1、2012年09月13日發布2013年XX月XX日第1次修訂2014年xx月xx日實施醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明GuidanceontheApplicationofAccreditationCriteriafortheMedicalLaboratoryQualityandCompetenceintheFieldofMolecularDiagnostics（征求意見稿）中國合格評定國家認可委員會CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發布2013年XX月XX日第1次修訂2014年xx月xx日實施*/1前言本文件由中國合格評定國家認可委員會（CNAS）

2、制定，是CNAS根據分子診斷領域的特性而對CNAS-CL02：2012醫學實驗室質量和能力認可準則所作的進一步說明，并不增加或減少該準則的要求。本文件與CNAS-CL02：2012醫學實驗室質量和能力認可準則同時使用。在結構編排上，本文件章、節的條款號和條款名稱均采用CNAS-CL02：2012中章、節條款號和名稱，對CNAS-CL02：2012應用說明的具體內容在對應條款后給出。本文件的附錄A、B為規范性附錄。附錄的序號及內容與CNAS-CL02:2012不對應。本文件于2012年制定，本次為第1次修訂換版。CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發布2013年XX月X

3、X日第1次修訂2014年xx月xx日實施醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明1范圍本文件規定了CNAS對分子診斷領域的認可要求，包括：病原體核酸和人體基因等領域涉及的核酸擴增試驗、雜交試驗（包括解剖病理中的原位雜交試驗）、核酸電泳分析等。注：“分子診斷”包括檢驗醫學領域的“分子檢驗”以及病理學檢查領域的“分子病理”。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2006臨床實驗室定量測定室內質量控制指南CNAS-RL02能力驗證規則CNSA-C

4、L31內部校準要求臨床技術操作規范病理學分冊，人民軍醫出版社，2004醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則病理科建設與管理指南（試行），衛辦醫政發200931號術語和定義管理要求4.1組織和管理責任實驗室為獨立法人單位的，應有醫療機構執業許可；實驗室為非獨立法人單位的，其所屬醫療機構執業證書的診療科目中應有醫學實驗室，自獲準執業之日起開展醫學檢驗/病理工作至少2年。技術負責人應具有副高以上醫學專業技術職務任職資格，從事醫學檢驗/病理工作至少5年。質量管理體系文件控制服務協議受委托實驗室的檢驗CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發布2013年XX月XX日第1次修訂20

5、14年xx月xx日實施4.6外部服務和供應4.7咨詢服務4.8投訴的解決4.9不符合的識別和控制4.10糾正措施4.11預防措施4.12持續改進4.13記錄控制4.14評估和審核4.15管理評審技術要求5.1人員實驗室負責人應具有醫學專業本科以上學歷，副高以上專業技術職稱、從事分子檢驗/分子病理工作至少3年。臨床基因擴增檢驗實驗室操作人員應經過有資質的培訓機構培訓合格取得上崗證后方可上崗。簽發分子病理報告的醫師應具有中級以上病理學專業技術職務任職資格，并有從事分子病理工作經歷。認可的授權簽字人應至少具有中級以上專業技術職務任職資格，從事申請認可授權簽字領域專業技術工作至少3年以上。實驗室的檢驗

6、/檢查人員至少應有2名。應每年評估員工的工作能力。對新進員工在最初6個月內應至少進行2次能力評審，保存評估記錄。當職責變更時，或離崗6個月以上再上崗時，或政策、程序、技術有變更時，應對員工進行再培訓和再評估。沒有通過評估的人員應經再培訓和再評估，合格后才可繼續上崗，并記錄。5.2設施和環境條件應實施安全風險評估，并制定針對性的防護措施及合適的警告。臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分四個獨立的工作區域：試劑貯存和準備區；樣品制備區；擴增區；擴增產物分析區。如使用自動分析儀（擴增產物閉管檢測），擴增區和擴增產物分析區可合并。上述每個區域應有充分空間以保證：（a）樣品處置符合分析前、后樣品分區放置；（b

7、）儀器放置符合維修和操作要求；（c）樣品制備區放置生物安全柜、離心機和冰箱等儀器設備；（d）打印檢驗報告時交叉污染的控制。工作區域應符合如下要求：（a）應有限制進入實驗區的標志和措施；（b）非本實驗室工作人員，未經許可不得接觸到患者樣品、信息等資源；（c）實驗室各分區應配置固定和移動紫外線燈，波長為254nm，照射時離實驗臺的高度一般為6090cm；擴增儀配備不間斷電源；（d）各區應有信息通訊聯系手段，便于在緊急情況下與外面的聯系；（e）樣品制備區應配置二級生物安全柜和洗眼器，實驗室附近應有噴淋裝置。所有分子病理實驗室均應設置獨立的標本前處理區，包括切片區和脫蠟區，用于組織切片、脫蠟、水化、染

8、色等。脫蠟、水化及染色應在通風設施中進行。應有足夠的、溫度適宜的儲存空間（如冰箱），用以保存臨床樣品和試劑，設置目標溫度和允許范圍，并記錄。實驗室應有溫度失控時的處理措施并記錄。不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。工作結束后應立即對工作區進行清潔，必要時進行消毒及去污染。應依據所用分析設備和實驗過程對環境溫、濕度的要求，制定溫濕度控制要求并記錄，應有溫度失控時的處理措施并記錄。應依據用途（如：RNA檢測用水），制定適宜的水質標準（如：應除RNase）,并定期檢測。分子檢驗各工作區域應有明確的標記。進入各工作區域應按照單一方向進行，即試劑貯存和準備區-樣品制備區-擴增區-擴增產物

9、分析區。不同的工作區域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不應將工作服帶出。實驗室設備、試劑和耗材5.3.1.1如從事RNA的檢測，應配備一70C的冷凍設備和高速冷凍離心機。標本制備區使用的一次性加樣器吸頭應帶有濾芯。PCR試驗用容器應可密閉。不同工作區域內的設備、物品不能混用。分子病理實驗室標本前處理區的設備應包括切片機、裱片機、切片刀及防樣品交叉污染的消毒用具、紫外燈、電熱恒溫箱、脫蠟缸、水化缸及HE染色缸。應按國家法規要求對強檢設備進行檢定。應進行外部校準的設備，如果符合檢測目的和要求，可按制造商校準程序進行。應至少對分析設備的加樣系統、檢測系統和溫控系統進行校

10、準。分析設備和輔助設備的內部校準應符合CNAS-CL31內部校準要求。應定期對PCR儀、加樣器、溫度計、恒溫設備和離心機進行校準。設備故障修復后，應首先分析故障原因，如果設備故障影響了方法學性能，可通過以下合適的方式進行相關的檢測、驗證（適用于定量項目）：（a）校準的項目實施校準；（b）質控物檢驗；（c）與其他儀器或方法比對，偏差符合附錄A.3的要求；（d）以前檢驗過的樣品再檢驗，偏差符合附錄A.5的要求。5.3.2.1實驗室應建立試劑和關鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗收程序，相應程序中應有明確的判斷符合性的方法和質量標準（宜參考附錄A）。實驗室應對新批號或同一批號不同貨運號的試劑和關鍵

11、耗材進行驗收，驗收試驗至少應包括：（a）外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性、有效期等；（b）性能驗證：通過實驗才能判斷的，如試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率、試劑的批間差異、關鍵耗材的抑制物等：試劑性能驗證記錄應能反映該批試劑的核酸提取效率和核酸擴增效率。一般情況下，臨床實驗室采用新批號試劑或關鍵耗材檢測5份過去用舊試劑或關鍵耗材檢測過的患者樣品進行驗證，符合附錄A.6要求即可視為滿足要求。但當實驗室懷疑提取試劑有質量問題時，可采用凝膠電泳試驗比較核酸提取物與核酸標準物確認核酸片段提取的完整性、260nm紫外波長測定確認核酸提取的產率、260nm/280nm比值確認核酸提取的純度。核酸擴增效

12、率可通過計算標準曲線的斜率（slope）獲得，實驗室可參照供應商提供的斜率范圍來評價該批試劑的符合性。用于定性檢驗的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進行試劑批號驗證。用于定量檢驗的試劑，應進行新舊試劑批間的差異驗證，方法和要求參照附錄A.6要求。耗材的抑制物驗收：對關鍵耗材應檢測是否存在核酸擴增的抑制物，方法和要求參照附錄A.6要求。檢驗前過程應規定分子檢驗樣品留取的具體要求，如：（a）使用無DNase和RNase的一次性密閉容器；（b）正確使用抗凝管：一般全血和骨髓樣品應進行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時除外）；（c）用于RNA（如H

13、CVRNA）擴增檢測的血樣品宜進行抗凝處理，并盡快分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜盡快分離血清。（d）分泌物、拭子、腫瘤組織等樣品留取的注意事項等。核酸應盡快處置并儲存，以便盡可能減少降解。超長期儲存后的標本，使用前應再次評估標本的完整性。e）基于組織/細胞學形態基礎的檢測項目應由具有病理診斷資質的醫師確認樣品是否滿足檢測要求。分子病理檢測樣品若為組織，應采用10%中性緩沖的福爾馬林固定，固定液的量和固定時間應符合檢測要求。5.5檢驗過程定量檢測方法和程序的分析性能驗證內容至少應包括正確度、精密度、可報告范圍等。定性檢測項目驗證內容至少應包括檢出限及符合率等。驗證結果應經過授

14、權人審核。應使用通過驗證的核酸抽提和純化的試驗方法，在需要時進行核酸的定量。對產前檢驗，在完成分子診斷前應保留備份培養物并跟蹤監測實驗的準確性；在檢驗胎兒標本前，應檢驗父母一方或雙方的突變狀態，宜由同一實驗室檢驗；如有足夠的標本，應從兩份不同標本中提取DNA進行雙份檢驗。實驗室應了解檢驗方法受母體細胞存在污染的影響，應有程序評估并減少這種影響。應有明確和統一的原位雜交（ISH）陽性信號的標準，并建立本實驗室的陽性閾值。組織病理ISH，應結合組織形態進行結果判讀，并采用國際通用的評分標準。檢驗結果質量的保證5.6.2.1總則應制定室內質量控制程序，可參照GB/T20468-2006臨床實驗室定量

15、測定室內質量控制指南。質量控制程序中應有針對核酸檢測防污染的具體措施。應保留DNA質量評價記錄。需要時，應對RNA的質量進行評價，并選擇合適的“看家”mRNA作為內對照以評價RNA的完整性，并保留RNA質量評價記錄及假陰性率監測記錄。對于需要進行DNA抽提的石蠟包埋樣品，應從組織形態學對腫瘤細胞數量進行評價。病理醫師除了要明確組織樣品中是否存在腫瘤細胞，還應明確組織樣品中腫瘤細胞的數量是否達到后續分子檢測所需的最低標準。當分子診斷結果與臨床和其他實驗室結果不符時，應記錄并分析原因，適當時采取糾正措施。質控物分子檢驗定性檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和陽性質控物。分子病理定性檢測項目，每次

16、實驗應設置陰性和陽性質控物。質控數據質控規則應確保試驗的穩定性和檢驗結果的可靠性。定量檢測項目質控圖應包括質控結果、質控物名稱、濃度、批號和有效期、質控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標識、方法學名稱、檢驗項目名稱、試劑和校準物批號、每個數據點的日期和時間、干擾行為的記錄、質控人員及審核人員的簽字、失控時的分析處理程序和糾正措施等。定性檢測項目：陰陽性符合預期。563.1應按照CNAS-RL02能力驗證規則的要求參加相應的能力驗證/室間質評。應保留參加能力驗證/室間質評的結果和證書。實驗室負責人或指定負責人應監控室間質量評價活動的結果，并在結果報告上簽字。通過與其他實驗室（如已獲認可的

17、實驗室、使用相同檢測方法的實驗室、使用配套系統的實驗室）比對的方式確定檢驗結果的可接受性時，應滿足如下要求：（a）規定比對實驗室的選擇原則；（b）樣品數量：至少5份，包括正常和異常水平；（c）頻率：至少每年2次；（d）判定標準：應有80%的結果滿足要求。實驗室使用兩套及以上檢測系統檢測同一項目時，應有比對數據表明其檢測結果的一致性，比對頻次每年至少2次，每次不少于20份樣品，濃度水平覆蓋測量范圍；比對結果的系統偏倚應符合附錄A.4的要求。使用不同生物參考區間的檢測系統間不宜進行比對。比對記錄應由實驗室負責人審核并簽字，并應保留至少2年。5.7檢驗后過程檢驗結果報告后，原始樣品、核酸提取物以及核

18、酸擴增產物均應保存至少1個月。為便于追溯，凝膠圖像和斑點雜交條帶應作為技術記錄保存，保存期限參照相關行業要求。結果報告5.8.1應在規定時限內報告每一項分子診斷學檢驗結果。基于組織/細胞形態學的分子病理檢查結果應由病理醫師負責結果判讀和簽發報告。應實施雙簽名。對于產前及產后診斷先天性疾病，檢驗結果應由有資質的病理學家或由有臨床背景的經適當培訓且有實驗室經驗的人員報告。對于臨床微生物學和傳染病學，以下檢驗結果應當由有資質的經過適當的培訓且有實驗室經驗的臨床微生物學專家報告：a.艾滋病毒：核酸擴增檢驗，病毒載量，抗病毒耐藥類型；b.HCV：核酸擴增檢測，病毒載量；c.乙肝病毒：病毒載量、抗病毒耐藥

19、類型；d.SARS冠狀病毒：核酸擴增試驗；e.除季節性流感（H1N1和H3N2）以外的甲型流感病毒：核酸擴增試驗；f.所有來自中樞神經系統標本的核酸擴增檢測。應該注意的是，僅用定性的分子檢測結果用于艾滋病毒、乙肝病毒和丙肝病毒感染的臨床診療是不夠的。實驗室應提醒醫生，在開始任何決定性的治療方案前需要考慮選做其他參數如血清學調查結果和臨床特征。結果發布實驗室信息管理CNAS-CL36:2012第 頁共9頁2012年09月13日發布2013年XX月XX日第1次修訂2014年xx月xx日實施附錄A（規范性附錄）分子診斷項目分析性能標準A.1應不低于國家標準、行業標準、地方法規要求。A.2自建檢測系統不精密度要求：以能力驗證/室間質評評價界限（靶值0.4對數值）作為允許總誤差（TEa）,重復性精密度v3/5TEa；中間精密度4/5TEa。A.3設備故障修復后，分析系統比對：5份樣品，覆蓋測量區間，至少4份樣品測量