1、腫瘤免疫治療新技術研究中心一. NSFC資助的項目二.面上項目三.申請注意事項四.申請書的寫作要求五.申請書的撰寫六.申請書各部分之間的關系七.基金申報相關規定及要求報告提綱第一部分 NSFC資助的項目研究項目板塊人才資助體系面上項目重點項目重大項目國際合作與交流項目國家杰出青年科學基金項目海外及港澳學者合作研究基金項目創新研究群體項目優秀青年科學基金項目青年科學基金 自由申請項目青年科學基金項目 地區科學基金 重大研究計劃項目國家自然科學基金NSFC資助的項目面上項目的類型自由申請項目(A類) ：允許申請人的學術思想自由，選題自由；青年科學基金(C類)：申請人的年齡需在35周歲以下（指申請當

2、年1月1日未滿36周歲）；地區基金(D類)：面向老、邊、少地區的研究單位。在同等水平的情況下，老、邊、少地區的項目有可能優先送審。第二部分 面上項目面上項目面上項目也叫一般項目，照顧的面比較大是國家自然科學基金研究項目系列中的主要部分支持從事基礎研究的科學技術人員在國家自然科學基金資助范圍內自主選題開展創新性的科學研究，促進各學科均衡、協調和可持續發展。面上項目是科學基金最基本的資助項目類別，其經費額約占科學基金總額的60%。面上項目包括自由申請項目、青年科學基金項目和地區科學基金項目。2016年面上項目資助情況面上項目申請人的條件面上項目的要求生命科學部生命科學一處：微生物學、植物學生命科學

3、二處：生態學、林學生命科學三處：生物物理和生物化學與分子生物學、免疫學、生物力學與組織工程學生命科學四處：神經學、生理學與整合生物學、心理學生命科學五處：遺傳學與生物信息學、細胞生物學、發育生物學與生殖生物學生命科學六處：農學基礎與作物學、食品科學生命科學七處：植物保護學、園藝學與植物營養學生命科學八處：動物學、畜牧學與草地科學、獸醫學、水產科學生命科學一處：微生物學科生命科學三處：生物物理、生物化學與分子生物學生命科學三處：免疫學生命科學三處：生物力學與組織工程學生命科學四處：神經學生命科學四處：生理學與整合生物學生命科學四處：心理學生命科學五處：遺傳學與生物信息學生命科學五處：細胞生物學生

4、命科學五處：發育生物學與生殖生物學生命科學八處：動物學生命科學八處：獸醫學醫學科學部（基礎和臨床研究）醫學科學一處：呼吸系統、循環系統、血液系統醫學科學二處：消化系統、泌尿系統、內分泌系統、眼科學、耳鼻咽喉頭頸科學、口腔顱額面科學醫學科學三處：神經系統疾病、精神疾病、老年醫學醫學科學四處：生殖系統、圍生醫學和新生兒、醫學免疫學醫學科學五處：影像醫學與生物醫學工程、特種醫學、法醫學醫學科學六處：運動系統、急危重癥-創傷-燒傷-整形、康復醫學、醫學病原生物與感染、檢驗醫學醫學科學七處：腫瘤學醫學科學八處：皮膚及其附屬器、放射醫學、地方病學、職業病學、預防醫學醫學科學九處：藥物學、藥理學醫學科學十處

5、：中醫學、中藥學、中西醫結合領域第三部分 申請注意事項（1）申請者不具備申請資格或違反了自然科學基金委的有關規定（2）申請手續不完備或申請書不符合要求（3）申請項目主要研究內容不屬于申報學科的資助范圍（4）申請書紙質與電子版內容不一致（5）其它面上項目 (自由、青年、地區）形式審查不合格原因A、紙質申請書上沒有項目組成員簽名B、紙質申請書缺頁C、單位蓋章為非注冊章D、合作單位未蓋章或蓋的不是注冊（法人）章E、中級無博士學位人員無專家推薦 （初級無博士學位不得做負責人申請）F、在職研究生申報項目需導師同意函G、項目被查重（已獲得青年基金的再申請青年）H、申請金額過高（平均強度四倍）較容易犯的錯誤

6、有：生命科學五處面上項目初篩不合格原因 初篩原因具體原因項數比例%超項（58項，占37.9%）參加人超項5032.7申請人超項85.2簽字或蓋章（52項，占34.0%）申請人未簽字42.6參加人未簽名10.7合作單位未蓋公章2415.7合作單位非法人公章1912.4申請人單位公章不符42.6導師同意函（32項，占20.9%）在讀博士/碩士無導師同意函3221.0其它（八項，占7.2%） 非本學科項目53.3申請人為初級職稱21.3超齡申請青年基金10.7申請人為中級職稱，但缺專家推薦信10.7申請人簡歷不祥10.7申請書電子版與紙質版不符10.7第四部分 申請書寫作要求一、申請書中的注意事項基

7、金項目的評審只是評價一份申請書的質量，而不完全是評價申請項目的實際水平和學術水平。二、項目的寫作要求1、表達能力：告訴評議人您是如何思考問題的2、歸納總結能力：從新的角度和高度對所研究的問題提出新的觀點3、區分問題主次的能力4、對研究中所需技術的掌握能力5、對申請書研究內容準確而又令人信服的安排能力所有這些方面便反映出申請人的科研能力三、四個重要方面的信息 你為什么要做？即研究意義和立論依據 你想做什么？即研究內容、研究目標 你如何去做？即研究方案 你以前做過什么（為什么你能做）？即研究基礎四、立項依據的要求立項目的要明確，申請理由要充分，立項依據既不要太科普，又要把關鍵問題交待清楚，能引起評

8、審人的興趣，愿意繼續讀完您的申請。初審專家關注問題關鍵推斷不成立：例如：本項目立項依據不充分，且對信號轉導通路的概念尚不十分清楚，僅分析未磷酸化的信號通路蛋白不能判斷通路運行狀態 關鍵推斷缺乏依據：例如：立論依據中對誘導的效應與其特異的現象的關系未闡述清楚。 在中的作用意義的論據也欠充分四、立項依據寫作（1）（l）既要介紹國外動態，也要介紹國內研究情況，避免評議人會認為申請人對國內研究情況不了解，就以“不了解國內情況”為由，不同意資助該項目的申請。（2）國內情況應包括申請者自己的意見、工作，以使評議人比較順暢地了解申請人的思路。（3）必須闡明申請人要從事本項研究的理由究竟是您在前期工作中發現什

9、么問題，還是別人的工作中存在什么問題，或者您對哪個科學問題有什么特殊想法等等（4）堅持“有所為，有所不為”的基本國策，填補空白不是立項依據科學基金是要使我國的基礎研究在世界上占有一席之地，而不是跟蹤或填補空白。（5）主要參考文獻，包括國內、外的關鍵性研究工作都要有所顯示，注意時間性和篇數。四、立項依據寫作（2）五、研究方案研究目標、內容和擬解決的關鍵問題研究目標不是簡單地去做一件具體的事，而是要研究和解決其中的科學問題和學術性問題。泛泛地講探索什么規律，而不能很好地論證要了解某個規律意義，那就難以得到支持。要從學術角度提出可行性分析突出申請人學術思路方面的好想法，闡明你的設計方案、研究方法、技

10、術路線能否實現預期的研究目標。研究隊伍、研究條件和學術思想方面的綜合優勢研究內容過大或過小： 研究內容充實，設計細致，但主攻重點不突出 該研究計劃過于龐大研究內容不屬于資助范圍： 申請側重于技術和應用研究，科學意義不明確。研究內容安全性有疑問： 在上海這樣人口高度密集的地區進行飼養繁殖（該類昆蟲），本身就有很大風險。研究內容 但本課題將研究內容、研究目標及擬解決的關鍵問題混淆項目執行期內無法完成任務： 但是，質量的正向演變和響應是一個十分緩慢的過程研究內容無法實現研究目標： 通過標書的閱讀，難以判斷通過本研究能達到作用機制的研究；題目與研究目標、擬解決關鍵問題不完全一致研究方案部分表述不清：關

11、注實驗重現性： 但實驗設計欠合理，很難實現預期目標，試驗的重現性難以保證取材可能性太小： 從自愿患者取10ml骨髓，很困難對所用方法了解不夠： 也說明申請人沒有芯片研究的經歷，沒有理解和掌握該技術。本項目科學性不強初審專家關注的問題研究方法與技術路線六、本項目的創新之處(1) 創新之處：指申請人要開展的研究項目的特色和新穎的學術思想，而不是泛指的一個新領域的特色；研究條件的特色并不能完全表明申請人的研究特色和學術思想新穎性。學術思想可以有一點新穎性，或者可以把其它領域的好思想借鑒到你的研究課題里。創新性不明顯約占異議比例的50%(2) 不要泛泛地談學科交叉基金委鼓勵學科交叉，但不等于說，申請項

12、目屬多學科交叉，就算有特色、有創新，就該給予資助。“學科交叉必須對相關學科的發展都有促進作用” 如果你的申請項目屬于學科交叉項目，必須闡明交叉點在哪兒？(3) 填補國內外空白不是創新和特色目前，基礎研究可以有所為的，首先應該關注的是國家國民經濟急需領域的基礎研究和國內已經有一定研究基礎，有可能在世界上占領一席之地的研究領域的基礎研究兩方面。專利正確理解專利的地位專利是不是成果？當然，你的基礎研究成果推廣應用了，申請若干項專利，基金委還是承認你的，但不能把專利作為基金的主要成果。專利只是一種知識產權保護方法，難以判斷基金項目的研究水平，可以作為結題時的輔助成果，申請時不必過分強調。創新性部分-初

13、審專家關注的問題： 無明顯的創新性，評議人認為填補國內空白不能作為創新。 本項目的創新性不強，僅為動物模型的一些指標的觀察，評議人認為難以達到研究目的。 國內外對于方面已經有比較多的報道 第二個問題已被研究組解答（評審人均為專家） 該研究的創新性僅在于在此材料中尚無此方面的研究。 七、研究基礎（1）與本項目有關的工作積累和成績應該是申請人以及合作者的，而不是你所在的單位、研究集體或者導師的工作和成績。對于剛畢業的研究生，作為基金委和評審專家不會強求他們在新的研究領域有很多積累，但必須詳盡地介紹他們自己過去的工作，讓評審專家能夠判斷他們的研究能力。研究基礎（3）申請人和主要成員的研究背景情況都要

14、介紹不少申請中只介紹申請者的情況，不符合申請書的要求。申請人和主要成員的背景情況介紹要具體，必須符合申請書的要求，有關論著應注明作者位置、論文題目、發表的刊物以及發表時間，獲得學術獎勵應注明獲獎人的名次等等。有一半人沒有按項目指南要求填寫。原因可能有兩種，不是沒有讀過項目指南，就是沒有相應的業績來填寫。從推論做推論： 第一步工作就可能達不到預期目標，使后續的實驗無法進行。建議不予資助。在關鍵步驟或方法中無工作經驗： 特別是申請者及課題組成員均沒有細胞誘導分化研究的工作基礎未準備好解決關鍵問題的方法： 對整個項目的限速步驟，并沒有令人信服的研究設計和檢測指標，使得整個項目看起來可行性不夠 初審專

15、家關注的問題研究基礎 八、申請者承擔國家自然科學基金資助項目情況其中進展或完成情況一欄，應填寫詳細一些不要簡單地填寫“已完成”、“順利進行”。最好能注明獲得什么獎勵，發表多少論文，引用情況如何，培養了幾名研究生等等。讓評議人能一目了然。前一結題項目完成情況；三篇主要論文首頁必須反映是基金資助項目，否則，應附上能反映基金資助的那一頁，如：致謝或英文刊物中的Acknowledgment。 用途 項目類型 比例 面上 =15% 重大、重點 =10% 國際合作與交流費 外國專家來訪和項目組成員出訪 杰出青年 = 20% 面上 = 15%（不封頂） 重大、重點 = 10% 勞務費 參加項目的研究生、博士

16、后 杰出青年 = 20% 面上 重大、重點 管理費 依托單位為組織和支持項目而支出的費用 杰出青年 5% 九、經費預算間接費用自2015年起，各類項目申請經費分為直接費用和間接費用兩部分。直接費用包括設備費、材料費、測試化驗加工費、燃料動力費、差旅費、會議費、國際合作與交流費、出版/文獻/信息傳播/知識產權事務費、勞務費、專家咨詢費、其他支出。間接費用是指依托單位在組織實施項目過程中發生的無法在直接費用中列支的相關費用，主要包括依托單位為項目研究提供的現有儀器設備及房屋，水、電、氣、暖消耗，有關管理費用的補助支出，以及績效（ 按照直接費用扣除設備購置費后的5%核定 ）支出等。間接費用計算：項目

17、直接費用扣除設備購置費后，金額在500 萬元及以下部分為20%，金額為500萬元以上至1000 萬元的部分為13%，金額超過1000 萬元的部分為10%。十、結語申請書是寫給別人看的，不僅要你自己認為清楚、滿意，而且要讓小同行、大同行、基金管理人員和有關領導都能認可。“外行看了有興趣，內行看了有水平”。申請書是否滿足以下要求1、立論依據是否充分，提出的問題是否屬該研究領域的重要問題；2、研究目的是否明確，研究內容是否合適，二者間是否一致；3、有關的文獻資料是否已經全面掌握，是否真正明白其中的問題，是否熟悉該領域的研究進展，您提出的問題是否屬于還未解決的問題，是否能為本研究領域增加新的內容和新的

18、結論；4、前期的工作是否能說明你熟悉項目中所采用的研究方法，是否能使評議人相信你勝任此項目的工作；5、研究方案是否可行，是否創新，是否清晰，是否能說服評議人，是否組織合理；6、研究方法是否合適，是否創新，是否可能遇到困難，有何補救措施，方法有何優點和不足；7、經費預算是否合理。A、標書書寫不規范 標書撰寫不太認真，存在關鍵字錯誤，如摘要中的“斑快”（斑塊）,水稻（小麥） 文中有多處錯字，說明申請人在書寫和校對時缺乏嚴肅認真的態度 此外，項目申請書的科技寫作不夠規范，如立項依據部分文中的文獻引用沒有標注、文中有的文獻引用在參考文獻目錄中沒有等問題其他問題（1）B、論文造假 申請者自我介紹中的論文

19、11(p26)應為會議摘要，并有頁碼錯誤。 p2論文2,3應為會議摘要而不是論文C、項目組成員工作時間問題（不初篩） 主要成員已有23項國家自然科學重點、杰出、面上或973、863項目在研D、同室操戈 本申報材料與其所在科室另一申報書內容雷同，工作人員重復，本課題組與之相比,沒有良好的研究基礎其他問題（2）其他問題（3）-報送學科報送學科要準確，但別把學科代碼當指南代碼1表示投送學科，代碼2表示相關學科，準確填寫相關學科代碼，將會便于學科尋找合適的同行評議專家。如果投送學科完全錯了，就相當于考大學時報錯了志愿，白白申請了。盡管NSFC的指南還不十分理想，但它終究反映了學科的資助動向，有一定的導

20、向作用。申請內容涉及多個學科，就要比較各相關學科的項目指南，看一看研究重點與哪個學科更接近？第五部分 申請書的撰寫一、摘 要（限400字）包括：研究方法、內容、目標、科學意義。 如：采用方法，進行研究， 闡明機制或揭示規律， 為奠定基礎提供思路。作用：畫龍點睛效果：引發評議專家的興趣，使其產生探個究竟的好奇心 “他到底是怎么做的 ？ ” 采用改良的消減雜交技術建立老年性白內障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內障相關基因。通過基因轉染在體和培養的晶狀體上皮細胞，觀察細胞的形態、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細胞的角度闡明老年性

21、白內障發生的分子生物學機制，為防治白內障提供新思路和理論依據。摘要舉例 對基礎研究，著重結合國際科學發展趨勢， 論述科學意義 對應用基礎研究，著重結合學科前沿，圍 繞國民經濟和社會發展中的重要科技問題 論述應用前景二、立論依據 在立論依據的闡述中，對研究領域、研究方向、 具體科學問題的理解 研究領域：白內障的研究，包括發病機制、預防、診斷、 治療措施等研究 研究方向：白內障發病機制的研究，包括環境因素、致病 靶點、細胞水平、分子水平研究等 科學問題：白內障發病過程中的相關基因研究，包括致病 基因篩選、功能研究、調控機制、信號轉導等在研究領域層面從研究方向展開圍繞某一具體科學問題（本項目研究目標

22、）進行歸納分析提出研究設想從研究領域切入研究意義國內外現狀分析 1、項目的研究意義 存在問題：對科學意義的闡述不足或夸大 撰寫方法： 從領域入手，提出主要問題，引出熱點研究方向。 圍繞熱點研究方向進行簡要分析，找出目前尚未解決的具體科學問題，以此為切入點提出假設，闡述如果解決了該問題（研究目標），對該領域甚至相關領域的科學貢獻（理論意義或應用前景）。 老年性白內障是與年齡相關的疾病，隨著年齡的增 加，其發病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化， 白內障的患病人數還將持續增加。目前，它已是人類 第一位的致盲疾病。迄今為止, 治療白內障唯一有效的 方法是通過手術摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。

23、雖然手術后患者可以恢復良好的視力，但是不可避免的 術后并發癥以及手術設備、材料耗資巨大，治療白內障 所花費的資金已成為世界各國包括富裕的發達國家嚴重 的醫療負擔。最近的調查表明，如果把老年性白內障的 發病時間延緩10年，白內障手術的數量就會減少45%1。 所以，一些學者認為通過預防白內障發生或延緩其發展 的途徑征服白內障已成為一項全球性的社會和社會經濟 問題2。 但是目前我們對老年性白內障發病機理的認識還不十分清楚。多年以來許多學者的研究結果證實晶狀體上皮細胞在老年性白內障發生中起重要的作用，但對其中進一步的基因調控知之甚少。如果從參與老年性白內障晶狀體上皮細胞變化的相關基因入手，研究基因的生

24、物學功能，有可能抓住引起白內障發生、發展的主要環節。據此，本研究擬利用改良的消減雜交技術和基因芯片技術準確、全面、快速的特點，以晶狀體上皮細胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內障全部有差異表達的基因，從中再篩選出與白內障相關基因，并著重對其功能進行研究，從基因水平闡明白內障的發病機制，為防治白內障提供新思路和理論依據。 2、國內外現狀分析（與綜述的區別） 存在問題： A、低水平重復：不了解最新進展，對國內外現 狀缺乏真正了解，提出的問題別人已解決。 B、文獻復習不全：檢索文獻方法不當、選擇關鍵詞 不妥，甚至人為縮小檢索范圍。 C、總結表達不夠：對國內外現狀缺乏歸納分析， 只是簡單羅列，缺乏邏輯

25、性和針對性。 D 、對方法原理理解不夠：對研究方法不熟悉，簡 單移植或夸大其作用，缺乏實際應用的可行性。 撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請項目的主題。 A、從領域切入，簡要論述國內外研究成果，并引 出當前的熱點研究方向。 B、從研究方向展開，較詳細地分析國內外的研究 進展，闡明在該方向上存在的問題。 C、圍繞存在的問題，結合國內外以往的研究結果、 當前的現狀及今后的發展趨勢，詳細論述和分 析這些問題產生的原因，提出該方面的空白點、 未知數、以及研究的難點、焦點，從而為自己 申請項目確立研究目標奠定充分的立論基礎。 D、對擬采用的技術方法進行介紹和分析。 成熟的方法重點介紹可以應用于本研究的理論依據

26、和實驗依據。 新方法在詳細介紹其原理的基礎上，闡明可以應用于本研究的理論依據和實驗依據。 需特別注意的問題：必須對所運用的技術方法的原理、流程尤其是在實際運用中可能出現的問題要十分清楚，絕不能是一種簡單的移植。E、提出本項目的研究設想。 防治白內障必須針對其發病的主要環節。多年以來，國內外學者從不同的角度探討白內障的發生機理。就致病的環境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環境中離子濃度改變及一些生長因子、細胞因子的改變均與老年性白內障的發生有關。就研究的部位分，晶狀體中皮質與核的蛋白質改變及晶狀體纖維的改變與白內障的形成有關，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細胞在白內障的形成中的變化

27、更引人關注。 因為晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數量相對穩定的細胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細胞、產生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結構，對維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實老年性白內障的晶狀體上皮細胞還發生退行性變、細胞膜通透性增加、細胞內酶活性改變、細胞數量減少、凋亡細胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異3-5 。 體外實驗也證實多種因素(H2O2、UV-B、晶狀體蛋白的自身抗體)誘發的白內障模型中晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環節6-8。因此，從晶狀體上皮細胞的變化入手探討白內障的

28、成因，有可能抓住揭示白內障發病機理的主要環節。而晶狀體上皮細胞變化的基因調控機制是問題的關鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。 白內障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結果，包括基因的和非基因的隨機變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機性的組織特異性多種基因表達的改變。目前，國內外對白內障相關基因的研究主要以下三方面： 一是對體外培養的晶狀體白內障模型及上皮細胞的研究。UV-B輻射作用誘導的白內障中晶狀體上皮細胞是主要的靶細胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質的合成和分泌增加；上皮細胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表達增加；還有組蛋白

29、H4、H3 的低表達和蛋白酶C、-肌動蛋白、-肌動蛋白基因的高表達9-12。Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技術研究H2O2誘導的晶體上皮細胞的基因差異性表達結果顯示NADH脫氫酶4亞基、細胞色素b、谷氨酰胺轉移酶基因表達減少以及細胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達的增加。 二是利用轉基因動物的研究。波形纖維蛋白基因（vimentin）、雜交的型中間纖維蛋白

30、基因的轉基因小鼠表現出白內障，而且有隨小鼠年齡增加白內障加重的趨勢。晶狀體改變的共同特點是晶狀體纖維細胞分化受抑制14,15。Gong等16報告晶狀體的細胞膜蛋白連接蛋白3（3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細胞分化早期不受影響，其后出現與晶狀體蛋白溶解有關的核性白內障。 雖然體外實驗和白內障轉基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內障有關，但是，這些變化的基因是否與老年性白內障形成有關，目前尚缺乏進一步的報告。 三是對人老年性白內障晶體上皮的研究。Lee17利用RT-PCR技術研究顯示前極性白內障與核性白內障上皮細胞中纖維連接蛋白、I型膠

31、原纖維、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受體、結締組織生長因子的基因表達有差異。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究老年性白內障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達的初步結果是老年性白內障有三個高表達基因和12個低表達的基因。但就DD-PCR技術來講，在實驗中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長cDNA的問題。 上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結果，但由于當時技術條件的限制都未能全面闡明與白內障相關的基因及其功能。 尋找白內障時晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因有可能揭示白內障的發病機理。 尋找差異表達基因的經典方法是消減雜交技術（subtracti

32、ve hybridization, SH），它是，但是實驗操作復雜。 經過改進后的抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）簡化了實驗操作，但仍然問題很多。 我校生化教研室建立了改良消減雜交技術19，20，其特點是：簡便易行，能夠獲得目的細胞特異表達的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。 該方法的建立者已利用這一技術從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中5個為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差

33、異表達的基因，并克隆到全長cDNA，為進一步的結構和功能研究打下基礎。 基因芯片技術的出現，使檢測差異表達基因和未知DNA分子變得更快捷、準確、高效。基因芯片是在1996年被提出并開始研制的，該技術是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上，利用堿基互補原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知DNA分子雜交后由標記分子標記雜交體，經自動閱讀設備分析雜交結果，從而對檢測基因進行定性、定量和結構分析，確定未知DNA分子。 由于目前尚沒有針對白內障研究的現成基因芯片，根據本研究的需要，我們將篩選到的差異表達的所有基因建立cDNA文庫，再利用基因芯片技術制備成基因芯片，以此檢測多個樣本中白

34、內障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因，從中進一步篩選出白內障特異的基因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術的有機結合，我們能更快捷、有效、準確地得到白內障相關基因。 綜上所述，分子生物學技術的發展為研究白內障發生過程中的功能基因及特異調控基因提供了有利武器。本項目從晶狀體上皮細胞入手，利用改良的消減雜交技術和基因芯片技術系統研究與白內障相關的基因，并采用對體外培養細胞和在體晶狀體上皮細胞的基因轉染，探討它們在晶狀體上皮細胞變化和白內障形成中的作用，可望闡明白內障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學機制，為防治白內障提供新的思路和理論依據。 3、參考文獻 A、文

35、獻類別要全：以英文文獻為主，同時也要引用 中文文獻- 國內同行中知名專家的文獻。 B、引文信息要全：文章題目、作者姓名、具體出處 （包括期刊名、年份、卷期、頁碼等）。 C、文獻年代要新：主要是近五年的文獻，最好能有 2017年的最新文獻。三、研究方案 1、研究目標 撰寫要求： 有限目標，與研究內容相呼應 如：明確關系，揭示規律， 闡明原理（機制），建立方法等舉例：篩選出與老年性白內障相關的基因，明確部分基因在白內障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內障的發生機理，為防治白內障提供線索。 2、研究內容： 存在問題：內容過多，一個研究周期難以完成 內容分散，不能集中闡明研究目標 撰寫要求：

36、內容要適當確保研究周期內完成 為目標服務與目標相輔相成 要重點闡述注意與技術路線區別 舉例： （1）篩選白內障相關基因：采用改良的消減雜交技術，獲得人老年性白內障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞差異表達的基因片段，建立cDNA文庫。制備差異表達基因的基因芯片，利用基因芯片技術從多個標本的老年性白內障晶狀體上皮細胞中篩選出白內障相關基因。 （2）研究白內障相關基因的結構： （3）研究白內障相關基因在晶狀體上皮細胞變化中的作用： 觀察指標如下： 存活細胞數；光鏡、透射電鏡下細胞形態的變化；細胞凋亡檢測：用原位末端標記和連接酶介導PCR方法，從形態和DNA水平分析細胞凋亡；細胞增殖的檢測：；細胞骨

37、架蛋白的檢測：；晶狀體蛋白的檢測： 3、擬解決的關鍵問題： 存在問題：抓不住關鍵問題或抓得不準。 什么是關鍵問題 ？ -研究過程中對達預期目標有重要影響的某些研究 內容或因素。 -為達預期目標所必須掌握的關鍵技術或研究手段。 撰寫要求：找出關鍵問題，提出解決辦法。 舉例： （1）建立差異表達的cDNA文庫： 建立差異cDNA文庫是篩選老年性白內障相關基因的前提。為使差異cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案： 選擇各種類型老年性白內障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標本（擬取50例標本）作為建庫的mRNA的來源。 利用改良的消減雜交技術可快速、有效地獲得差異表達的完整cDNA片段。此技術是本

38、課題組成員主要的研究成果，在應用此項技術中已積累了較豐富的實驗經驗。（2）制備基因芯片： 制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內障相關基因的關鍵環節。制備基因芯片的關鍵是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發生任何混淆。在制作基因芯片時做到：嚴格按操作程序進行；在標本的處理及RNA提取時避免污染，否則即會造成嚴重的損失。只要嚴格按操作程序進行操作就可以避免發生差錯。 （3）在體基因轉染： 在體基因轉染是進行白內障相關基因功能研究的關鍵。在體的晶狀體上皮細胞大部分處在靜息狀態，只有位于赤道前區的少量細胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉染

39、的關鍵是如何使大量分裂后細胞轉染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對以上問題我們擬采取下列方法解決：選用反轉錄病毒的慢病毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉錄病毒只能轉染有分裂能力細胞的局限性，對分裂后細胞也能有效的轉染。這對在體晶狀體的基因轉染有很大的優越性。采用直徑1-2m玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細胞。 4、研究方法 存在問題： 過于簡單：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。 過于繁雜：大量羅列一些常規的實驗方法。 撰寫要求：以研究項目的需求為前提，盡量采用最適合的方法和手段，并將其操作

40、步驟和關鍵環節體現在技術路線當中。 5、技術路線 存在問題： 不清楚，不詳細，不可行。 撰寫要求： 清晰、詳細、注意邏輯性。 撰寫方法： 以時間順序為主線設計技術路線 以研究內容為主線設計技術路線 分大小標題，突出邏輯關系。 詳細地寫清楚每個具體步驟。 （1）人晶狀體上皮細胞的獲得：老年性白內障晶狀體上皮細胞取自白內障患者手術中取出的前囊膜（晶狀體上皮細胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。正常晶狀體上皮細胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文獻提供的方法去除晶狀體纖維細胞，仔細清洗以去除血細胞污染。 （2）建立差異cDNA文庫：從50例白內障手術患者的前囊膜上取下的

41、晶狀體上皮細胞作為實驗組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為對照組，利用改良的消減雜交技術19，20，獲得差異表達的cDNA，并建立文庫。主要的實驗流程如下： 正常晶狀體上皮細胞 白內障晶狀體上皮細胞 Promega PolyATtract System 1000 mRNA分離 mRNA分離oligo-dT18反轉錄 ntech Cap-finder方法反轉錄 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 隨機引物PCR 雜交 Sephacryl S-400柱 除鹽及小片段 鏈親和素-生物素磁性分離 除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細胞cDNA “長距離”PC

42、R 目的cDNA的特異擴增 克隆、鑒定、轉化 建立差異基因文庫 （3）制備基因芯片篩選白內障相關基因： 基因芯片的制備： 白內障相關基因的篩選： （4）白內障相關基因的結構分析： 序列測定：. . 序列的計算機分析： . . 獲得全長基因： . . （5）基因轉染： 培養人晶狀體上皮細胞的轉染： 在體晶狀體的轉染： 6、可行性分析 對實驗方案設計的分析 理論分析 研究手段方法分析 預實驗結果分析 對相關條件的分析 所用特殊實驗材料（試劑）的分析 對所具備的實驗條件進行分析 對項目組成員搭配及其運用技術方法的能力分析(1)關于建立差異cDNA文庫： 老年性白內障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞

43、是處在不同狀態下的細胞，細胞基因表達的改變 是細胞蛋白功能等改變的基礎。尋找這些有差異的基 因是探索細胞功能、狀態變化原因的突破口。利用的 消減雜交技術是篩選差異表達基因的有效方法。改良 的消減雜交技術是我們研究組成員建立的方法，應用 此方法已經從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表 達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其 中 5個為新基因，這一研究成果進一步證實了該方法 的可操作性，而且我們在運用此方法過程中也積累了 較豐富的經驗，因此，本研究利用這一方法從兩種狀 態的晶狀體上皮細胞中篩選差異表達的基因并建立 cDNA文庫是可行的。 7、創新性 存在問題： 對創新點提煉不夠 把運用新技

44、術、新方法理解為創新 與研究目標、研究內容相混淆 對創新的理解： 原始創新：填補空白或修改傳統的理論 發明創造新技術、新方法 跟蹤創新：補充、完善現有理論 修改、完善現有技術方法（112） 提煉方法：用逆向思維方法提煉創新點 （1）基因篩選方法上的創新： 首次采用改良的消減雜交技術建立白內障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫，并制備相應的基因芯片，利用此基因芯片篩選出老年性白內障相關基因。上述兩種方法的有機結合使我們能快速、準確、定性、定量地獲得多個白內障相關基因。通過分析這些基因的結構、研究它們的功能，揭示老年性白內障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學機制，為防治白內障提供新的思路。 （2）基因功能

45、研究上的創新：. 年度研究計劃： 按年度列出研究內容及其階段目標 擬組織的重要學術交流活動、國際合作與交流計劃 預期研究結果： 理論成果：建立/豐富/補充/填補 . 技術方法：建立/完善 . 專 利：可望獲得 論 文：國際、國內 人才培養：青年科技骨干、博碩研究生 8、年度研究計劃及預期研究結果1、研究工作積累 存在問題： 內容過簡； 與申請項目無關。 撰寫要求： 介紹與申請項目直接相關的預實驗研究結果； 提供相關的研究論文、成果及專利等材料； 以往應用與申請項目有關的技術方法的經歷； 工作積累也要包括項目組成員的所有信息。四、研究基礎 （1）有關消減雜交技術和基因芯片技術的工作基礎: 本研究所用的基因篩選技術主要是改良的消減雜交技術，此技術是我們研究組成員主要參與建立的，并利用此技術從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表