1、 第四章 細胞電活動 興奮： 生物組織可以對外界刺激（機械，溫度，電，化學）發生反應，當刺激達到一定閾值時，生物組織發生反應，這一過程稱為興奮。 1 在神經，肌肉等細胞中，這種能力高度發展，所以稱為可興奮細胞。主要表現是對外界刺激的反應是細胞膜的電位發生快速的改變。 其它組織細胞也可以對外界刺激發生反應，但主要表現不是細胞膜電位的變化，一般稱為非興奮性細胞。 區別：膜電位的變化如:神經，肌肉，感受器等可興奮細胞。2 4.1 膜的電學特性 膜是由脂類物質構成的，脂類物質在電學上近乎絕緣；但蛋白質組分特性、構象及膜上位置變化，造成膜兩側某種特定導電狀態。 對于生物膜組織有跨膜的電阻Rm和跨膜的電容

2、Cm。3 可興奮細胞Rm隨膜興奮狀態(通道蛋白狀態)而變化，而Cm則變化不明顯。一. 一小段膜的等效電路圖：RmCm4rorororiririrmrmrmrmCmCmCmCm 長柱形細胞，如神經軸突和肌纖維細胞，其長度遠大于細胞直徑，可用電纜模型描述。5CmgKEKgClgNaEClENa胞外胞內6 4.2 靜息電位 （Resting Potential, RP） 細胞在沒有受到刺激（靜息）的狀態下，跨細胞膜的電位。7一. 檢測靜息電位的實驗來源：槍烏賊的巨軸突，直徑為1mm， 可在肉眼下觀察和操作。采用微電極技術89高阻抗前置放大器示波器3M KClAg-AgCl2 3 m細胞微電極記錄：1

3、0靜息電位： 細胞在靜息狀態下，細胞膜內外兩側存在電位差，外側為+，內側為-，這一外正內負的電位差稱為靜息電位。 幾乎所有的細胞（可興奮和非興奮細胞）都存在靜息電位，但不同細胞的靜息電位的大小有差別。 神經細胞：-60 -70mV 心肌細胞：-90mV 紅細胞 ： -10mV 一般來說，可興奮細胞靜息電位較大，非興奮細胞靜息電位較小。11 1. 離子在膜的內外兩側分布不平衡 在細胞內液和外液中，有Na+、K+、Cl-、Ca+等各種離子和一些帶電荷的蛋白質分子，一般細胞內液和外液中各自正負電荷是相等的，但同一離子在細胞內外液中濃度卻相差很大。 細胞整體表現為電中性的。二.靜息電位的離子基礎12細

4、胞內細胞外K+Na+Cl-K+Na+Cl-人紅細胞13613835164154胃腸平滑肌細胞16222405.9137134蛙骨骼及細胞1551244145120槍烏賊軸突3694439134985202.三種主要離子的跨膜分布 K+ Na+ Cl-133.形成跨膜離子分布不平衡的成因14三.離子平衡電位1.在簡單理想的狀態下的離子平衡電位分析K+ 假設胞內有兩種離子K+、P-組成， K+可透過細胞膜， P-不能透過細胞膜。15P-P-P-P-P-P-P-P-P-P-K+K+K+K+K+K+K+K+K+K+P-P-P-P-P-P-P-P-P-P-K+K+K+K+K+K+K+K+K+K+E16

5、化學梯度的存在， K+可細胞外流動。當K+出去后，形成電場，電場方向，阻止K+出來。 K+移動受到兩個作用: 化學勢和電位勢。 當化學勢和電位勢平衡后， K+停止流動，此時為K的平衡電位。172. 離子的電化學勢計算： = 0 + RTlnCK+ + ZF電位勢化學濃度勢標準狀態下 的化學勢R:氣體常數；T：溫度；CK+：離子濃度 Z：電荷數，價；F：法拉第常數；：電位18i= 00+RTlnK+i+ZFi= 0+RTlnK+o+ZFo = i -o=(RT/ZF)ln(K+o/ K+i) 計算離子跨膜電位差(離子平衡電位）的Nernst方程： = (RT/ZF)ln(K+o/ K+i)離子跨

6、膜運輸達到平衡時，兩側的電化學勢相等：19對鉀離子： = (RT/ZF)ln(K+o/ K+i) =2.303 (RT/ZF)log (K+o/ K+i) =(58/Z) log (K+o/ K+i) = -58 log (K+i/ K+o)K+: about 70 mV； Na+: 40-60 mVCl-: -20 mV； Ca2+: more than 100mV20 3.建立這一電位需要多少離子跨膜？建立-70mv的跨膜電位需多少K+流出？K+的跨膜轉運是否會影響細胞內外K+的濃度？ 21根據Faraday定律 n=Q/(ZF)=CV/(ZF) 槍烏賊巨軸突，直徑1mm， 膜電容1F/c

7、m2， K+的平衡電位是-70mV， n=10-60.07/96500=7.25 10-13mol/cm2 7.25 10-13mol/cm2的K+ 跨膜移動，形成-70mV的膜電位，1cm2內K+的數量為3 10-5mol，所以基上不影響離子的濃度。22細胞內細胞外K+Na+Cl-K+Na+Cl-人紅細胞13613835164154胃腸平滑肌細胞16222405.9137134蛙骨骼及細胞1551244145120槍烏賊軸突369443913498520四. 在實際條件下的細胞靜息電位 細胞內外各種離子的濃度23 不同離子的平衡電位是不同的，而細胞的靜息電位由跨膜分布的各種離子共同決定的（幾

8、種離子的加合作用），并與細胞膜對各種不同離子通透性有關。K+: about 70 mV； Na+: 40-60 mVCl-: -20 mV； Ca2+: more than 100mV 通透性大的離子對細胞 靜息電位的貢獻大。24細胞膜對各種離子滲透能力不同： PK : Pna : PCl=1.0 : 0.04 : 0.45 細胞靜息電位由跨膜分布的離子共同決定，并與其通透性有關系，通透性大的離子對靜息電位的貢獻大。25 對某一離子是平衡電位，對細胞是靜息電位。26五.Goldman-Hodgkin-Kalz方程 計算細胞靜息電位的方程 1.問題的提出： K+平衡電位約70mV，細胞靜息電位-

9、70mV左右,K+平衡電位是否決定細胞靜息電位？ （ K+的通透性最高）PK : Pna : PCl=1.0 : 0.04 : 0.4527K+平衡電位細胞外K+濃度膜靜息電位證實：實驗：改變細胞外K+濃度，觀察跨膜電位差 的變化。28當K+o高時，實測膜電位與Nernst公式計算值近似。當K+o低時，實測膜電位與Nernst公式計算值相差 較大，原因是忽略了Na+、Cl-對膜電位的影響。29 2. 所有離子的流動達到平衡，形成靜息電位。 將可擴散的離子K+、Na+、Cl- 的電化學勢和通 透性考慮在內，經過繁瑣的推導，得到 Goldman-Hodgkin-Kalz方程： （用于計算細胞的跨膜

10、電位,即靜息電位）30六.靜息電位的生理意義1.與膜的興奮性有關, 膜的興奮性與靜息電位與閾電位的差值有關。2.是一種能量儲備形式 通過鈉泵的活動，維持膜內外鉀、鈉、氯離子的不對稱分布，形成膜電位，是一種勢能儲備。在此基礎上爆發的動作電位，鈉離子擴散的能量來源于勢能的儲備。3.維持興奮的不衰減性 興奮由局部電流激發,但興奮發生的能量來自儲備的勢能。只要膜電位相等，興奮的傳導就不會率減。31七.考慮膜電位，膜上不同離子的電導，修正 后膜的等效電路CmgKEKgClgNaECENa胞外胞內1.加入離子的平衡電位E2.電導g表示各種離子的通透性32 4.3 動作電位（ActionPotential,

11、AP） 細胞在受到刺激后，產生的細胞膜的電位的變化。33高阻抗前置放大器示波器微分器記錄儀刺激器隔離器一. 動作電位的檢測34脈沖電刺激35二. 動作電位1.動作電位各部分的名稱： 去極化 復極化 超極化 超射 閾電壓 閾強度3637“全” 或 “無” 要么有AP，要么無AP。不衰減性傳導 同一細胞，AP的形狀和幅值是固定的、不變的，不隨刺激強度和傳導距離而變，即AP與細胞本身和狀態有關，與刺激無關。脈沖式 由于不應期的存在，使連續多個動作電位不會融合，兩個動作電位間總有一定間隔。2. 動作電位的特點38三.動作電位的成因-Na學說1.第一個問題提出：動作電位是怎樣產生的?2.第二個問題提出：

12、膜對離子的通道性是增加? 減少?3.第三個問題提出：對哪種離子的通透性增加?39問：動作電位是怎樣產生的?答：動作電位是細胞受到刺激時產生的電位變化。問：電位的變化是怎樣形成的？答：電位的變化必然有電流的形成，由于電流的存在導致電位的變化。問：跨膜電流怎樣形成的？答：靜息時，離子跨膜流動達到平衡，動作電位時，膜對離子的通透性不同于靜息狀態。40問：對哪種離子的通透性增加? K+ ? Na+ ? Cl- ?問：膜對離子的通道性是增加?減少?答：測量膜電阻，動作電位時，膜電阻降低，對離子的通透性增加。41 CmgKEKgClgNaEClENa胞外胞內42根據Goldman-Hodgkin-Kalz

13、方程： 跨膜電位與離子的通透性關系，通透性最大的離子對膜電位的決定性最大。（膜電位趨向通透性最大的那種離子的平衡電位）43 若PK，則K； K = -70mv-80mv 若PNa，則Na； Na = 40mv 50mv 若PCl，則Cl； Cl = -20mv 動作電位形成超射時，0mV, 而只有Na0，故去極化極有可能是Na+通透性增加引起的。 這種觀點叫動作電位的Na+學說。444.如何通過實驗來證明動作電位的Na+學說？實驗： 改變骨骼肌細胞、神經細胞等內、外的Na+濃度，觀察動作電位變化。45改變細胞內外的Na+濃度 （1）去除胞外Na+ (用其他物質來維持滲透壓） （2）逐漸增加細胞

14、外的Na+濃度，但低于正常值 （3）細胞外的Na+，高于正常值 （4）增加胞內Na+ （直接注入Na+）胞外Na+0正常水平（1） （2）（3）46改變細胞內外的Na+ 濃度 （1）去除胞外Na+ (用其他物質來維持滲透壓） 可維持細胞的靜息電位，卻形不成動作電位 （2）逐漸增加細胞外的Na+濃度，但低于正常值 動作電位逐漸產生，但幅值低于正常水平 （3）細胞外的Na+濃度，高于正常值 動作電位高于正常水平 （4）增加胞內Na+濃度(細胞內外濃度梯度下降） 動作電位幅值降低47control, 2. low Na+ concentration, 3. Return to control Na+

15、 concentration48 從以上實驗說明：細胞內外Na+變化時，對動作電位影響極大，所以動作電位時，Na+通透性增加。 K決定細胞膜的靜息電位，Na+變化影響動作電位的變化。49 靜息時，PK:PNa:PCl=1.0 : 0.04 : 0.45 去極化時，PK:PNa:PCl=1.0 : 20 : 0.45 膜對Na+的通透性明顯增加，所以一次動作電位時，膜電位Na（膜電位趨于通透性最大的那種離子的平衡電位）測量靜息電位和動作電位時離子的通透性：505.動作電位的形成過程: 外界刺激細胞膜的gNa，實際上是Na+開放的過程。開始時Na+內流膜去極化，膜電位從-70mV-60mV，到一定

16、程度，觸發gNa迅速，使Na+快速內流，形成去極化。 動作電位的形成是正反饋的過程，所以計算某一電位下Na+內流情況很難。514.4 電壓鉗技術和膜片鉗技術voltage clamp and patch clamp techniques52一.背景 生物科學的發展常常是技術方法的進步所推動的 1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和 Sakmann發明膜片鉗技術 Patch clamp techniques 給電生理學、細胞生物學的發展乃至整個生物學帶 來一場革命 對離子通道的功能及細胞功能的調控研究起巨大推 動作用53Patch clampErwin NeherBert Sakman

17、n Neher和Sakmann獲得1991年度的諾貝爾生理學與醫學獎 54二.電壓鉗(voltage clamp)技術電壓鉗技術是通過向細胞內注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產生的離子流，從而將?在某一數值。 由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反，因而它可以反映?的大小和方向。55比較器放大器指令電壓測量電流發生器56Voltage Clamp 電壓鉗技術57鉗住電壓測電流 負反饋系統 在雙電極電壓鉗記錄中，一根電極用于監測細胞膜電位，另外一根電極用于注射電流;在單電極電壓鉗記錄中，監測電壓與注射電流都采用同一根電極。1950年，Hodgkin(霍奇金 )、Huxley(赫胥黎

18、)等人創造性地運用了電壓鉗位技術，研究了槍烏賊軸突膜上的鈉、鉀電流，并提出了H-H方程。 1963年度諾貝爾醫學生理學獎 58雙電極電壓鉗 59三. 膜片鉗技術 Patch clamp techniques 1.原理膜片鉗技術鉗制的是“膜片”采用尖端經過處理的微電極與細胞膜發生緊密接觸，使尖端下的這片細胞膜在電學上與其他細胞膜分離大大降低了背景噪聲；使單通道微弱的電流得以分辨出來得益于特殊設計的低噪聲膜片鉗放大器60三.膜片鉗技術1.膜片鉗61Inside CellExtracellular62 一種記錄通過離子通道微小電流的技術。用微電極來接觸細胞膜。用1010 以上的大阻抗使電極的尖端開口

19、處和細胞膜“封接”（與周圍絕緣）。在此基礎上，固定膜電位，測量該膜片上離子通道的離子電流(pA級) 。63642.膜片鉗技術的基本操作過程將玻璃微電極(直徑通常為1-5m) 輕輕地接觸在細胞膜表面給尖端施加負壓，在玻璃電極壁 與膜之間形成緊密接觸高阻封接 Gigaohm seal 電阻達101065離子不能從玻璃電極尖端與膜 之間通過，只能從膜上的離子通道進出回撤電極，細胞膜被撕下一片記錄小片膜的跨膜離子電流若膜上只有一個離子通道單通道電流一般：一至幾個通道不等66673.膜片鉗技術的基本記錄模式細胞吸附記錄模式(cell-attached patch) 內面向外記錄模式(inside-out

20、 patch) 外面向外記錄模式(outside-out patch) 全細胞記錄模式(whole-cell recording) 前三種為單通道記錄模式 6869內面向外記錄模式外面向外記錄模式全細胞記錄模式細胞吸附記錄模式7071727374四.膜片鉗實驗所記錄到的電流 單通道電流75 全細胞電流76777879808182CmgKEKgClgNaECENa胞外胞內從膜的等效電路考慮：83 膜電壓從65mV（靜息電位）突然去極化到 10mV，得到總電流 I。 膜電壓從65mV（靜息電位）去極化到10mV， 溶液中去除了Na+，記錄IK。 膜電壓從65mV（靜息電位）去極化到10mV， 阻斷K+，記錄Ina。 分析總電流的組成成分：記錄總電流：84結果：65mV10mVIIKINa0電容放電的電流85電壓鉗實驗所記錄到的電流： 電容放電電流 內向電流:流入細胞 外向電