1、第五章 固相析出分離法目的：濃縮；初步純化 ；將已純化的產品由液態變成固態，加以保存或進一步處理。固相析出法是最古老的分離和純化生物物質的方法，但目前仍廣泛應用在工業上和實驗室中。概述固相析出分離法：生化物質目的物經常作為溶質存在于溶液中，改變溶液條件，使它以固體形式從溶液中分離的操作技術。 固相析出操作常在發酵液經過過濾和離心（除去不溶性雜質及細胞碎片）以后進行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經進一步提純，如透析、超濾、層析或結晶制得高純度生化產品。固相析出法不僅用于實驗室中，因其不需專門設備，且易于放大，也廣泛用于生產的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。

2、優點：操作簡單、經濟、濃縮倍數高缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強 鹽析法 有機溶劑沉淀法固相析出法 等電點沉淀法 結晶法 其它多種沉淀法結晶法：析出物為晶體。沉淀法：析出物為無定形固體。固相析出法分類第一節 鹽析法第二節 有機溶劑沉淀法第三節 其它沉淀方法第四節 結晶第一節 鹽析法一、基本原理二、影響因素三、鹽析操作定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。優點：簡單、經濟、較少變性缺點：分辨率不高；沉淀含大量鹽析劑，要除鹽；產生氨的惡臭7兩種現象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋

3、白質溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質溶解度減小87/17/2022南京農業大學 生命科學學院97/17/2022南京農業大學 生命科學學院10一、基本原理11鹽析作用（salting out）原理破壞雙電層：在高鹽溶液中，帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質表面的電荷，使蛋白質分子之間電排斥作用相互減弱而能相互聚集起來。破壞水化層：中性鹽的親水性比蛋白質大，鹽離子在水中發生水化而使蛋白質脫去了水化膜，暴露出疏水區域，由于疏水區域的相互作用，使其沉淀。logS=-KsS蛋白質溶解度，g/L；鹽離子強度, Cii離子濃度，mol/L；Zii離子化合價；常數,為縱坐標上的截距;Ks鹽析常數。1

4、3鹽析和KS鹽析右圖示：鹽離子濃度與蛋白質溶解度關系曲線，在鹽析區，符合公式兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進行鹽析，稱作Ks鹽析法。 由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，因此常用于提取液的前處理。（2）在一定離子強度下僅改變pH和溫度進行鹽析，稱作鹽析法。 由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，后期分離（結晶）14二、影響鹽析的因素1.無機鹽的種類在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱陰離子鹽析效果 ：檸檬酸PO43- SO42- CH3COO

5、- Cl- NO3-SCN-陽離子鹽析效果：NH4+ K+Na+ 高價陽離子陰離子的影響大于陽離子鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經濟鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑（1） 價廉 ；（2） 溶解度大，溫度系數小，許多蛋白質可以鹽析出來；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，（4）不易引起蛋白質變性。缺點：（1）水解變酸；（2）高pH 釋氨，腐蝕；（3）殘留產品有影響。不同種類蛋白質所需的無機鹽量不同先后加入不同量無機鹽分級沉淀蛋白質2.溶質（蛋白質等）種類：Ks、不同蛋白溶解度與離子強度的關系鹽析分布

6、曲線19蛋白質濃度不同：所需無機鹽用量不同蛋白質濃度高：所需無機鹽量少制成品：可適當高濃度，但濃度過高，易共沉淀重疊蛋白分級：適當稀釋，共沉淀小，但回收率降低。3.溶質（蛋白質等）濃度：23%不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線無機或稀鹽溶液：T蛋白質溶解度高鹽溶液： T蛋白質溶解度蛋白質：室溫鹽析對溫度敏感的酶，0C4C4.溫度：溫度對溶解度的影響5.pH：Pl鹽析注意高鹽下pl的偏移：與負離子結合向低pH偏移，與正離子結合向高pH偏移利用蛋白質pl的不同：可分級沉淀蛋白質三、鹽析操作1.鹽析用鹽的濃度表示硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；

7、工業上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優點在于硫酸銨濃度變化有連續性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結晶。鹽析用鹽量的表征-飽和度：飽和度（Saturation）的概念： 以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和濃度是767g/L定義為100%飽和度目標蛋白質的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃

8、度可通過實驗確定。對多數蛋白質，當達到85%飽和度時，溶解度都小于 0.l mgL，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。調整硫酸銨溶液飽和度計算表鹽析方法：1）分步鹽析法(不同的鹽濃度)2）重復鹽析法高蛋白質濃度下共沉淀重復鹽析提高純度3）反抽提法(相同鹽濃度)2、鹽析方法和注意事項分級鹽析法不斷提高鹽濃度：不同蛋白質分級沉淀低飽和度：除雜蛋白，高飽和度：沉淀目的物血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出單酶鹽析曲線雙酶鹽析曲線反抽提法共沉淀較低濃度鹽溶液溶雜蛋白大腸桿菌RNA聚合酶的制備防止“局部過濃”：慢加，攪拌溫度：不宜過低，室溫1025C，易失

9、活：010C時間：沉淀需經一段老化時間（1小時）后分離注意事項：第二節 有機溶劑沉淀法一、基本原理二、影響沉淀效果的因素概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。有機溶劑對于許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。優點：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）溶劑易除去3）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；缺點：1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進行。3）成本高，需防火防爆總體來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。一、基本原理1、降低了介

10、質的介電常數，使溶質分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導致脫水凝集。 脫水作用比靜電作用強一些溶劑的介電常數 35二、影響沉淀效果的因素1.有機溶劑種類及用量能與水無限混溶介電常數小、沉淀強變性小毒性小，揮發性適中常用：乙醇、丙酮（揮發肝毒性著火點低）和甲醇（口服毒性） 介電常數：無水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒，常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；用量：（了解）2.pH的影響Pl附近、

11、穩定性控制溶液pH時務必使溶液中大多數蛋白質分子帶有相同電荷，勿使目的物與雜質帶異電荷導致共沉淀。嚴格控制低溫 有機溶劑與水混合時產生放熱反應預冷（有機溶劑-10以下，蛋白質0左右），在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃變性，并散熱。溫度影響有機溶劑對蛋白質的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。3.溫度低濃度緩沖液（0.01-0.05mol/L），0.2mol/L）：鹽溶，增大蛋白質在有機溶劑水溶液中的溶解度，會增加溶媒用量，沉淀物中可能夾帶鹽，需除鹽常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。 4.無機鹽的含量5.某些金屬離子的助沉淀作用Zn、Cu等與呈陰離子狀態的蛋白質

12、形成復合物，而活性不變，有助于沉淀，降低有機溶劑用量。胰島素精制：6.樣品濃度較?。喝軇┝?，收率，稀釋變性較高：共沉淀，分辨率，溶劑量，回收率，變性小蛋白質初濃度：0.5%2%粘多糖：12% 舉例：固體發酵生產-淀粉酶的提取工藝研究 -淀粉酶（米曲霉）菌體 + 水 過濾 水抽提清液 加乙醇（70%）攪拌 -淀粉酶 * pH影響 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 適宜的pH 5.6 6.0 * 溫度影響 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 適宜的溫度10 20 第三節 其它沉淀方法一、等電點沉淀二、成鹽沉淀法三、親和沉淀四、高分子聚合物沉淀法五、表面活性劑沉淀法一、等電點沉淀

13、法原理：Pl時分子表面靜電荷為零，雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用。主要：去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。二、成鹽沉淀法1.金屬離子沉淀所用的金屬離子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。 蛋白質和酶分子中因為含有羥基、氨基、咪唑基和硫氫基等，均可以和上述金屬離子作用形成鹽復合物。分離沉淀復合物分解除金屬離子（離子交換或金屬螯合劑EDTA）應用： 目的蛋白分離，去雜質缺點：有時復合物分解較困難，蛋白質易變性2.有機酸類復合鹽 含氮有機酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能夠與有機分

14、子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。 工業上用此法制備蛋白質時，需采取較溫和的條件，有時還加入一定的穩定劑，以防止蛋白質變性。單寧：結合后牢固，競爭結合法分解雷凡諾：不影響蛋白質活性三氯乙酸（TCA）：變性，除雜蛋白雷凡諾 豬心提取液 洗脫液 上清液 上清 細胞色素C 沉淀（去除）吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析三、親和沉淀法配基+可溶性載體偶聯成載體-配基復合物（親和沉淀劑）可選擇性地與蛋白質結合而沉淀出來它是利用蛋白質與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設計出來的一種特殊選擇性的分離技術。所以其沉淀原理不是依據蛋白質溶解度的差異，而是依據“

15、吸附”有特殊蛋白質的聚合物的溶解度的大小。親 和 沉 淀 過程親和過程提供了一個從復雜混合物中分離提取單一產品的有效方法。初始階段，將一個目標蛋白質與鍵合在可溶性載體上的親合配位體絡和形成沉淀；所得沉淀物用一種適當的緩沖溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質；用一種適當的試劑將目標蛋白質從配位體中離解出來。四、高分子聚合物沉淀法水溶性非離子型高分子聚合物能使蛋白質水合作用減弱而發生沉淀。PEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖雙水相或單高聚物其中應用最多的是聚乙二醇。無毒，對產品的影響小，但不易除去56五、表面活性劑沉淀法CTAB （十六烷基三甲基季胺溴化物） 、CPC (十六烷基氯化吡啶) ：沉淀

16、酸性多糖與多糖上的陰離子形成形成季銨絡合物，降低離子強度，絡合物析出。SDS：分離胰蛋白或核蛋白目的是使核酸和蛋白質分離，蛋白質變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。討論：咸鴨蛋煮熟了，蛋黃里會有油，這是什么緣故？熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達31，為什么看不到一點油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經?？梢钥吹近S色的油滴往外流？蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質，蛋白質就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質被鹽析出來，乳濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就互相聚集起來，變成大油液，使得整個蛋黃變成油滋滋的，甚至流

17、出油來了。第四節 結晶定義：溶液中的溶質在一定條件下因分子有規則的排列而結合成晶體。只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結晶過程有良好的選擇性。通過結晶，溶液中的大部分雜質會留在母液中，經過濾、洗滌可得到純度高的晶體。 一、結晶過程二、過飽和溶液的形成三、提高晶體質量的途徑飽和溶液：當溶液中溶質濃度等于該溶質在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；過飽和溶液：溶質濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；溶質只有在過飽和溶液中才能析出；一、結晶過程1.概念推動力：形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當溶質濃度超過飽和溶解度后，

18、才可能有晶體析出。晶核：最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。首先形成晶核，微小的晶核具有較大的溶解度。實質上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成溶解再形成的動態平衡之中，只有達到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩定存在。2.晶體的形成結晶是指溶質自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。條件：過程：形成過飽和溶液晶核形成晶體生長3.結晶曲線穩定態：不沉淀結晶亞穩定態：不自動生產結晶，加入晶體能誘導結晶?？刂茥l件，讓晶體緩慢長大。不穩定態：自動沉淀結晶，大量細小結晶結晶操作通常都在亞穩區中進行4.起晶方法自然起晶 把溶液蒸發濃縮至過飽和區（不穩定區），則有大量晶核自然形成。但晶核數量難以控制

19、，晶粒小。 刺激起晶把溶液蒸發至接近過飽和線后把溶液放出，使溶液突然冷卻，進入過飽和區形成大量晶核。當晶核達到一定數量后，回升溫度，使溶液進入介穩區，停止晶核產生，然后再慢慢冷卻，同時攪拌，使晶核長大。 晶種起晶將溶液濃縮到介穩定區的飽和濃度后，加入一定大小和數量的晶種，同時均勻攪拌，使晶體長大。優點：控制方便，產品晶體大小均勻。 二、過飽和溶液的形成（結晶方法）1.蒸發法蒸發除去部分溶劑，在常壓或減壓下加熱除去一部分溶劑，以達到或維持過飽和度。適用于小分子化合物的結晶，受熱變性的蛋白質或酶類不宜采用。2.溫度誘導法通過升高或降低溫度，使溶液逐漸達到飽和，可緩慢析出晶體。熱盒技術耐熱生化物質高

20、溫溶解溫度逐漸下降析出晶體3.鹽析結晶法固體鹽粉末、飽和鹽溶液（中性鹽）蛋白質及酶類藥物制備中常用方法4.透析結晶法72使溶解度的變化連續又緩慢5.有機溶劑結晶 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、異丙醇、乙腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。 蛋白質變性 溶劑回收6.等電點結晶7.微量擴散法通過氣相擴散使樣品中溶質達到飽和晶體8.化學反應結晶法調pH或加反應劑生成新物質結晶其實質是利用化學反應，對待結晶的物質進行修飾，一方面可以調節其溶解特性，同時也可以進行適當的保護；9.共沸蒸餾結晶共沸物的共沸點真空下共沸點真空低溫下進行共沸蒸餾結晶常多種方法綜合應用工業上通常希望得到粗大而均勻的晶體

21、，便于過濾與洗滌。晶體質量包括三個方面的內容：晶體大小、形狀和純度三、提高晶體質量的途徑1）過飽和度過飽和度值應大至使結晶操作控制在亞穩區內，又保持較高的晶體生長速率，使結晶高產而優質。2）溫度（緩慢冷卻）1.晶體大小 快速冷卻或蒸發 大量細小的晶體 緩慢冷卻或蒸發 大而均勻的晶體 3）攪拌速度：適當，不宜太快 攪拌的作用: 加速溶液的熱傳導，加快生產過程。 加速溶質擴散過程的速率，有利于晶體成長。 使溶液的溫度均勻，防止溶液局部濃度不均，結垢等。 使晶核散布均勻，防止晶體粘連在一起形成晶簇，降低產品質量。4）晶種：誘導結晶，控制晶體形狀大小均勻度2.晶體形狀晶體生長速度過飽和度溶劑pH： p

22、H的變化，可以改變溶質分子的帶電性質，是影響溶質分子溶解度的一個重要因素。一般結晶液所選用的pH 與沉淀大致相同。雜質3.晶體純度母液中的雜質晶體越細小，雜質越多洗滌有利提高純度結晶速度過快，易產生“晶蔟”，包含雜質 雜質對晶體的成長速率的影響較為復雜，有的雜質能抑制晶體的成長，有的能促進成長，有的能改變晶型。4.晶體結塊原因：粒度不齊、空氣濕度高、溫度高、受壓、貯存時間增長措施：控制粒度分布、良好外形、干燥密閉容器貯存5.重結晶晶體用合適溶劑溶解后再次結晶，提高純度用于生物物質重結晶的溶劑一般有蒸餾水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級醇等。結晶是分離純化蛋白質、酶等生化產品的一種有效手段。變性蛋

23、白質不能結晶，所以凡結晶狀態的蛋白質都能保持天然狀態。7/17/2022南京農業大學 生命科學學院847/17/202284南京農業大學 生命科學學院 谷氨酸結晶固相析出法的應用例1：尿激酶的沉淀分離尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸附法、層析法沉淀法：金屬離子形成復合鹽脫鹽鹽析Zn 離子沉淀尿激酶低濃度時，zn 能選擇沉淀尿激酶。在3mM可得85-92 回收率，而沉淀物的量并不多；加大Zn 濃度雖然能提高有限回收率，但沉淀物量大，純度降低。沉淀量酶活EDTA 溶出效應硫酸銨溶解尿激酶鋅絡合物硫酸銨的選用1)它在低濃度時可能有鹽溶作用，促進沉淀蛋 白溶解；2)因為本身有NH4+，與Zn 2+有絡合

24、作用，有 利于沉淀物溶解；3)硫酸銨為鹽析所用，在最終鹽析中，只需補 加規定量即可，而不引入其他成分。尿激酶鹽析沉淀沉淀量 回收率 純度例2：檸檬酸的生產檸檬酸是一種重要的有機酸，它在食品、醫藥、化工、皮革、環保等工業部門都有廣泛的用途。目前檸檬酸極大多數是通過微生物發酵法（黑曲霉）生產，提取工藝中，目前大多通過沉淀法制備（碳酸鈣沉淀及硫酸酸解）標準沉淀法回收檸檬酸流程圖加熱到70度pH1.82.0 過濾例3：胰蛋白酶的提取從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝胰蛋白酶原的溶解：酸性條件下穩定溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（pI10.8)濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析）溶解激活（酶原-酶）胰蛋白酶的進一步分離：酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同胰蛋白酶的提?。ǘ┮鹊鞍酌冈せ顬V餅溶解, 加入無水CaCl2,邊加邊攪拌,最終含有0.1M CaCl2；5MNaOH調pH至8.0,加極少量胰酶攪拌，于室溫下活化810小時； 活化完成，用2.5M H2SO4調pH至2.5-3.0，抽濾除去Ca