1、臨床基因擴增實驗室質量保證西安友誼醫學檢驗所 王洋核酸實驗室工作要求及流程1、設施與環境： 由于基因擴增檢驗對靶核酸有一個指數擴增過程,因而有大量的擴 增產物的出現，這種產物極易對以后新的擴增反應產生“污染”，為防止這種污染的發生，就需要對實驗室進行嚴格分區。2、人員： 必須經過培訓并取得上崗證。3、設備、標本、耗材、記錄的管理 四個方面闡述 一、測定前的標本采集處理二、測定中的核酸提取三、擴增和產物分析四、測定后的結果報告 測定前的標本采集標本的采集 臨床PCR實驗室對各種臨床標本的收集都建立了標準操體程序（SOP）。標本的采集、運送和保存對檢驗結果往往有決定性的影響，因此，為保證得到高質量

2、的檢驗結果，必須有一個規范的臨床標本采集、運送和保存的程序。 測定前的標本采集常用于基因擴增檢測的臨床標本包括：1、EDTA或枸椽酸鈉抗凝全血或骨髓2、血清或血漿3、尿液、乳汁、組織4、咽拭子、生殖道拭子及分泌物等。測定前的標本采集二、影響標本采集的因素1、標本采集的時間2、標本采集部位3、標本采集的類型和采集量4、采樣質量的評價5、采樣及運輸容器6、標本采集中的防污染測定前的標本采集采集時間標本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結果。當病原體感染機體后，特定的臨床標本中，病原體含量能達到PCR檢出水平的點，并不能覆蓋整個感染過程，可能只是在感染或疾病發生發展過程中的某一個時間段。如：呼吸道冠狀

3、病毒，感染發病后3-4d，即可出現于上或下呼吸道標本中，在10-13天，在尿液和糞便中出現的濃度最高，而在血液中，則不但存在時間短，而且濃度低。又如：HBV、HCV和HIV感染等，機體感染后，在特定抗原和抗體出現以前，血循環中即可有較高的病原體存在，而當抗體出現后，病原體的濃度在不同的患者不同的感染階段有可能是不一樣的，有的可能會低于特定PCR方法的測定下限。測定前的標本采集標本采集部位、類型和采集量1、在臨床靜脈血液標本的采集上，一般不會出現對結果影響很大的情況。但在泌尿生殖道分泌物及咽拭子標本的采集上，如果采集不當，可能有相當一部分結果出現假陰性。2、類型與采集量應根據所測病原體而定。3、

4、標本量的大小對測定非常重要。標本量大會使外源非相關DNA增多，有可能會影響測定的敏感性。測定前的標本采集采樣及運輸容器標本的采集材料如棉簽、拭子等均為一次性使用，運輸容器應為密閉的一次性無菌裝置，采樣所用的防腐劑及相關試劑材料不應對核酸擴增及檢測過程造成干擾。如：PCR不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除，故應盡量避免使用。測定前的標本采集采樣質量的評價、血清（漿）標本可觀察標本是否溶血、脂血及其程度；（血紅素及其代謝產物、脂類等對PCR有抑制作用）、分泌物標本，則可從細胞組成，所需類型細胞的數量等方面進行評價。如：分泌物標本，則可以鏡下觀察是否有

5、上皮細胞存在； 痰標本如果白細胞數量極少，則并沒有采集到真正的痰測定前的標本采集標本采集中的防污染1、最好采用一次性無菌及無核酸酶的材料，不用處理便可直接使用，采集中要特別注意防止混入操作者的頭發、表皮細胞、痰液等。2、如使用玻璃器皿，必須經0.1%DEPC水處理后高壓。以使可能存在的RNase失活。總而言之，標本的收集及適當的預處理，對于用于PCR測定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。測定前的標本采集三、標本運送與保存：標本一經采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。、DNA的標本，如是在無菌條件下采集，則可以在室溫下運送，建議采集后，在8h之內送實驗室；（不能及時送實驗室之前，均應暫放在2

6、-8臨時保存）、RNA的標本，短時間內的運送如10min左右，則可室溫下運送，如為較長時間，則應在加冰條件下運送。（血標本必須在抽血后2小時分離血清，以免RNA的降解。最理想是存放在-70）標本的接收1、核對檢驗單的一般信息：姓名、性別等2、按檢測項目驗證標本類型：例：CMV：EDTA抗凝血、尿液、母乳或咽拭子；3、標本狀態檢查；4、標本唯一性標識的確認：例：090909B01表示HBV-DNA在2009年9月9日的第1號標本。標本的拒收1、標本的拒收條件：標本血量不足（全血2ml），標本管破裂、姓名等與申請單不相符，使用肝素抗凝的標本，標本采集后送檢時間超過2小時、且未低溫保存者2、拒收程序

7、填寫相關的記錄表、告之相關科室、人員重采標本常見標本的處理與保存一、血清（漿）標本1、HBV-DNA樣本處理與保存：可按照一般的血清標本處理程序，對測定影響不大。2、HCV-RNA樣本處理與保存：血清標本則需盡快（2h內）分離血清，EDTA抗凝的全血標本在6h內分離血漿，血清（漿）從采血管中取出，另管保存。血清（漿）的分離應在生物安全柜中進行，生物安全柜在使用前應進行清潔消毒程序，并紫外線照射20min以上，吸取血清（漿）的吸頭須為無菌和無RNase的帶濾芯的吸頭，所用容器可為一次性無菌離心管。標本短期（1-2周）可保存在-20下，較長期應保存在-70 下。常見標本的處理與保存二、巨細胞病毒標

8、本可用于檢測的臨床標本有血液、尿液、母乳、支氣管洗液、咽拭子等。血液：采抗凝血（EDTA）2-5ml，用淋巴細胞分離液進行外周單個核細胞制備。尿液：最好是第1次晨尿（5-10ml），1500r/min離心5min，取中上層尿液至EP管中，72h內檢測放2-5。咽拭子：用無菌的一次性拭子采集，加入1-2ml無菌生理鹽水浸泡5-10min,振蕩后將棉拭子擠干，然后把洗液移至1.5mlEP管中， 72h內檢測放2-5。應盡可能在發病初期采集上述標本，越早越好。（發病初期，病毒含量高，檢測檢出率高）母乳：取樣10ml， 1500r/min離心5min，離心后小心吸取中下層至EP管（注意避免沾入上層脂肪

9、）， 72h內檢測放2-5。常見標本的處理與保存三、EB病毒-DNA常用于EB病毒PCR檢測的標本可有鼻咽分泌物、外周血、尿液的上皮脫落細胞等。血液：采抗凝血（EDTA）2-5ml，用淋巴細胞分離液進行外周單個核細胞制備。鼻咽拭子：用無菌的一次性拭子采集，加入1-2ml無菌生理鹽水浸泡5-10min,振蕩后將棉拭子擠干，然后把洗液移至1.5mlEP管中， 72h內檢測放2-5。其它體液：可按水樣標本的方式離心取沉淀用作提取核酸。常見標本的處理與保存四、性病類（HPV-DNA、HSV-DNA）使用一次性無菌拭子采樣，加入1-2ml無菌生理鹽水浸泡5-10min,振蕩后將棉拭子擠干，然后把洗液移至

10、1.5mlEP管中， 72h內檢測放2-5。如標本為EP管采樣，直接存放于2-5冰箱五、肺炎支原體-DNA咽拭子：與CMV-DNA同樣處理肺泡灌洗液：1500r/min離心10min，去上清待檢樣本在-20保存不超過24h。測定前質量控制實驗室的環境要求：1、實驗室的各個區域必須是相互獨立的；2、各區的儀器設備及各種物品必須是專用的；3、各區間不能直通，應有緩沖間，供換工作服及鞋子用；4、進入各個工作區必須遵循嚴格的順序，只能按單一方向進行，即從試劑準備區標本制備區擴增間擴增產物分析區；5、產物分析區應安裝排風扇或其它抽風裝置。測定前質量控制儀器設備管理：1、儀器應有定期的維護和校準，使其能處

11、于一個良好的狀態。如：為保證加樣準確，加樣器應保持足夠的準確度和精密度，并定期校準。2、實驗用的消耗品也要達到相應的要求。例如：離心管：如果含有PCR擴增抑制物，用其提取的核酸標本有可能會出現假陰性結果或定量結果偏低。帶濾心吸頭：能阻止吸樣時所產生的氣溶膠對加樣器頭部的污染，進而造成標本間的交叉污染。測定前質量控制實驗室的日常工作核查：尤其要注意避免實驗室的污染，污染的概念有二： 通常的空氣中的灰塵、細菌和標本的濺出等污染； 以前擴增產物的遺留污染。前者可依靠日常的清潔工作即可做到，后者除了對實驗室空間的分區處，嚴格的實驗室管理和對實驗操作的嚴格要求也是必不可少的。測定前質量控制理想的試劑所使

12、用的PCR試劑盒的質量對測定結果的影響是直接而又極為關鍵。1、內在因素：標本處理（核酸提取）方法、用于核酸擴增的原材料及方法學設計。2、外在因素：試劑盒出廠以后，在運輸和運輸中的貯存、實驗室的貯存等諸環節，任一環節的不當，均會影響試劑盒的臨床使用質量。測定中的核酸提取核酸提取是決定擴增檢測的關鍵性步驟。通常，核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物的來源可見于標本本身（如血紅素或降解產物）或核酸提取過程中殘留的有機溶劑（如酚、氯仿等），這些物質對其后的酶反應步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。測定中的核酸提取1、標本制備最好是在生物安全柜內進行，可防止標本氣溶膠的擴散。

13、氣溶膠：是分散在氣體介質中的微粒 。2、在實驗操作過程中，手套要經常更換，因手套的污染很容易導致標本間的交叉污染。如：在打開及蓋裝有核酸模板樣本的離心管時，手套指尖很容易污染，造成交叉污染。3、在核酸提取中要加入有效性的質控。如：弱陽性質控、陰性質控、室間質控等。擴增及產物分析一、嚴格遵守商品試劑盒確定的條件進行擴增；二、通過標準曲線對未知模板進行定量分析：1、根據試劑盒要求先確定基本的基線和域值；2、初步分析未知模板的定量結果，根據當時曲線的情況，可適當調整域值3、查看此次實驗結果的斜率、截距、r值是否在合理范圍，查看空白管、弱陽性管、質控管結果是否在預知范圍，如結果都在控，結果可報。基本概

14、念1、線性基線期：為PCR擴增最初的10-15個循環,此時,PCR反應處于起始階段,擴增產物很少,所產生的熒光信號很低。2、指數期：PCR達到其最大的擴增階段，理想條件下，每一循環后，PCR產物倍比增加。3、Ct值：指的是實時監測擴增過程的熒光信號達到指數擴增時的循環周期數。4、標準曲線：使用一系列稀釋的已知濃度的標準品與臨床標本同時進行測定,待測標本的濃度則可根據其測定的Ct值,從標準曲線計算得到其濃度。基本概念域值：為了便于對所檢測樣本進行比較，在PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號（ba

15、seline），熒光域值的缺省設置是315個循環的熒光信號的標準偏差的10倍 。擴增效率E：指的是一個循環后的產物增加量與這個循環的模板量的比值，其值位于0-1。在PCR的前20或30個循環中，E值比較恒定，為指數擴增期，隨后E值逐步降低，直至0，此時PCR達到平臺期，不再擴增。質控物使用的功能弱陽性質控樣本最常見的失控原因：1、核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。2、儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內溫度與所示溫度的不一致性等。3、試劑的問題。如Taq酶和/或反轉錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。質控物使用

16、的功能陰性原血清質控樣本的功能：1、監測實驗室的以前擴增產物的“污染”；2、由實驗操作所致的標本間的交叉污染；強陽性標本氣溶膠經加樣器所致的污染強陽性標本經操作者的手所致的污染使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開3、擴增反應試劑的污染 陰性質控檢測如為陽性，說明上述3外環節中有可能一個或幾個問題存在，但并不能區別究竟在哪點上發生了污染，所以在實驗中帶入一個空白管。質控物使用的功能空白管的功能：1、反應液空白管1：可監測試劑是否受“污染”。2、試劑空白管2：在整個實驗過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區域內30-60min，然后進行擴增，如出現陽性，在反應液管1為陰性的情況下，提示可

17、能存在有實驗室污染。定量PCR檢測結果分析及解釋如何分析患者測定結果模向分析：主要是與相關檢測指標的一致性，HBV-DNA與乙肝“兩對半”；HCV-RNA與抗-HCV、HCV-核心抗原等。縱向分析：患者以往相同項目的檢測結果定量PCR檢測結果分析及解釋有典型擴增曲線但很弱陽性樣本弱陽性樣本的重復檢測簡單重復：把低值的標本再做一次原因探討性重復：加大樣本量重做一次如何判斷乙肝患者抗病毒治療療效？當一個HBV-DNAPCR定量檢驗結果為7.2E+08IU/ml的乙肝患者，在抗病毒藥物如拉米夫啶或干擾素治療，兩周后，再檢測，如結果為5.2E+08IU/ml，再兩周后，結果為9.0E+08IU/ml，抗病毒治療有效嗎？如何判斷乙肝患者抗病毒治療療效血清（漿）HBV-DNA濃度與傳染性強弱的問題109拷貝/ml，日常生活密切接觸強傳染性。 105 106拷貝/ml，日常生活密切接觸傳染性小。 105 拷貝/ml，日常生活密切接觸幾乎沒有什么傳染性危險性。但不管HB