1、基因重組Chapter35 DNA的重組Genetic recombination DNA重組的幾種類型及其主要特點 了解Holliday模型 細菌基因轉移的幾種方式 轉座重組及其生物學意義DNA重組基因重組、遺傳重組 genetic recombination 基因重排 gene rearrangenment DNA分子內或分子間遺傳信息的重新組合 DNA片段在細胞內、細胞間，甚至在不同物種之間進展交換，交換后的片段依然具有復制和表達的功能 意義：迅速添加群體遺傳多樣性、區分有利、不利突變、 經過優化組合積累有意義的遺傳信息 參與許多重要的生物學過程 438頁 自然界基因轉移、重組：基因變異

2、、物種進化的根底繁衍、病毒感染、基因表達、癌基因激活等過程中起重要的作用一、DNA的重組的分類 同源重組homologous recombination 特異位點重組site-specific 轉座重組transpositional 二、同源重組 兩條同源區的DNA分子，經過配對、鏈的斷裂和再銜接 產生片段交換crossing over的過程 普通性重組general recombination兩個染色體或DNA分子相互交換對等部分的過程 雙倍體真核生物：減數分裂，非姐妹染色單體交換相對應的區域，產生的單倍體配子包含父母本兩方的遺傳信息 一Holliday模型 遺傳重組的分子根底1、Holli

3、day 構造 4條單鏈構成Holliday構造 2、關鍵步驟 1兩個同源染色體DNA陳列整齊 2DNA的一條鏈切斷并與另一個DNA對 應的鏈銜接3經過分支挪動產生異源雙鏈DNA 4Holliday中間體切開并修復，構成兩 個雙鏈重組體DNA Meselson M Radding C修正雙鏈斷裂啟動重組啟動減數分裂 3、功能： 1維持種群的遺傳多樣性 2有助于DNA的損傷修復 3真核生物減數分裂中染色體正確分別到子細胞(二) 細菌的基因轉移與重組 1、結協作用conjugation結協作用：質粒DNA從一個細胞細菌轉移至另一個細胞 致育因子F因子經過結協作用由F+細胞向F-細胞轉移，F質粒約1/

4、3的基因與轉移有關，traS和traT基因編碼外表排斥蛋白，阻止F+細胞之間的轉移，F+細胞的性菌毛與F-細胞結合后收縮，使二者接近，TraD蛋白構成轉移的通道，在TraI在TraY的協助下結合到轉移起點oriT上，切開一條鏈，使其5端進入受體細胞，并合成其互補鏈，使F-細胞轉化為F+細胞，給體細胞中的單鏈也可以合成互補鏈。 當細胞與細胞、或細菌經過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞細菌轉移至另一細胞細菌的DNA轉移稱為 在細菌基因轉移的不同時間將配對細胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質粒DNA可以經過重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組Hrf)菌株，假設F質粒的DNA未能

5、完好地進入受體菌，那么受體菌不能轉化為F+, F質粒的DNA可以被切割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F因子， F因子攜帶的基因可在受體菌表達。大腸桿菌染色體的基因圖自然條件下感受態的構成需求10多種蛋白質參與 經過自動獲取或人為地供應外源DNA，使細胞或培育的受體細胞獲得新的遺傳表型的過程轉化2、轉化 transformation實驗室：高濃度的Ca2+處置使細菌構成感受態普遍性轉導：宿主菌恣意部位的基因取代噬菌體DNA的一 部分轉入受體菌3、轉導作用 transduction經過噬菌體將細菌基因從供體菌轉移到受體菌限制性轉導：宿主整合部位的DNA取代噬菌體的部分 DNA 進入受體

6、菌的基因與染色體重組噬菌體的基因重組 當病毒從被感染的細胞供體釋放出來，再次感染另一細胞受體時，發生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組4、細胞交融細胞質膜交融導致基因轉移、重組實驗室：溶菌酶除細菌細胞壁，人工促使原生質體交融，引 起廣泛的重組。RecA蛋白：多功能蛋白1.NTP酶活性：存在單鏈DNA時， RecA具水解ATP/dATP活性，促 進聯會2.單鏈DNA結合活性：RecA蛋白與單鏈DNA構成絲狀復合物，使 其免受核酸酶攻擊3.DNA解旋活性：單鏈切口處解開雙螺旋4. DNA分子間聯會:部分單鏈DNA區(三) 重組有關的酶 溶解酶Resolvase活性斷裂Holliday構

7、造的交聯橋，完成重組RecBCD：依賴RecBCD起始的重組模型: RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內切酶和解螺旋酶活性，當DNA斷裂時，它結合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶挪動到chi位點GCTGGTGG)，在其3側4-6核苷酸處將鏈切斷，產生3游離單鏈，隨后單鏈與RecA結合，開場同源區重組。RecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用RecA蛋白的帶狀圖解 RecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個RecA蛋白單體構成，其中一個單體由紅色標出。RecA蛋白引起DNA同源重組的模型 在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。 a RuvA四聚體的圖解。四個亞

8、基構成的構造像四個花瓣的花。 b RuvA/RuvB的作用： 左RuvA四聚體結合到Holliday位點； 中RuvB六聚體結合到雜合雙螺旋的兩對面，DNA穿過其中心， RuvB六聚體的作用像馬達，促進超螺旋分叉點經過復合體挪動。 右RuvC結合到Holliday位點，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體識別。 c RuvA四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，紅色表示負電荷，留意正電荷位于四聚體的外表，有四個負電荷區域位于其中心。 d 假設的RuvA四聚體與Holliday位點結合的構造模型。三、特異位點重組 原核生物中，有時基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯會，重組只限于該小范圍內，只涉

9、及特定位點的同源區，這類重組稱作 由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發生的整合1、噬菌體DNA的整合與切除 噬菌體的整合酶識別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點，而后發生的選擇性整合 經過attP和attB間的相互重組，環狀的噬菌體DNA轉換為整合的原噬菌體，原噬菌體經過attL和attR間的相互重組而切除2、細菌的特異位點重組沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達的調控3、免疫球蛋白基因的重組IgG的分子構造12345重組位點有7和9nt的信號序列,中間間隔12或23bp。免疫球蛋白基因重組的模型重組酶RAC1/RAC2)復合體與重組信號序列結合復合體使編碼序列與重組信號序列之間的雙連斷裂，編碼

10、序列的末端構成發夾構造。重組信號序列結合構成環狀構造。編碼序列銜接前經過加工，銜接位點不非常確定，添加了免疫球蛋白的多樣性。DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA銜接酶參與了加工和銜接過程。9堿基序列7堿基序列在不同的核苷酸位點重組可以生成不同的蛋白質四、轉座重組transposition McClintock的重要發現1950，麥克林托克，玉米籽粒顏色遺傳，存在著一種轉座因子transposable elements控制籽粒顏色，這些因子可在染色體上挪動，控制著某些基因表達70年代，夏皮羅Shapiro，E. coli乳糖支配子突變株，進展雜交分析，確認轉座子的存在。 存在于染色體DN

11、A上可自主復制和位移的根本單位稱為轉座子 大多數基因在基因組內的位置是固定的 有些基因可以從一個位置挪動到另一位置 可挪動的 DNA序列包括插入序列和轉座子由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座子移位：導致DNA鏈的斷裂/重接 or某些基因啟動/封鎖。引起：a.插入突變； b.產生新的基因； c.染色體畸變； d.生物進化，遺傳效應。轉座子：原、真核細胞 與同源染色體重組相比，轉座子作用頻率低得多，構建突變體有重要意義 插入序列轉座插入序列insertion sequences，IS：7501500bp反向反復序列：941bp，位于兩側轉座酶編碼基因：產物引起轉座，位于中間正向反復序列

12、：412bp，位于反向反復序列外側 插入序列特有組成：保守性轉座：從原位遷至新位復制性轉座：插入序列復制后，一個復制本遷到新 位，另一個保管在原位方式 轉座子轉座轉座子transposons：可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散反復序列組成 反向反復序列 轉座酶基因 特殊基因：如抗生素抗性基因等 轉座子具有反向末端反復序列以及在靶部位兩側產生的同向反復序列。在該例中靶序列為5bp，轉座子末端由9bp反向反復序列組成，數字1-9指序列反復堿基對。*兩側正向反復*末端反向反復*(一) 細菌的轉座因子1.插入因子2.組合型轉座子：兩個插入序列之間夾著一段序列如抗性基因。兩個插入序列可以同向或反向陳

13、列，有時均有轉座活性，有時只需一個有轉座活性。3.復合型轉座子：插入序列被轉座酶基因取代，圖示為Tn3(TnA家族的構造。兩端為38bp的反向反復，其兩側為5bp的靶序列，tnpA編碼轉座酶，tnpR編碼的蛋白質可以作為解離酶使轉座子與受體DNA構成的共整合體重組和解離，也可以作為阻遏蛋白調理tnpA和tnpR兩個基因的表達，res為解離的控制位點，TnpR蛋白結合于其上發揚調控作用。4.轉座的方式轉座子可用不同的方式轉座，轉座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、反復、缺失、倒位、易位等變化。兩個IS10組件構成一個復合轉座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當Tn10是一個

14、小的圓形分子的一部分時，IS10反復序列可轉座至環狀分子的任一側。 插入序列使靶序列的數量添加，在插入序列兩側各有一個。復制轉座作用產生了轉座子的一個拷貝，它插入到一個接受位點。給予位點堅持不變，給予者和接受者都有轉座子的一個拷貝。 非復制轉座作用在未被修復的情況下，能夠呵斥致死突變。 保守的轉座作用不呵斥核苷酸的喪失，如噬菌體的整合和切除。 轉座子引起DNA的重排，正向反復序列的重組引起其間序列的切除或插入。 反向反復序列的重組能引起其間序列反向陳列。 轉座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉座子拷貝數的添加(二) 真核生物的轉座因子 原核生物的轉座酶主要作用于產生它的轉座因子，表現

15、出順式顯性。真核生物的轉座酶可以作用于任何末端具有該酶所識別的反向反復順序的DNA,使其轉移到相應的靶位點。 在玉米的激活-解離系統activator-dissociation system, Ac-Ds)中，Ac編碼轉座酶(自主因子)，Ds非自主因子是Ac不同程度的缺失中間序列構成的，無轉座酶活性，但隨Ac轉座后可抑制臨近基因的表達。 在玉米的抑制-促進-增變系統suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En加強子序列類似，均為自主因子，與其對應的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉座后，假設Smp插入靶基因附近的適宜部位，可以促進靶位點基因的表達，假

16、設Smp插入外顯子，可抑制基因的表達。玉米的控制元件構成轉座子的不同家族，每個家族均有自主和非自主成員。P品系的果蠅含有40-50個P因子一種轉座子， P因子的mRNA前體含有3個內含子，假設P品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細胞mRNA前體加工時保管了第3個內含子，合成阻遏蛋白，不發生轉座，性細胞mRNA前體加工時切除了全部3個內含子，活潑的轉座使性細胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時，由于雌性的卵細胞質中存在抑制P因子轉座酶活性的蛋白質，子代的生殖功能正常。四、真核生物基因表達的轉錄前調控 1.染色體喪失:如四膜蟲的大核為營養核，由小核發育而來，約10%的DNA在發育過程中被喪失

17、。 2.基因擴增：如非洲爪蟾卵母細胞的rDNA可以大量擴增，構成1000個以上的核仁。 3.基因重排:重排可以使表達的基因發生切換，也可以產生新的基因。 4.組蛋白的乙酰化和去乙酰化：組蛋白的乙酰化和基因表達的形狀相關。組蛋白H4的乙酰化缺乏(underacetylation)是雌性哺乳動物一條X染色體失活的緣由之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有關。 5.染色體DNA的修飾和異染色質化：DNA的甲基化可以使其失去轉錄活性，高度甲基化的DNA可以構成高度緊縮的異染色質，異染色質的基因無轉錄活性。6.染色質構造改動模型-組蛋白置換 占先模型(pre-emptive model)：決議的要素是轉錄因子

18、和組蛋白誰先占據調控位點。DNA復制時，組蛋白8聚體解離，轉錄因子乘機結合到調控位點上，不斷繼續到下一個復制周期，抑制了組蛋白和DNA的結合。 例1：當5S rRNA基因與組蛋白結合時TFA不能激活此基因。而TFA可與游離的5S rRNA基因結合，再參與組蛋白不能使此基因失活。 例2：含腺病毒啟動子的質粒能被TFD結合，再被RNA pol轉錄，如先參與組蛋白，那么不起始轉錄，如先參與TFD那么構成的染色質中，模板仍轉錄。 動態模型(dynamic model) ：組蛋白置換需輸入能量。一些轉錄因子結合DNA時可裂解核小體，或建立一個可產生核小體定位結合位點的邊境。假設蠅Hsp70啟動子上的核小

19、體在體外實行重建。GAGA(細胞核結合蛋白)轉錄因子與啟動子中4個富含(CT)n位點結合，破壞了核小體，構成一高敏感區，而且導致鄰接的核小體重排，這樣它們就優先插入到隨機位點。核小體翻開的過程是需求水解ATP的耗能過程。7.細胞周期的調控 最關鍵的是兩個蛋白質家族：周期素cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶cyclin-depending protein kinase, CDK)家族,目前發現的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示， CDK有8種以上，用CDK1，CDK2，CDK3等表示。周期素AD, CDK2,CDK4的合成受轉錄因子E2F的調理，共同控制G1期向S期的轉化，周期素A、B與CDK2的結合對有絲分裂的啟動是必要的。 新合成的促細胞分裂周期素與CDK結合，構成促M期因子(M-phase promoting factor, MPF)，活化的CDK使本身的Y15和T161先后被磷酸化，隨后細胞周期基因cell-d