1、第七章基因構造與表達分析的根本戰略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes主講人：羅志勇 教授 1. DNA雙螺旋構造發現Watson Crick,1953概 論The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962Presentation Speech by Professor A. Engstrm Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your discovery of the molecular structure of the deoxyrib

2、onucleic acid, the substance carrying the heredity, is of utmost importance for our understanding of one of the most vital biological processes. Practically all the scientific disciplines in the life sciences have felt the great impact of your discovery. The formulation of double helical structure o

3、f the deoxyribonucleic acid with the specific pairing of the organic bases, opens the most spectacular possibilities for the unravelling of the details of the control and transfer of genetic information. Central Dogma2.中心法那么提出Crick，1958Crick,1916-2004反轉錄機制闡明 Temin 1970 補充的中心法那么中心法那么： 代表了大多數生物遺傳信息儲存和

4、表達的規律，奠定了從分子程度研討生命科學關鍵問題的實際根底。3.基因表達gene expression： 從DNA到蛋白質，經過轉錄和翻譯，用基因的遺傳信息在細胞內合成有功能意義的各種蛋白質。4.基因構造與表達分析技術： Northern blot Real -time RT PCR 基因芯片DNA序列分析 Southern blot FISHDNARNAWestern blot 蛋白質芯片蛋白質講授內容：()DNA序列分析()核酸分子雜交() 聚合酶鏈式反響() 基因芯片和微陣列 () Western免疫印跡一雙脫氧鏈末端終止法 (Sanger ,1977)二化學裂解法 (Maxam Gil

5、bert ,1977 )三DNA自動化序列分析一、DNA序列分析DNA測序技術根底： 高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE技術 PAGE能分別長度為300-500個堿基,差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。 (Sanger, UKMaxam Gilbert, USA)共同分享Nobel化學獎(1979)(一雙脫氧鏈末端終止法dideoxy chain termination 以DNA合成反響為根底。(Sanger) ATP、dATP和ddATP的構造ATPdATPddATP DNA合成反響摻入N個核苷酸摻入N+1個核

6、苷酸1. 雙脫氧末端終止法原理 DNA合成反響中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5-P端構成3，5-磷酸二酯鍵，導致DNA新鏈的延伸提早終止于ddNTP 。 末端終止部位DNA單鏈模板引物延伸的新合成鏈 摻入ddNTP2. DNA測序主要步驟 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 單鏈DNA模板的制備 DNA模板與測序引物退火 摻入法標志反響 延伸-終止反響 放射自顯影 閱讀測序結果測序步驟G反響管A反響管C反響管G反響管T反響管 G A T C 與末端終止法不同，化學降解法是建立在對原有DNA的化學降解過程根底上。 二化學裂解法 將待測DNA片段3或5端進展同位素標志，標志的DNA片

7、段分成四個反響，分別用不同的化學試劑處置，呵斥堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種堿基處斷裂。1.化學裂解法原理 化學降解G反響方式圖 硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet三DNA測序自動化原理 采用4種不同的熒光分別標志4種ddNTP終止反響產物，替代放射性同位素標志是實現DNA測序自動化的根底。1. DNA自動測序步驟： 4種帶有不同熒光染料標志的終止物ddNTPsSanger測序反響反響產物毛細管電泳分別 熒光信號采集、計算機分析與DNA自動排序。 激光激發不同大小DNA片段上的熒光分子，發射出四種不同波長的熒光2. DNA自動測序結果()核酸分子雜交Nucleic Acid Hy

8、bridization 細胞原位雜交Pardue et al， 1969) Southern印跡雜交: 檢測DNASouthern EM ，1975 Northern印跡雜交: 檢測RNAStark GR，1977核酸分子雜交技術的建立核酸分子雜交原理 標志的單鏈核酸探針與待檢測的靶單鏈DNA或RNA部分互補結合構成雜交雙鏈。 運用：核酸靶DNA或RNA序列的定性與定量分析。一、Southern印跡雜交(Southern blot hybridization) 將電泳分別的待測DNA片段結合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標志的核酸探針進展雜交的過程。 Paper TowelsSout

9、hern Blotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpinAgarose Gel Electrophoresis_+3二、Northern印跡雜交(Northern blot hybridization) 指將RNA變性及電泳分別后，并轉移到固相支持物上，用雜交反響來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 RNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S運用舉例GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 雜交分析mRNA的表達靶 mRNA三、其他雜交技

10、術(一)斑點雜交 (dot blot hybridization: 將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研討。二原位雜交in situ hybridization 用標志的核酸探針與組織切片或細胞中的待測核酸互補序列雜交，可對核酸進展定性、定位和相對定量分析。 三液相雜交 (solution hybridization) 1核酸酶S1 維護分析法 (nuclease S1 protection assay 單鏈DNA探針與待測RNA構成DNA/RNA雜交雙鏈，參與核酸酶S1專注性地降解未構成雜交體的DNA或RNA單鏈，DNA/RNA雜

11、交雙鏈那么遭到維護而不被降解。 2RNA酶維護分析法 RNase protection assay，RPARPA根本程序：待測RNA的分別體外轉錄標志RNA探針待測RNA與探針RNA進展液相雜交 RNA酶消化不同大小雜交片段凝膠電泳分別 3.抑制消減雜交原理suppression subtractive hybridization，SSH 以雜交為根底，并與PCR技術結合的cDNA消減雜交方法。 運用：差別表達新基因的挑選與克隆。SSH原理 cDNA Chip and Microarray () 基因芯片和微陣列 基因芯片上的陣列是由有規那么陳列的cDNA或寡核苷酸等樣本所組成的 。 基因表達

12、高通量分析法。DNA微陣列： cDNA微陣列cDNA microarray 寡核苷酸微陣列oligomicroarraycDNA微陣列: 在一微小的基片硅片等外表集成了大量分子識別探針，可以平行分析大量基因轉錄表達，因此又被稱為cDNA芯片。基因表達譜芯片主要技術流程：樣品熒光標志芯片制備 芯片雜交芯片洗滌和掃描 掃描圖像分析102核酸雜交技術和微陣列芯片克隆DNAcDNA標志陣列(Array,Macroarray)雜交、顯影高密度微陣列( Microarray )103CBACy5-標志cDNACy3-標志cDNACBACBACBACBACBACBA樣品1樣品2Cy5/Cy3熒光標志RNA提

13、取競爭性雜交顯示基因表達量差別二種樣品競爭性雜交表示圖基因表達譜芯片的原理104生物學問題提出，表達基因分析，樣本分類與實驗預測 .實驗設計基因芯片實驗圖象分析結果規范化基因表達譜芯片研討運用思緒105某些基因表達異常或存在差別生物學確證和解釋分析下一步實驗設計 cDNA芯片可定量監測大量基因表達水 平，論述基因功能，探求疾病緣由及 機制、發現診斷及治療靶基因等。cDNA芯片在醫學中的運用 Northern blot或RT-PCR驗證。 基因表達數據的生物信息學分析。() Western免疫印跡 Western blot原理與核酸分子雜交類似，只是以偶聯標志物的抗體分子作為探針，檢測轉移到固相

14、支持物上的蛋白質分子。Western blot程序： 蛋白質樣品制備 SDS分別 蛋白質轉膜 標志抗體與膜上蛋白質抗原雜交 檢測并分析標志物信號Western免疫印跡信號檢測原理 Luminol化學發光原理 另一種信號顯示方法是在洗去一抗后，參與堿性磷酸酶標志的二抗，再用BCIPNBT在膜上直接顯色。免疫沉淀技術 是一種抗原抗體反響技術，只是將抗體分子先結合到固相載體如磁珠上，然后與含目的蛋白的細胞裂解液進展液相雜交反響，利用磁場或離心等技術將結含在抗體上的蛋白質搜集起來，電泳分別，用于Western blot分析。() 聚合酶鏈式反響Polymerase Chain Reaction引言 P

15、CR技術發明1985，Mullis K. PCR及其相關技術開展速度驚人、 運用迅速廣泛分子生物學、醫學、生物學、考古學等學科領域 獲Nobel 化學獎1993， Mullis K. 講授內容提要:一、PCR技術原理二、耐熱DNA聚合酶三、PCR引物及設計原那么四、PCR條件的優化 五、PCR改良技術聚合酶鏈式反響(PCR) :一、PCR技術原理 Mullis K. 1985年發明的一種模擬天然DNA復制過程的核酸體外擴增技術。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 DNA復制半保管復制半不延續復制岡崎片段領頭鏈隨從鏈引物的化學本質是什么？單鏈寡核苷酸DNA或RN

16、A片段。DNA復制引物：單鏈RNA片段PCR引物： 單鏈DNA片段一PCR根本過程1. PCR循環由三步組成： 變性denaturation退火annealing延伸extensionPCR原理低溫退火高溫變性中溫延伸 在模板DNA、引物、4種dNTP存在條件下，依賴DNA 聚合酶催化一對引物間特異DNA片段合成的體外擴增技術。 2. PCR定義：3. PCR擴增終產物大小: 介于兩條退火引物5末端之間的雙鏈DNA片段。4.什么叫引物延伸產物？ 比兩引物限定區長的延伸產物。僅發生在以原始模板DNA為模板的擴增過程中，以倍數方式擴增(2n)。 Y=A1+En Y: 擴增產物的量 A: 最初靶DN

17、A分子數 E: PCR擴增效率 n: 循環次數5. PCR產量 當E100, A=1時 Y=2n 2n(引物延伸產物的量PCR thermal cyclerRotor-GenePCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析二平臺期與平臺效應1. 平臺效應plateau effect： PCR經過一定數量的循環后，DNA片段不再呈指數累積，而是進入靜止期即平臺期。PCR平臺效應2. 平臺期影響要素： 引物及dNTP底物濃度降低。 酶與模板比例下降。 實踐運用提示： 定量PCR應思索平臺期效應，選擇最適循環次數。二、耐熱DNA聚合酶三高保真的耐熱DNA聚合酶二Taq DNA聚合酶一PCR耐熱DNA聚合酶的發現一

18、PCR耐熱DNA聚合酶的發現 2.T4 與T7 DNA聚合酶:熱穩定性差。1. 大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段 ： 熱穩定性差，不耐高溫。 反響溫度偏低，產生非特異擴增。3.Taq DNA聚合酶:實現了PCR自動化二Taq DNA聚合酶 從嗜熱水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分別出來。 基因全長:2,496 bp 編碼蛋白質: 832個AA, 94 kd C端構造域: 53外切酶活性 N端構造域: 聚合酶活性HOOCNH21.較高的熱穩定性 95的半衰期: 40 min 最適溫度: 72 80 催化反響速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子Taq DNA聚合

19、酶特性： 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 逆轉錄酶活性； 較弱的非模板依賴性； 缺乏35外切酶活性。2. 無機離子及抑制劑 Taq DNA聚合酶的活性對Mg 2+ 濃度和單價離子K+或NH4+的性質和濃度較敏感。 最適Mg 2+濃度：2 mmol/L K+濃度：50 mmol/L3. 保真性DNA聚合酶35 外切酶活性核苷酸的錯誤摻入率T4 DNA聚合酶1/260 000T7 DNA聚合酶1/190 000Klenow片段1/140 000Taq DNA聚合酶1/41 000如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？ 運用Taq DNA聚合酶時，摻入少量具有35外切酶活性的耐熱DNA聚合酶,錯

20、配率可降為原來的1/10； 使四種dNTP底物濃度相等； MgCl2濃度盡能夠低； 減少循環數。三幾種高保真的耐熱DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶三、PCR引物及設計原那么一引物設計原那么二引物用量計算一引物設計原那么 引物序列及其與模板特異性結合是決議PCR反響結果的關鍵。1.引物設計原那么: 引物長度: 1030 Nt 堿基分布: A、T、G、C 隨機分布 G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物之間：防止3端互補 引物本身：不應構成二級構造引物5末端堿基:可不與模板 DNA互補 引物3末端堿基：最好

21、選T、 C、 G，不選A引物5端修飾技術附加核酸序列 用 途 限制酶位點 克隆如定向克隆噬菌體啟動子 合成RNA探針、測序蛋白質結合序列 產物純化、檢測核糖體結合序列 高效表達加錯配堿基呵斥突變 定點誘變2. 簡并引物degenerate primers: 針對某一基因編碼蛋白的氨基酸區域設計的一組堿基序列不同，但有一樣堿基數的寡核苷酸混合物。 簡并引物設計及運用： 對純化的未知蛋白測定一段短 氨基酸序列。 不同物種某一基因編碼的保守 氨基酸區域。運用：基于簡并引物PCR戰略克隆 新基因3.引物設計缺陷而引起的后果 4.優化的引物設計實例上游引物序列： 5GAGAACATGGTGCGCAGGT

22、T 3下游引物序列：5TGCCCATCATCATGACCTGG 35 CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGC

23、CGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG GGTCCAGTACTACTACCCGT AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCC 31 A260 oligo DNA33gN: 引物堿基數X：合成的oligo DNA A260單位Y：引物的pmol數 106 Ypmol= X33 330 . N X = 105 N (二) 引物用量計算四、PCR條件的優化(一) Taq DNA聚合酶濃度： 1.02.5 U/100 l反響液 (二) dNTP濃度：20200 mol/L (三) Mg2+濃度：0

24、.52.5 mmol/L (四) 引物濃度：0.10.5 mol/LPCR運用舉例遺傳病診斷：鐮狀細胞貧血 6 Glu Val (GAG GUG) PCR擴增6 DNA區域傳染病診斷：HBV和HIV腫瘤分子標志診斷: bcr-abl PML/RAR個體識別: 親子鑒定與刑事偵破生物考古五、PCR改良技術一RT-PCR (reverse transcription PCR) 以mRNA為模板逆轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進展PCR反響。RT-PCR原理逆轉錄酶 AMVavian myeloblastosis virus 酶活性最適溫度42 MMLVMoloney murine leuk

25、emia virus：最適溫度37 二 定量RT-PCRQRT-PCRPCR擴增指數期內極小的擴增效率改動會極大地影響產量。1. 半定量RT-PCR 以樣本mRNA為模板逆轉錄合成cDNA，在不同引物對引導下共同PCR擴增“看家基因和目的基因cDNA 。 選擇內對照基因 組織中普遍表達、表達量比較恒定的“看家基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。 半定量規范 計算PCR 產物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA RT-PCR驗證G-Rh2誘導TNFmRNA表達上調25mol/L G-Rh2 12 h 24 h 48 h 72 h + + + + TNFGAPDH 舉例2. Real-time RT-PCR原理： PCR體系參與一種雙色熒光標志的寡核苷酸探針，根據探針上熒光信號的變化，計算模板DNA的含量。 實時PCR運用：用于基因DNA拷貝數和mRNA表達定量分析。定量檢測PCR產物的指示系統: TaqMan和Molecular Beacon，均依賴熒光共振能量轉移fluorescence resonance energy transfer，FRET。 TaqMan Probe 寡核苷酸探針的5端標志一個報告熒光染料reporter fluorescence dye，3端標志一個淬滅染料quencher dye。 當光