯色間接法測定抗體示意圖標記的抗體加底物顯色間接法測抗體間接法是檢測抗體最常用的方法。原理：利用酶標記的抗體檢測已與固相結合的 受檢抗體，故稱為間接法。寺檢抗體+ 肉和抗原1 .包被抗原2 .洗滌3 .加待檢抗體4 .洗滌5 .加酶標抗體6 .洗滌7 .加底物顯色8 .觀察結果。勺。33 : 產。 egoer:血清稀釋度 8 6 224 24816326412255110陽性對照陰性對照酶聯免疫吸附試驗（EL

30、ISA,間接法）競爭法測抗原8 o 待檢抗原6 Q g的標記的抗體+ YYYY 上加底物T 顯色11M相抗體8檢標記的抗原YYYYY Y Y Y固相抗體力山氐物顯色(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。(2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶 液，使之與固相抗體反應，孵育洗滌。(3)加底物顯色：參考管中由于結合的醉標抗原最多, 故顏色最深。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量 越多。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表 受檢標本抗原的量。操作步驟：(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗 滌。(2)加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固相抗原結 合，形成固相抗原

31、抗體復合物，孵育洗滌(3)加酶標抗體，與固相復合物中的抗體結合，從而使 該抗體間接地標記上酶，孵育洗滌。(4)加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。捕獲包被法測抗體雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAG分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。二十七、mRNA勺分離與純化（寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA真核細胞的mRN砌子最顯著的結本特征是具有 5端帽子結構（m7G和3端的Poly（A） 尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞 mRNA勺3端存在20-30個腺甘酸組成的Poly （A）尾，通 常用Poly （A+）表示。這種

32、Z構為真核 mRNA勺提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（UJ）瓊脂糖親合層析分離純化 mRNA勺理論基礎就在于此。mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly （A+）的特點，在 RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在 高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液 和蒸儲水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。二十八、His-tag純化蛋白His?Tag序列（6、8或10個連續的組氨酸殘基） 與固定在基于 NTA（

33、氮川三乙酸饃）-和IDA- 的His?Bind樹脂上的二彳M日離子 Ni2+結合。洗去未結合蛋白后，用咪陛或稍低的pH洗脫并回收目標蛋白。該通用系統使得可在溫和、非變性條件，或存在 6M月瓜或尿素條件下純化蛋白。His-親合示意圖s s S .V n hihih(QCOOHelulian=O=C - C-C O =C=C=C=NQH OH C-COOHMetal Chelate Affinity Chromatography 二十九、RNA 酶保護試驗方法 （RNase Protection Assay , RPA）RNA酶保護法是近十年發展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將

34、標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的 RNA樣品液相雜交，標記的特異 RNA探針按 堿基互補的原則與目的基因特異性結合，形成雙鏈RNA;未結合的單鏈 RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異 RNA探針結合后形成雙鏈 RNA ,免受RNA酶的消化，故該方法命名為 RNA酶保護實驗。與Northern blot和RT-PCR比較， RPA有以下幾個優點：1,檢測靈敏度比Northern雜交高。由于 Northern雜交步驟中轉膜和 洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而 RPA將所有雜交體系進行電泳，故損 失小，提高了靈敏度。2,由于PCR擴增過

35、程中效率不均一和反應平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。3,由于與反義RNA探針雜交的樣品 RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分 降解的RNA樣品仍可進行分析。4,步驟較少，耗時短。與 Northern雜交相比，省去了轉膜 和洗膜的過程。5. RNA-RNA 雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。 6, 一個 雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7.檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。 三十、免疫組化 二、免疫組織化學(Immunohistochemistry

36、) 原理七免疫組織化學.即免疫細化.地應用免疫學基本原理抗原抗體反應.即抗原 與抗體特異性結合的原印，通過化學反應使標記抗體的顯色制(熒光素、酬.金屬離 同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(的肽和蛋白質).時其進行定位,證性及 定后的研究常用免疫組化塞臉的rr組織石好切片、組織冰流切片,細胞爬片或配 胞涂片 三十一、各種分子標記技術的比較 限制性片段長度多態性 (Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP)可以作為遺傳標記，開創了直接應用 DNA多態性的新階段，是最早應用的分子標記技術。RFLP是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位點的分布情況，因此DNA序列上的微小變化，甚至1個核甘酸的變化，也能引起限制性內切酶切 點的丟失或產生，導致酶切