1、實驗01 植物細胞滲透勢的測定植物細胞的滲透勢主要取決于細胞液的溶質濃度，因此又稱溶質勢。已知在干旱、鹽漬等條件下，一些植物常在細胞內主動積累溶質，以降低其滲透勢，增加吸水能力，而在一定程度上維持膨壓，保障細胞的生長和氣孔的開放，這種現象叫做滲透調節作用。滲透調節能力的大小可以用逆境條件下細胞滲透勢的降低值來表示，在水分生理與抗性生理研究中經常需要測定。以下介紹兩種測定方法。一、質壁分離法測定植物細胞的滲透勢【原理】將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經過一段時間，植物細胞與蔗糖溶液間將達到滲透平衡狀態。如果在某一溶液中細胞脫水達到平衡時剛好處于臨界質壁分離狀態，則細胞的壓力勢p下降為零

2、。此時細胞液的滲透勢s等于外液的滲透勢s0，即s=s0，此溶液稱為該組織的等滲溶液，其濃度稱為該組織的等滲濃度，因此，只要測出植物組織的等滲濃度，即可計算出細胞液的滲透勢s。實際測定時，由于臨界質壁分離狀態難以在顯微鏡下直接觀察到，故一般均以初始質壁分離作為判斷等滲濃度的標準。處于初始質壁分離狀態的細胞體積，比吸水飽和時略小，故細胞液濃縮而滲透勢略低于吸水飽和時的滲透勢，此種狀態下的滲透勢稱基態滲透勢。【儀器與用具】顯微鏡1臺；載玻片與蓋玻片各若干；溫度計1支；尖頭鑷子1把；刀片1片；小培養皿（直徑6cm）9套；試劑瓶若干；燒杯、容量瓶、量筒、吸管等；吸水紙適量。【試劑】1mol/kg H2O

3、蔗糖溶液 稱取預先在6080下烘干的蔗糖34.2g溶于100g蒸餾水中，即為1質量摩爾濃度蔗糖溶液。蔗糖系列標準液 取干燥潔凈的小試劑瓶9支編號，用1mol/kg H2O蔗糖溶液依C1V1=C2V2公式配制0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70mol/kg H2O等一系列不同濃度的蔗糖溶液（具體范圍可根據材料不同而加以調整），貯于試劑瓶中，瓶口加塞以防蒸發濃縮。0.03%中性紅溶液。【方法】1選大蔥或洋蔥鱗莖內表皮、小麥葉片等作實驗材料。2取干燥潔凈的培養皿9套編號，將配制好的不同濃度蔗糖溶液按順序加入各培養皿中使成一薄層，蓋好培養皿蓋備用。3

4、用鑷子剝取供試材料下表皮或用刀片小心刮取小麥葉片上表皮（參考實驗1），大小以0.5cm2為宜。吸去切片表面水分，立即浸入不同濃度的蔗糖溶液中，每一濃度45片。為便于觀察，可先將切片于0.03%中性紅內染色5min左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不加染色即能區別質壁分離時，仍以不染色為宜。4切片在蔗糖溶液中浸泡2030min，同時記錄室溫，取出放在載玻片上，滴一滴相同濃度的糖液，蓋好蓋玻片，顯微鏡下觀察確定引起50%以上細胞發生初始質壁分離（即原生質體剛從細胞壁的角隅分離）的濃度，每片觀察的細胞不應少于100個，觀察要迅速。如果在兩個相鄰濃度的切片中，一個沒有發生質壁分離或質壁分離的細胞不

5、足50%，另一個發生質壁分離的細胞數超過50%，則可粗略地將這兩個濃度的平均值作為其等滲濃度，也可用插值法更準確地確定等滲濃度。檢查時可先從中間濃度開始。5由所得到的等滲濃度和測定的室溫，可用下式計算細胞液的滲透勢（s）：s =iCRT式中各參數的意義見實驗5（植物組織水勢的測定）。6也可用CaCl2或NaCl代替蔗糖，但須改變式中等滲系數。CaCl2的i值可用2.6，NaCl一般為1.8（見附錄四）。7試比較不同植物材料的滲透勢，把結果列于表6-1：表6-1 測定植物組織滲透勢記載表蔗糖克分子濃度（M）滲透勢（巴）質壁分離的相對程度（作圖表示）0.700.650.600.550.50.450

6、.400.350.30【思考題】1配制蔗糖溶液時為何用質量摩爾濃度（mol/kg H2O）而不用容積摩爾濃度mol/L？2某植物葉片吸水飽和時的滲透勢經測定為-0.8MPa，又用質壁分離法測出其滲透勢為-0.9MPa，請計算質壁分離狀態的細胞液體積相當于飽和時的百分數。實驗02 植物的無土培養和缺素癥狀植物正常生長發育需要多種礦質元素。但要確定各種元素是否為植物所必需，必需借助無土培養法（溶液培養和砂基培養法）才能解決。近年來，無土栽培不僅作為一種研究手段，而且成為新的生產方式，在蔬菜、花卉生產中開始大規模應用。本實驗學習溶液培養的技術，并證明氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵諸元素對植物生長發育的重要性

7、。【原理】用植物必需的礦質元素按一定比例配成培養液來培養植物，可使植物正常生長發育，如缺少某一必需元素，則會表現出缺素癥；將所缺元素加入培養液中，缺素癥狀又可逐漸消失。【儀器與用具】25ml和500ml燒杯各1個；吸量管1ml 1支，5ml 10支；1000ml 量筒1個；培養瓶（可用1000ml塑料廣口瓶或瓷質、玻璃質培養缸）個；黑色蠟光紙適量；塑料紗網紗布（15cm15cm）1塊；精密p試紙（p56）或廣泛p指示劑；搪瓷盤（帶蓋）個；石英砂適量；陶質花盆個；500ml試劑瓶11個。【試劑】表11-1 大量元素貯備液配制表營養鹽濃度（g/L）Ca(NO3)24H2O236.0KNO3102.

8、0MgSO47H2O98.0KH2PO427.0K2SO488.0CaCl2111.0NaH2PO424.0NaNO3170.0Na2SO421.0EDTA-FeEDTA-Na7.45FeSO47H2O5.57硝酸鉀；硫酸鎂；磷酸二氫鉀；硫酸鉀；硫酸鈉；磷酸二氫鈉；硝酸鈉；硝酸鈣；氯化鈣；硫酸亞鐵；硼酸；氯化錳；硫酸銅；硫酸鋅；鉬酸；鹽酸；乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na）。以上試劑均需分析純。【方法】1.精選高活力玉米（或番茄、向日葵）種子為試驗材料。2.培苗：用搪瓷盤裝入一定量的石英砂或潔凈的河沙，將已浸種一夜的玉米（或番茄）等種子均勻地排列在砂面上，再覆蓋一層石英砂，保持濕潤，然后放置在溫

9、暖處發芽。第一片真葉完全展開后，選擇生長一致的幼苗，小心地移植到各種缺素培養液中。移植時注意勿損傷根系。3.配制大量元素及鐵貯備液：用蒸餾水按表11-1配制。微量元素貯備液按以下配方配制：稱取H3BO4 2.86g，MnCl24H2O 1.81g，CuSO45H2O 0.08g，ZnSO47H2O 0.22g，H2MoO4H2O 0.09g，溶于1L蒸餾水中。表11-2 完全培養液和各種缺素培養液配制表貯備液每100ml培養液中各種貯備液的用量(ml)完全缺N缺P缺K缺Ca缺Mg缺FeCa(NO3)20.5-0.50.5-0.50.5KNO30.5-0.5-0.50.50.5MgSO40.50

10、.50.50.50.5-0.5KH2PO40.50.5-0.50.50.5K2SO4-0.50.1-CaCl2-0.5-NaH2PO4-0.5-NaNO3-0.50.5-Na2SO4-0.5-EDTA-Fe0.50.50.50.50.50.5-微量元素0.10.10.10.10.10.10.1配好以上貯備液后，再按表11-2配成完全培養液或缺乏某元素的培養液（用蒸餾水）。（調節pH至5.55.8）。4.取7個1000毫升塑料廣口瓶，分別裝入配制的完全培養液及各種缺素培養液900ml，貼上標簽，寫明日期。然后把各瓶用黑色蠟光紙或黑紙包起來（黑面向里），或用報紙包三層，用0.3mm的橡膠墊做成瓶蓋

11、，并用打孔器在瓶蓋中間打一圓孔，把選好的植株去掉胚乳，并用棉花纏裹住莖基部，小心地通過圓孔固定在瓶蓋上，使整個根系浸入培養液中，裝好后將培養瓶放在陽光充足、溫度適宜（2025）的地方，培養34周。5.實驗開始后每兩天觀察一次，并用精密pH試紙檢查培養液的pH值，如高于6，應用稀鹽酸調整到56之間。為了使根系氧氣充足，每天定時向培養液中充氣，或在蓋與溶液間保留一定空隙，以利通氣。培養液每隔一周需更換一次。注意記錄缺乏必需元素時所表現的癥狀和最先出現癥狀的部位。待各缺素培養液中的幼苗表現出明顯癥狀后，可把缺素培養液一律更換為完全培養液，觀察癥狀逐漸消失的情況，并記錄結果。【思考題】1.為什么說無土

12、培養是研究礦質營養的重要方法?2.比較溶液培養和砂基培養的優缺點。3.進行溶液培養或砂基培養有時會失敗，主要原因何在?實驗03-04 植物激素對愈傷組織形成和分化的影響在植物組織培養中，原已分化的外植體（根、莖、葉、花、果實、種子、花粉等）細胞，又能重新進行分裂生長，形成沒有組織結構的細胞團，即愈傷組織，這個過程稱為脫分化。愈傷組織經過繼代培養后又可分化形成根和芽，稱為再分化。植物激素在“再分化”中起重要作用。【原理】 愈傷組織分化根和芽受培養基中生長素和細胞分裂素的相對濃度的影響，生長素/細胞分裂素比值高時，促進根的分化；比值低時，則促進芽的分化；兩種激素比值適中時，則愈傷組織生長占優勢或不

13、分化。這樣，通過改變兩種激素的相對濃度即可有效地調節愈傷組織再分化的進程。【儀器與用具】超凈工作臺；高壓滅菌鍋1個；手術刀一把；長柄鑷子1把；三角瓶4 支； 容量瓶：25ml、50ml、500ml、1000ml各1支；吸量管：1ml、2ml、5ml、10ml各1支；培養皿1個；下口杯1個；燒杯1000ml 1個；酒精燈1個；牛皮紙；白線繩；培養室。【試劑】75乙醇；1次氯酸納；1mol/L HCI；瓊脂；6-芐基腺嘌呤；萘乙酸；MS培養基中各種化合物（配方見附錄七）。【方法】1.配制培養基按MS培養基配方（見附錄七），先配制各母液。(1)按表36-1，配置10倍的大量元素母液：表36-1 10

14、倍的大量元素母液配置表無機鹽NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4重量(g)16.5194.43.71.7用蒸餾水溶解并定容至1000ml。(2)按表36-2配置100倍的微量元素母液：用蒸餾水溶解并定容至1000ml。(3)200倍的鐵鹽母液：稱EDTA-Na2 3.37g，FeSO47H2O 2.78g，用蒸餾水溶解并定容至500ml。(4)有機成分：20mg/ml的肌醇溶液 稱取2g肌醇，用蒸餾水溶解后定容至100ml。0.5mg/ml的煙酸溶液 稱取12.5mg的煙酸，用蒸餾水溶解后定容至25ml。1mg/ml的甘氨酸溶液 稱取25mg甘氨酸，用蒸餾水溶解

15、后定容至25ml。表35-2 100倍的微量元素母液配置表無機鹽重量（mg）KI83H3BO4620MnSO44H2O2230ZnSO47H2O860Na2MoO42H2O25CuSO45H2O2.5CoCl26H2O2.50.5mg/ml的鹽酸吡哆醇（維生素B6） 稱取12.5mg鹽酸吡哆醇，用蒸餾水溶解后定容至25ml。0.1mg/ml的鹽酸硫胺素（維生素B1） 稱取10mg鹽酸硫胺素，用蒸餾水溶解后定容至100ml。(5)植物激素：0.1mg/ml的萘乙酸溶液 稱取10mg NAA，用少量95乙醇溶解后，用蒸餾水定容至100ml。1mg/ml 6-芐基腺嘌呤 稱取50mg6-BA，用少量

16、1mol/L的HCl溶解后，用蒸餾水定容至50ml。將各種元素的母液混合，配制成MS培養基，其中1升體積中所含各種元素的母液含量如表36-3：表36-3 1L MS培養基中各種元素的母液含量大量元素母液100ml微量元素母液10ml鐵鹽母液5m l肌醇母液5ml甘氨酸母液2ml煙酸母液1ml鹽酸吡哆醇母液1ml蔗糖30g鹽酸硫胺素母液1ml瓊脂9g再按表36-4分別加入NAA和6-BA母液：表36-4 培養基14加入NAA、6-BA配置表培養基1234NAA母液0.1ml0.2ml0.1ml06-BA母液3ml3ml03ml先在三角燒杯（或不銹鋼鍋）加入600ml蒸餾水，加入所需的瓊脂和糖，在

17、水浴鍋里將瓊脂溶化，如果直接加熱應不停地攪拌，防止在瓶底（或鍋底）燒焦或沸騰溢出。再將溶解的瓊脂糖溶液倒入盛有上述各種物質母液的下口杯中，混勻，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調pH至5.8，用蒸餾水定容至1升。將培養基分注到三角瓶或試管中，按容器的大小和培養要求放入適當量的培養基。分裝時注意不要把培養基沾附到瓶口或管口附近的內壁上，以免培養過程中發生污染。分裝中還要不時攪動下口杯中的培養基，否則先后分裝的各瓶培養基凝固能力不同。蓋上棉塞，用牛皮紙包扎好后，放入高壓滅菌鍋，1.2大氣壓下滅菌15min，冷卻后備用。2.材料的滅菌與接種取開花前23天已露白的菊花花蕾，先用自來水沖洗

18、花蕾，然后在75乙醇中浸泡15秒鐘，后用無菌水沖洗2次，再用1次氯酸納溶液浸泡15min，并不時輕輕攪動。用無菌水清洗三次，再轉入放有濾紙而又無菌的培養皿中，用剪刀剪取舌狀花，用解剖刀切取舌狀花的5毫米見方大小的小塊，一個100ml的三角瓶中68個小塊。接種后放到培養室中培養。培養室內的溫度為252，日光燈每天照明12h，光照強度約2000lx。3.結果觀察和記錄接種后注意觀察記錄外植體上愈傷組織和根芽出現的時間和數量，加以分析比較。【注意事項】1.在配制植物激素時，溶解試劑的乙醇和鹽酸用量要少，用蒸餾水稀釋時，慢慢沿燒杯內壁加入。2.對培養基和材料及器皿的滅菌要嚴格。3.分裝培養基時，不能把

19、培養基沾附到瓶口上，以免引起污染。4.在溫室內培養過程中，經常檢查，及時剔除污染的材料或三角瓶。【思考題】1.植物激素與愈傷組織形成和器官分化有何關系？2.在組織培養過程中應注意些什么？實驗05 葉綠體色素的提取分離和理化性質一、葉綠體色素的提取與分離【原理】 葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類。它們與類囊體膜上的蛋白質相結合，而成為色素蛋白復合體，這兩類色素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機溶劑提取。提取液可用色層分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質的吸附力不同，當用適當的溶劑推動時，混合物中各成分在兩相（流動相和固定相）間具

20、有不同的分配系數，所以它們的移動速度不同，經過一定時間層析后，便將混合色素分離。【儀器與用具】研缽2套；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培養皿（直徑11cm）；康維皿或平底短玻管（也可用塑料藥瓶蓋代替）；藥勺；圓形濾紙（直徑11cm）；濾紙條（5cm1.5cm）。【試劑】95%乙醇；石英砂；碳酸鈣粉；推動劑：按石油醚丙酮苯（1021）比例配制（體積比）。【方法】1葉綠體色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鮮葉片45片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入研缽中。（2）研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加23ml 95%乙醇，研磨至糊狀，再加1015ml 95%乙醇，提取35min

21、，上清液過濾于三角瓶中，殘渣用10ml 95%乙醇沖洗，一同過濾于三角瓶中。如無新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜葉最好），先用105殺青，再在80下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時稱葉粉1g放入小燒杯中，加95%乙醇2030ml浸提，并隨時攪動。待乙醇呈深綠色時，濾出浸提液備用。（3）另取一研缽，放入剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水30ml，攪均，不過濾。2葉綠體色素的分離（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm），在其中心戳一圓形小孔（直徑約3mm）。另取一張濾紙條（5cm1.5cm），用滴管吸取乙醇葉綠體色

22、素提取液沿紙條的長度方向涂在紙條的一邊，使色素擴散的寬度限制在0.5cm以內，風干后，再重復操作數次，然后沿長度方向卷成紙捻，使浸過葉綠體色素溶液的一側恰在紙捻的一端。（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿凸出）。（3）在培養皿內放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動劑，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。迅速蓋好培養皿（圖16-1）。此時，推動劑借毛細管引力順紙捻擴散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，不久即可看到各種色素的同心圓環。如無康維皿，也可在培養皿中放入一平底短玻管或塑料藥瓶蓋，以盛裝推動劑。但所用培養皿底、蓋直徑應相

23、同，且略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養皿邊緣上。（4）當推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風干，即可看到分離的各種色素：葉綠素a為藍綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為鮮黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。二、葉綠體色素的理化性質【原理】葉綠素是一種二羧酸葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與堿起皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開；葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，表現出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定；葉綠素吸收光量子而轉變成激發態，激發態的葉綠素分子很不穩定，當它變回到基態時可發射出紅

24、光量子，因而產生熒光。葉綠素的化學性質很不穩定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩定。葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標本。皂化反應式如下：COOCH3 COOKC32H30ONMg + 2KOH C32H30ON4Mg皂化葉綠素COOC20H39 COOK+ CH3OH + C20H39OH甲醇 葉綠醇【儀器與用具】 20ml刻度試管；10ml小試管；試管架；分光鏡；石棉網；藥匙；燒杯（100ml）；酒精燈；玻棒；鐵三角架；刻度吸量管

25、2ml、5ml各1支；火柴。【試劑】 95%乙醇；苯；醋酸銅粉末；5%的稀鹽酸；醋酸-醋酸銅溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸餾水4倍稀釋而成；KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，過濾后盛于塞有橡皮塞的試劑瓶中。【方法】用本實驗第一項中提取的葉綠體色素乙醇溶液和水研磨勻漿，進行以下實驗。1光對葉綠素的破壞作用（1）取4支小試管，其中兩支各加入5ml用水研磨的葉片勻漿，另外兩支各加入2.5ml葉綠體色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀釋1倍。（2）取1支裝有葉綠素乙醇提取液的試管和1支裝有水研磨葉片均漿的試管，放在直射光下，另外兩支放到暗處，40min后對比觀察

26、顏色有何變化，解釋其原因。2熒光現象的觀察 取1支20ml刻度試管加入5ml濃的葉綠體色素乙醇提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同？解釋原因。3皂化作用（綠色素與黃色素的分離）（1）在做過熒光現象觀察的葉綠體色素乙醇提取液試管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻。（2）片刻后，加入5ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入11.5ml蒸餾水，輕輕混勻（勿激烈搖蕩），于試管架上靜置分層。若溶液不分層，則用滴管吸取蒸餾水，沿管壁滴加，邊滴加邊搖動，直到溶液開始分層時，靜置。可以看到溶液逐漸分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素）；上層是苯

27、溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。4吸收光譜的觀察 將上述已分層的試管溶液，用分光鏡觀察兩類色素的吸收光譜，首先讓下層綠色素部分對準進光孔，看光譜有何變化；然后再將上層黃色素溶液對準進光孔，看光譜又有何變化。把觀察的結果用簡單的圖表示出來。5H+和Cu+對葉綠素分子中Mg+的取代作用方法一：（1）取兩支試管，第一支試管加葉綠體色素提取液2ml，作為對照。第二支試管中加葉綠體色素提取液5ml，再加入5%HCl數滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。（2）當溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記載溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。方法二：另取醋酸醋酸銅溶液20ml，以

28、燒杯盛之。取新鮮植物葉片兩片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時觀察并記錄葉片顏色的變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因。【注意事項】1在低溫下發生皂化反應的葉綠體色素溶液，易乳化而出現白絮狀物，溶液渾濁，且不分層。可激烈搖勻，放在3040的水浴中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。2分離色素用的圓形濾紙，在中心打的小圓孔，周圍必須整齊，否則分離的色素不是一個同心圓。【思考題】1用不含水的有機溶劑如無水乙醇、無水丙酮等提取植物材料特別是干材料的葉綠體色素往往效果不佳，原因何在？2研磨提取葉綠素時加入CaCO3有什么作用？3從葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素的吸收光譜討論其生理

29、意義。實驗06 紅外線CO2氣體分析儀法測定植物光合速率與呼吸速率紅外線CO2氣體分析儀（IRGA）工作原理：許多由異原子組成的氣體分子對紅外線都有特異的吸收帶。CO2的紅外吸收帶有四處，其吸收峰分別在2.69m、2.77m、4.26m和14.99m處，其中只有4.26m的吸收帶不與H2O的吸收帶重疊，紅外儀內設置僅讓4.26m紅外光通過的濾光片，當該波長的紅外光經過含有CO2的氣體時，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少與CO2的濃度有關，并服從朗伯比爾定律。分別供給紅外儀含與不含CO2的氣體，紅外儀的檢測器便可通過檢測紅外光能量的變化而輸出反映CO2濃度的電訊號。.密閉系統斜率法一、原理

30、把IRGA與光合作用同化室連接成密閉的氣路系統。將植物材料密封在透明的同化室內，給以適當的光照，同化室內CO2濃度將因植物光合而下降，用IRGA配以適當的記錄儀可繪出同化室內CO2濃度隨光合時間下降的曲線。在同化室不漏氣、光強度穩定、室內空氣不斷得到攪動的情況下，該曲線將是一條平滑曲線，在曲線的任一點作切線，即可根據切線的斜率，密閉系統的容積和同化室面積求出在該點的CO2濃度下的光合速率。二、材料、儀器設備及試劑（一）材料：植物葉片（二）儀器設備：1. 密閉氣路光合測定裝置：將QGD07型紅外線CO2氣體分析儀、XWT264型自動記錄儀、MXQ型氣體取樣器（圖4）、光合作用同化室、溫度轉換器（

31、測溫探頭可放在同化室內，輸出信號接記錄儀）或半導體點溫計、橡皮管（內徑67mm）、塑料氣球，按圖6所示連接成套，放在一輛醫用小推車上。2. 量子輻射照度計；3. 葉面積儀；4. 鐵架臺（帶試管夾）；5. 050溫度計（用以校正葉室溫度）；6. 剪刀；7. 帶蓋搪瓷盤；8. 紗布。（三）試劑：1. 無水氯化鈣（無水硫酸鈣）；2. 燒堿石棉（10目）或堿石灰。三、實驗步驟（一）光合速率的測定1. 安裝儀器（1）將安裝好的密閉氣路光合測定裝置安放在靠待測植株12m處，接通紅外儀、錄儀、取樣器、溫度轉換器的供電電源。打開紅外儀電源開關預熱12h，紅外儀量程開關置于I檔（0500ppm，1ppm1mg/

32、L）。把紅外儀和溫度轉換器的信號輸出與記錄儀的兩個信號輸入接線柱用導線接通。旋轉記錄儀第一支筆量程選擇開關于10mV位置（與紅外儀輸出信號電壓匹配），旋轉記錄儀第二支筆量程選擇開關于2V位置（與溫度轉換器輸出溫度050信號電壓匹配）。2. 調、校儀器（1）紅外儀預熱完畢后，開啟記錄儀電源開關、記錄儀信號輸入開關和取樣器前面板上的氣泵開關，將取樣器F1旋鈕置“零氣”位置，F2旋鈕置“測量”位置，開始調整紅外儀的零點（此時，無CO2無水分的零氣循環經過紅外儀），約12min，調節紅外儀的調零旋鈕使指針穩定在“0”點位置，穩定后，調節記錄儀第一支筆的“調零”旋鈕使記錄筆到零點位置，紅外儀調零完畢。（

33、2）拔下紅外儀進氣口處的橡皮管，改接CO2標準氣（已知準確CO2濃度）鋼瓶，出口放空，讓標準氣流經紅外儀分析氣室（流量以1Lmin左右為宜）開始校正，此時紅外儀指針應指在標準氣濃度所對應的刻度（A值）上，否則可調節紅外儀“校正”旋鈕，校正完畢后恢復原氣路。（3）把玻璃溫度計感溫端與葉室內的溫度轉換器探頭放在一起（注意遮蔭），從玻璃溫度計上讀出溫度，迅速旋轉記錄儀第二支筆的調零旋鈕，使記錄筆置該溫度所對應的位置，校正溫度。3. 測定（1）旋轉取樣器面板上F1旋鈕至“測量”位置，把植物葉片平展放入同化室后關閉同化室（注意勿讓操作者的呼吸氣進入葉室），開啟葉室風扇。觀察記錄筆開始左移時，迅速旋轉記錄

34、儀“走紙變速”開關至合適檔（以所劃曲線45角為宜），開始記錄CO2濃度變化（此時記錄筆應從350ppm左右開始記錄）和溫度變化，用鉛筆在記錄紙上記下所測葉片的編號、走紙速度，用量子輻射照度計測量所測葉片的受光強度（光子通量密度）并記錄，待記錄筆左移至310ppm左右時，關閉走紙開關，停止記錄，第一次測定完畢。（2）旋轉取樣器面板上的F2旋鈕至“補充”位置后，迅速復原，讓氣球內的高濃度CO2氣進入同化室以補充CO2濃度至350ppm左右，觀察記錄筆左移后迅速開啟走紙開關，進行第二次重復測定，測量光照強度并記錄，當記錄筆左移至310ppm左右時，關閉走紙開關，第二次重復測定完畢。如此再進行第三次重

35、復測定。（3）三次重復測定完畢后，關閉同化室內風扇，用記號筆在葉片的葉室內外相交處作標記，打開葉室，剪下葉片的測定部分，用紙牌編號后包在濕紗布內并放置于帶蓋搪瓷盤內，待測葉面積。然后再測定第二張葉片的光合速率。（4）測定結束后，用葉面積儀測定各葉片面積（如有便攜式葉面積儀，可在測定光合后，立即測出葉面積）。 4. 計算II.密閉系統落差法原理在密閉的系統中，由于同化室中的葉片進行光合后，系統中的CO2濃度不斷下降，可用單位時間內同化室中CO2濃度的減少量或CO2濃度減少量所需的時間，根據葉片面積、同化室體積，計算光合速率。二、材料、儀器設備及試劑材料：待測植物葉片。（二）儀器設備：1.GXH3

36、05型紅外線CO2氣體分析儀（或QGD07型紅外儀，使用該紅外儀需要配用MXQ氣體取樣器和數字萬用電表）；2.電子秒表；3.同化室（根據需要自制，內裝兩個小風扇和一個測定溫度的傳感器）；4.量子輻射照度計。（三）試劑：燒堿石棉或堿石灰。三、實驗步驟1. 按要求將氣路系統的各部分連接起來，若使用QGD07型紅外儀，把數字萬用電表上選擇開關旋至200mV電壓檔上，與紅外儀0200mV輸出相連接。2. 接通電源，打開紅外儀電源預熱12h，打開氣泵電源，旋轉零氣調節開關至“零點”上，此時紅外儀通入無CO2氣體，調節紅外儀“調零”旋鈕，顯示在“零點”位置，并觀察零點的穩定性。3. 將待測葉片放入同化室，

37、密閉后開啟同化室內的風扇，當CO2濃度穩定下降時，開始測定，讀取開始的CO2濃度值C1，開始計時，CO2下降至C2（約下降2030ppm），終止計時，記錄C1、C2、t（或確定從測定開始到結束所需時間），并同時用照度計測定光照強度，測定葉室內的溫度。一次測定完成之后，向同化室內補充CO2，進行重復測定（使用MXQ取樣器，補充CO2操作見密閉氣路斜率法）。測定結束，用葉面積儀測量葉片的面積。4. 計算光合速率PnCV273P/tS22.4(273t)0.1013上式中，Pn光合速率（單位mol/m2/s）；CCO2濃度落差C1C2（ppm）；t測定時間（S）；S葉片面積（單位m2）；V同化室（包

38、括氣路系統）體積（單位L）；t同化室的溫度；P大氣壓（單位Mpa）。密閉氣路落差法測定裝置除了進行光合速率測定外，也能夠進行呼吸速率、CO2光合速率曲線的測定。測定步驟同光合速率測定方法。更換群體同化箱，可以進行群體光合速率的測定，測定步驟略。實驗07 赤霉素對-淀粉酶的誘導形成原理 淀粉性種子在萌動過程中，胚釋放出來的赤霉素能誘導糊粉層細胞中-淀粉酶基因的表達，引起-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解為糖。通過碘試法比色測定淀粉在酶催化反應過程中的消耗量，可以定量分析-淀粉酶的活力。 二、材料、儀器設備及試劑 （一）材料：大麥、小麥種子 （二）儀器設備：1. 分光光度計；2. 恒溫箱

39、；3. 水浴鍋；4. 移液管；5. 燒杯；6. 試管；7. 青霉素小瓶；8. 鑷子；9. 刀片。 （三）試劑：1. 1%次氯酸鈉溶液；2. 0.1%淀粉溶液；3. 2105mol/L、2106mol/L、2107mol/L、2108mol/L 赤霉素溶液；4. 103mol/L 醋酸緩沖液；5. I2-KI溶液。三、實驗步驟1. 選取大小一致、健康的大麥種子50粒，用刀片將每粒種子橫切成兩半，使成無胚的半粒和有胚的半粒，分別置于新配制的1次氯酸鈉溶液中，消毒15min，取出用無菌水沖洗數次，備用。 2. 取小瓶6只編好號碼，按表（詳教材）加入各種溶液和材料，于25下培養24小時（最好進行振蕩培

40、養，如無條件，則必須經常搖動小瓶）。3. 淀粉酶活性分析：從每個小瓶中吸取培養液0.1mL，分別置于事先盛有1.9mL淀粉磷酸鹽的溶液中，搖勻，在30溫箱或水浴中精確保溫10min，然后加I2-KI溶液2mL，蒸餾水5mL，充分搖勻，于波長580nm下測定吸光度，以蒸餾水為空白校正儀器零點。讀數，從標準曲線查得淀粉含量，以被分解的淀粉量作為淀粉酶的活性。4. 以不同淀粉濃度（07g/L）或淀粉量（0100g）及其吸光度繪制標準曲線。四、結果計算1. 第1瓶為淀粉的原始量（X）。 2. 第26瓶分別為反應后淀粉的剩余量（Y）。3. 淀粉水解量=（XY）/X100%。實驗08 根系活力的測定（TT

41、C法）植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養狀況及產量水本。本實驗練習測定根系活力的方法，為植物營養研究提供依據。一、 原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標。二、材料、設備儀器及試劑（一）材料：水培或砂培小麥、玉米

42、等植物根系。（二）儀器設備：1. 分光光度計；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 電子頂載天平（感量0.1g）；4. 溫箱；5. 研缽；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度試管10ml；11. 試管架；12. 容量瓶10ml；13. 藥勺；14. 石英砂適量；15. 燒杯10ml、1000ml。（三）試劑：1. 乙酸乙酯（分析純）。2. 次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。3.1TTC溶液準確稱取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用時稀釋至各需要的濃度。4. 磷酸緩沖液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L

43、硫酸用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸稱取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、實驗步驟（1）TTC標準曲線的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產生紅色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的標準比色系列，以空白作參比，在485nm波長下測定吸光度，

44、繪制標準曲線。（2）稱取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸沒在溶液內，在37下暗保溫13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應。（與此同時做一空白實驗，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研缽內磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml，用分光光度計在波長485nm下比色，以空白試驗作參比測出吸光度，查標準曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結果計算四氮唑還原強度（mg/g(根鮮重)/

45、h）四氮唑還原量（mg）/根重（g）時間(h)實驗09 類似生長素對種子萌發的影響一、原理 生長素及人工合成的類似物質如萘乙酸等對植物生長有很大的調節作用，在不同濃度下對植物生長的效應也不同。一般來說，低濃度的生長素促進生長，高濃度時則抑制生長。不同的植物器官對生長素的反應也不同，通常根比芽、莖對生長素更敏感。本實驗據此觀察不同濃度的萘乙酸在種子萌發過程中對植物不同器官生長的影響。二、材料、儀器設備及試劑（一）材料：小麥種子。（二）儀器設備：溫箱，培養皿，移液管，鑷子，濾紙，尺子。（三）試劑：10mg/L萘乙酸，0.1%升汞。三、實驗步驟1. 取小麥種子，用0.1%升汞消毒15min，再用自來

46、水和蒸餾水各沖洗3次，置于22的溫箱中催芽2d。2. 取9cm的潔凈培養皿7套，編號。在1號培養皿中加入10mg/L 萘乙酸10mL，然后從其中吸取1mL放入2號培養皿中，加9mL蒸餾水混勻后即成為1 mg/L 萘乙酸溶液。如此依次稀釋到6號培養皿（最后從第6號培養皿中取出1mL棄去），則1號至6號培養皿中的萘乙酸濃度依次為10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0.001 mg/L、0.0001 mg/L。第7號培養皿中則加入9mL蒸餾水作為對照。3. 在各培養皿中放入一張與培養皿皿底大小一致的濾紙，選取已萌動的小麥種子10粒，用鑷子將其整齊地排列在培養皿中，使芽

47、尖朝上并使胚的部位朝向同一側，蓋上皿蓋后，放在22的溫箱中暗培養3d。4. 測量培養皿內小麥幼芽及幼根的平均長度以及根的數目。四、實驗結果計算與分析 以蒸餾水中的材料為對照，計算不同濃度萘乙酸溶液中小麥幼芽及幼根長度的增加或減少值，并填入表中進行比較分析。實驗10 植物組織中超氧物歧化酶活力的測定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于動、植物體內，是一種清除超氧陰離子自由基（）的酶，它催化下列反應：2 反應產物H2O2可被過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用。因此SOD有保護生物體免受活性氧傷害的能力。已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關系，故成為植物逆境生理學的重要研究對象。【原理】本實驗依據

48、超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有可氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生，可將氮藍四唑還原為藍色的甲 。后者在560nm處有最大吸收，而SOD可清除從而抑制了甲 的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一個酶活性單位定義為將NBT的還原抑制到對照一半（50）時所需的酶量，據此可以計算出酶活性大小。【儀器與用具】高速臺式離心機；分光光度計；微量進樣器；熒光燈（反應試管處光照強度為4000lx）；試管數支；黑色硬紙套。【試劑】0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；提取介質50mmo

49、l/L pH7.8磷酸緩沖液（內含1聚乙烯吡咯烷酮）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱取1.9399g Met用磷酸緩沖液定容至100ml；750mol/L氮藍四唑（NBT）溶液：稱取0.06133g NBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；100mol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml；20mol/L核黃素溶液：取0.00753g核黃素定容至1000ml避光保存。【方法】1酶液提取 取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.52

50、ml于10000r/min下離心10min，上清液即為SOD粗提液。2顯色反應 取5ml指形管（要求透明度好）7支，3支為樣品測定管，3支為對照管，另外1支作為空白，按表39-1加入各溶液。混勻后將空白管置暗處，其它各管于4000lx日光燈下反應20min（要求各管受光情況一致，反應室的溫度高時時間可適當縮短，溫度低時時間可適當延長）。表39-1 各溶液加入量試 劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩沖液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L EDTA-Na2液20mol/L核黃素酶 液蒸餾水總體積1.50.30.30.30.30.05

51、0.253.013mmol75mol10mol2.0mol空白和對照管加緩沖液代替酶液3SOD活性測定與計算 至反應結束后，以不照光的作空白，分別測定其它各管560nm波長下的消光度值，已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性：SOD總活性=SOD比活力=式中 SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位/mg蛋白表示；A0照光對照管的消光度值；AS樣品管的消光度值；VT樣液總體積（ml）；V1測定時樣品用量（ml）；FW樣重（g）；蛋白質濃度單位為每克鮮重含蛋白毫克數(mg/g)。【思考題】1在SOD測定中為什么設照光對照管和暗中空白管？2影響本實驗準