1、-PAGE . z.分子生物學綜合實驗論文題 目:綠色熒光蛋白(GFP)的基因克隆及表達中國2010年12月 綠色熒光蛋白GFP基因的克隆與表達胡麗丹師學院生命科學院0803班 43500摘要：綠色熒光蛋白GFP是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體的生物發光蛋白。用堿裂解法提取的的質粒pEGFP-N3和pET-28經過BamHI和Not I雙酶切連接后，得到pET-28-pEGFP-N3重組質粒。取局部的重組質粒做酶切實驗，驗證重組質粒的存在性，剩下的重組質粒導入表達菌E. coLiBL-21大腸桿菌感受態細胞中。重組有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1L/mL的卡納霉素

2、的LB培養基上培養。當A600到達0.7時，用終濃度為0.8mM的異丙基硫代-D-半乳糖苷IPTG誘導培養3小時，離心得到下層綠藍色沉淀物即可。關鍵詞：綠色熒光蛋白 GFP 基因的克隆 熒光蛋白 水母CLoning and E*pression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight,College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent prote

3、inGFP,one kind of bioluminenscent proteins ,has been found e*isting in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process e*traction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids w

4、ithBamHIand Not I,the rebinant plasmid,namely pET-28-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis.Taking slight rebinant plasmid proves that rebinant plasmid does e*ist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The rebinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21th

5、e petent cells. E. coLi BL-21containing rebinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 L/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL -D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key wo

6、rds:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 目錄TOC o 1-3 h z uHYPERLINK l _Toc2800485551.前言： PAGEREF _Toc280048555 h 1HYPERLINK l _Toc2800485561.1綠色熒光蛋白green fluorescent protein，GFP PAGEREF _Toc280048556 h 1HYPERLINK l _Toc2800485571.1.1 GFP研究背景 PAGEREF _Toc280048557 h 1HYPERLI

7、NK l _Toc2800485581.1.2 GFP研究應用 PAGEREF _Toc280048558 h 2HYPERLINK l _Toc2800485591.2基因的克隆與表達 PAGEREF _Toc280048559 h 3HYPERLINK l _Toc2800485602.實驗試劑及實驗儀器： PAGEREF _Toc280048560 h 5HYPERLINK l _Toc2800485612.1實驗試劑與材料： PAGEREF _Toc280048561 h 6HYPERLINK l _Toc2800485622.2實驗儀器： PAGEREF _Toc280048562

8、h 7HYPERLINK l _Toc2800485633.實驗方法 PAGEREF _Toc280048563 h 7HYPERLINK l _Toc2800485643.1質粒提取方法: PAGEREF _Toc280048564 h 7HYPERLINK l _Toc2800485653.2瓊脂糖凝膠電泳及回收: PAGEREF _Toc280048565 h 9HYPERLINK l _Toc2800485663.3酶切及連接： PAGEREF _Toc280048566 h 11HYPERLINK l _Toc2800485673.4E. coLi DH5或E. coLi BL21感

9、受態制備及轉入： PAGEREF _Toc280048567 h 12HYPERLINK l _Toc2800485683.5酶切驗證重組質粒： PAGEREF _Toc280048568 h 13HYPERLINK l _Toc2800485693.6GFP基因的表達 PAGEREF _Toc280048569 h 14HYPERLINK l _Toc2800485703.6.1活化菌種 PAGEREF _Toc280048570 h 14HYPERLINK l _Toc2800485713.6.2擴大培養 PAGEREF _Toc280048571 h 14HYPERLINK l _Toc

10、2800485723.6.3 IPTG誘導GFP基因的表達 PAGEREF _Toc280048572 h 14HYPERLINK l _Toc2800485734.結果與分析 PAGEREF _Toc280048573 h 14HYPERLINK l _Toc2800485744.1質粒提取過程中現象與結果： PAGEREF _Toc280048574 h 14HYPERLINK l _Toc2800485754.2瓊脂糖凝膠電泳 PAGEREF _Toc280048575 h 15HYPERLINK l _Toc2800485764.3E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態

11、制備及轉入結果 ： PAGEREF _Toc280048576 h 16HYPERLINK l _Toc2800485774.4酶切驗證重組質粒 PAGEREF _Toc280048577 h 16HYPERLINK l _Toc2800485784.5 GFP基因的表達結果： PAGEREF _Toc280048578 h 17HYPERLINK l _Toc2800485815.討論： PAGEREF _Toc280048581 h 18HYPERLINK l _Toc2800485825.1提取質粒出現圖六的原因是： PAGEREF _Toc280048582 h 18HYPERLINK

12、 l _Toc2800485835.2瓊脂糖凝膠電泳出現圖七、圖八原因： PAGEREF _Toc280048583 h 18HYPERLINK l _Toc2800485845.3 E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態制備及轉入出現圖九、十原因: PAGEREF _Toc280048584 h 19HYPERLINK l _Toc2800485855.4酶切驗證重組質粒出現圖十一原因：19HYPERLINK l _Toc2800485865.5 GFP基因的表達結果如圖十二、十三原因：19HYPERLINK l _Toc2800485876.參考文獻20-. z.前言：1.

13、1綠色熒光蛋白green fluorescent protein，GFP1.1.1 GFP研究背景綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體的生物發光蛋白。當受到紫外或藍光激發時，GFP 發射綠色熒光1。日本科學家下村修 1962年第一次從一種水母中發現了綠色熒光蛋白, 如圖一所示。這種蛋白在紫外線光中呈現綠色, 這種水母體含有一種生物發光蛋白質aequorin，但它本身發藍光,通過對光譜的研究, 下村修提出了發光景水母所發的綠光是因激發的水母素向綠色熒光蛋白圖一：夜晚水母體內GFP顯色4 Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night

14、4 發生的熒光能量轉移所致。即水母素作為一種能量供體, 而綠色熒光蛋白成為能量受體。水母素和綠色熒光蛋白都有重要的應用, 但水母素是熒光酶的一種, 它需要有熒光素底物, 經過酶促反響后發光。GFP能把這種光轉變成綠色，也就是當水母容光煥發的時候我們實際看到的顏色。其在下呈綠色、 鎢絲下呈黃色、 紫外光下呈現強烈綠色2。1987年，道格拉斯普萊沙Douglas Prasher克隆出了GFP的基因序列。1993年，在普萊沙的根底上，馬丁沙爾菲Martin Chalfie成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物如大腸桿菌等也能產生GFP，這不僅證實了GFP與活體生物的相容性，還建立了利用GF

15、P研究基因表達的根本方法，而許多現代重大疾病都與基因表達的異常有關。至此，生物醫學研究的一場綠色革命揭開了序幕。此后，爾蓋路基亞諾夫Sergey A. Lukyanov又從一種珊瑚中別離出了與綠熒光蛋白類似，但能發出紅色光的熒光蛋白，預示著熒光蛋白可以有不同的顏色。美籍華人錢永健Roger Y. Tsien系統地研究了綠熒光蛋白的工作原理，。錢永健還對綠色熒光蛋白進展了顏色突變。不同顏色可以同時在同一個細胞或組織標記多種蛋白或構造。多種顏色的綠色熒光蛋白的出現, 為研究蛋白之間的相互作用、蛋白分解等提供了無限的可能性。現在世界各地實驗室使用的 GFP , 都是經過改造優化了的, 而錢永健是這方

16、面的先驅和領先人物2。1996 年GFP 的晶體構造被解出，蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣構造，如圖二. 長420 nm，寬240 nm，由11 個圍繞中心螺旋的反平行折疊組成，熒光基團的形成就是從這個螺旋開場的，桶的頂部由3 個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位于大空腔。發色團是由其蛋白質部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身環化和氧化形成2。-. z.-. z.圖二：GFP晶體構造 圖三: 質粒pEGFP-N35Figure2 Crystal structure of GFP Figure3 pEGFP-N352001年1月11日，美國科學家宣布

17、培育成世界上首只轉基因猴, 這是世界上首次培育成功轉基因靈長類動物. 添加在這只名為安迪的猴子體的就是這種標志基因。1.1.2 GFP研究應用在生物學研究中，科學家們更多的是利用這種能自己發光的熒光分子來作為生物體的標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的局部就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法，把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中糾出來。但傳統的熒光標記在發光的同時，會產生具有毒性的氧自由基，導至被觀察的細胞死亡，這叫做光毒性。因此，在GFP發現以前，科學家們只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態構造。相反，綠色熒光蛋白對生物體無毒無害, 分子量小, 方

18、便構建載體, 同時在多種非水母的生物體中均可穩定表達并易于檢測, 所以, 作為一種生物分子標記, 具有廣泛的應用前景 3。由于GFP熒光是生物細胞的自主功能, 是一種現成的熒光蛋白質，熒光的產生不需要任何外源反響底物,因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比較的。本實驗是利用實驗室提供的質粒pEGFP-N3,其構造如圖三所示.其上有所用酶的酶切位點。1.2基因的克隆與表達基因克隆分子克隆molecular cloning通過體外重組技術,將一段目的DNA經切割、連接插入適當載體，并導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。如以下圖四所示:所需元件:限制性切酶

19、:BamH I和Not IBamH I的切點為：5-GGACC-3 Not I的切點為 5-GCGGCCGC-33-CCTAGG-5 3-CGCCGGCG-5載體: E. coLi DH5a1.易于接納外源DNA。 2.無特異的源性核酸切酶 3.載體復制、擴增不受阻 4.與質粒有互補性)受體細胞: E. coLi BL-211.易于接納外源DNA。 2.無特異的源性核酸切酶 3.載體復制、擴增不受阻 4.與載體有互補性目的基因:pEGFP-N3選擇標記基因：pET-28同時含有抗kana的基因有助于后面選擇，和-半乳糖苷酶基因可被異丙基硫代-D-半乳糖苷IPTG誘導表達目的基因GFP連接：平末

20、端連接一樣酶切產生互補的粘性末端，再通過堿基互補配對連接圖四：基因克隆的過程Figure4 Process of gene cloning原核基因表達系統Gene E*pression： 由于目前對原核生物基因構造了解的要透徹一些，所以一般將目的基因導入到原核生物中。將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發酵形式快速高效地表達、合成基因產物的體系。如圖五所示。為提高GFP表達的效率，我們一般可從以下三個方面考慮：1.基因水平上:盡量選用受體細菌細胞的偏愛性密碼子62.載體水平上:通過核外質粒構建適宜的操縱子、增強子6,如本實驗的-半乳糖苷酶操縱子基因,故通過異丙基硫代-D-半乳糖苷IPT

21、G誘導表達目的基因GFP表達3.作為受體細胞上:根據DH5a和E. coLi BL-21構造特點不同,前者對外援質粒擴增阻礙作用很小,故作為克隆菌;后者易于外源基因表達,應選用表達菌。圖五：基因克隆與表達Figure5 Gene cloning & e*pression本實驗是應用已學過的分子知識和查閱一些參考文獻，來設計教師給定的實驗課題。第一，是學習運用科學理論知識指導設計實驗使用方法；第二，學習科學嚴謹的實驗操作；第三，查閱文獻了解并學習了綠色熒光蛋白基因GFP相關特性和研究進展，穩固理論知識的同時也開拓了我們的視野。本實驗我們做了以下工作：將綠色熒光蛋白基因GFP插入pET-28構建p

22、ET-28- pEGFP-N3重組質粒，將重組質粒導入E. coLi DH5擴增，用堿法提取質粒。核酸電泳檢測質粒是否成功導入大腸桿菌，再酶切鑒定所提取質粒是否為重組質粒。將提取的質粒導入E. coLi BL-21感受態中，經IPTG誘導目的基因表達產生綠色熒光蛋白Green fluorescent protein,GFP 。本試驗通過做實驗過程中，王教師細心地指導及斧正以及同組同學的協商配合，最終實驗結果大抵讓人滿意。在表達菌E. coLi BL-21中表達了我們期望的結果綠色熒光蛋白Green fluorescent protein,GFP 。但此試驗在LB培養基平板上生長效果不是很好，酶

23、切效果也不是那樣完美，在以后的實驗設計中要進一步完善這兩局部的工作。2.實驗試劑及實驗儀器：2.1實驗試劑與材料：1.克隆菌株EcoLi DH5(8311實驗室提供)2.表達菌株EcoLi BL21(8311實驗室提供)3.LB培養基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉，溶于950 mL中，用NaOH調節pH至7.0，補加蒸餾水至總體積為1 L，分裝后高壓蒸汽滅菌。對于固體培養基參加10-15 g瓊脂粉后再加熱滅菌4.溶液: 50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCL(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0。1 M Tris-HCL(pH 8.012.5 mL，

24、0.5 M EDTApH 8.010 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 Lbf/in2高壓滅菌15 min ，貯存于4 。5.溶液：0.2 M NaOH，1% SDS。2 M NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL。使用前臨時配置。6.溶液：醋酸鉀KAc緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4 保存備用。7.TE：10mM Tris-HCL(pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)。1 M Tris-HCLpH 8.01 mL，0.5 M EDTApH 8.00

25、.2 mL，加ddH2O至100 mL。15 Lbf/in2高壓濕熱滅菌20 min，4 保存備用。8.氯仿1:19.乙醇無水乙醇、70%乙醇10.50TAE：Tris 堿54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na22H2O 4.65 g，加ddH2O 至1000 mL。15 Lbf/in2高壓濕熱滅菌20 min，4 保存備用。11.溴化乙錠EB：10 mg/mL12.RNase ARNA酶A：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10 mg/mL，TE配制，沸水加熱15 min，分裝后貯存于-20。13. 6Loading buffer上樣緩沖液：0.25% 溴酚藍，0.2

26、5% 二甲苯青FF，40%W/V蔗糖水溶液。14.0.8% 瓊脂糖凝膠：稱取0.4 g瓊脂糖于三角燒瓶中，加50 mL 1TAE，電熱套加熱至完全溶化，冷卻至60 左右，輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30 min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中電泳緩沖液1TAE，即可上樣。15.雙酶切體系：DNA sampLe 8 L, BamHI 0.5mL寶生物公司提供, Not I 0.5mL寶生物公司提供,BufferH 2 mL,Trio*-100(0.1%) 1uL,BSA(0.1%) 1 L, ddH2O 6 L16.10Buffer H：100 mM Tris-H

27、CL PH7.5,100 mM MgCL2,10 mM Dithiothreiol500 mM NaCL17.0.1 M CacL218.IPTG，kana固體粉末2.2實驗儀器：ORION pH計公司,HD-3紫外檢測儀日本GL-2M型冷凍離心機星科儀器雪山制冰機長洋科學儀器公司超純水機AYJ1-0501-U頤洋企業開展電泳儀DYY-5市六一儀器廠電子天平TE412-L，TE2101-L，CP64德國Satorins公司BS-1E振蕩培養箱(省金壇市億通電子儀器廠)高壓滅菌鍋Y*Q-LS-50S博迅，手持式紫外燈雙面紫外超凈工作臺凈化設備,電熱套3.實驗方法3.1質粒提取方法:方法分別有以下

28、幾種：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質粒DNA釋放法；酸酚法等。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進展處理及用加熱處理。所有別離質粒DNA的方法都包括3個根本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；別離質粒DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據實驗所需)選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素：質粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術和實驗要求。對于本實驗要求提出大量的質粒，且為使操作簡便應選用SDS堿裂解法。其根本原理：1當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當參加中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白

29、質與染色體DNA不復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。2在一定電場強度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型(相對分子質量不同的DNA片段泳動速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。因此，凝膠電泳不僅可別離不同相對分子質量的DNA，也可以別離相對分子質量一樣，但構型不同的DNA分子：其中超螺旋構造泳動最快，其次為線性構造，最慢的可能是復制中間體沒有復制完的兩個質粒連在一起，而不是開環構造用EcoRI來線性化質粒后再進展瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣其具體操作步驟如下：1. 挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接

30、種于20 mL LB含Kana1L /mL液體培養基中，37 、200rmp振蕩培養過夜約14h。2. 取1.5mL培養液倒入1.5 mL eppendorf管中，10000rmp離心1min。棄上清，將離心管倒置于衛生紙上，使液體盡可能流盡。3、菌體沉淀重懸浮于200 L溶液中, (需劇烈振蕩，使菌體分散混勻。)室溫下放置3 min。4、參加新配制的溶液300 L，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次，以混勻容物(千萬不要振蕩)，冰浴3 min。5、參加200 L預冷的溶液，蓋緊管口，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3min。 12000rmp離心3min。溶液為

31、中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀。6、上清液500 L移入干凈eppendorf管中，參加等體積的酚/氯仿，振蕩混勻, 12000rmp離心10min。500 L的苯酚/氯仿/異戊醇。7、小心移出上清于一新微量離心管中，參加2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心10000rmp2min。8、棄上清，將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，參加1mL 70乙醇洗沉淀一次，10000rmp離心10 min。9、 吸除上清液，將管倒置于衛生紙上使液體流盡，室溫枯燥。10、將沉淀溶于20 L TE緩沖液(pH

32、8.0儲于-20冰箱中。)3.2瓊脂糖凝膠電泳及回收:實驗原理：瓊脂糖凝膠電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂別離制備的鏈狀多糖。其構造單元是d-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素主要有：1DNA分子的大小 雙鏈DNA分子在凝膠基質中遷移的速率與其堿基對數的常用對數成反比。分子越大，遷移的越慢，因為摩擦阻力越大，也因為大分子通過凝膠孔徑的效率低于較小的分子。2瓊脂糖濃度 給定大小的線狀DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。在DNA電泳遷移速率的對數和凝膠濃度之間存在線性相關

33、。3DNA的構象 超螺旋環狀型、切口環狀型和線狀型DNA在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。其相對遷移速率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，其次是電流強度、緩沖液離子強度和型超螺旋絞緊的程度或密度。一些條件下，型DNA比型遷移得快；在另一些條件下，順序可能相反。4所用的電壓 低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強度升高時，高分子量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以，當電壓增大時瓊脂糖凝膠別離的有效圍反而減小。要獲得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用電壓不應高于5-8V/cm。5電泳緩沖液 DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強度的影響。缺乏離子則電導率降低，DNA或者不動或者遷移

34、很慢。高離子強度時如10buffer，電導率升高，使得應用適中的電壓也會產生大量的熱能，最嚴重時凝膠會熔化，DNA變性。具體操作步驟：1.0.8%瓊脂糖凝膠的配制：準確稱取0.4 g瓊脂糖加到三角瓶中，加50 mL 1TAE緩沖液于三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，冷卻至60 左右，用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；輕輕旋轉瓊脂糖凝膠以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；室溫下45分鐘后凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽；向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔有氣泡，應設法除去；在DNA樣品中參加10體積的載樣緩

35、沖液Loading buffer，混勻后，用槍將樣品混合液緩慢參加被浸沒的凝膠加樣孔；接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般100V電壓，電泳40min即可；根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。 同原質粒一起瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收片段。根據亮度可以估計回收的量。待回收的DNA段經電泳別離后，從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA段，放在1.5 mL EP管中；參加3 倍請準確估量凝膠的體積體積的溶膠液以100 L 體積膠參加300 L溶膠

36、液為一次標準反響，室溫下放置5分鐘或50 保溫3分鐘，其間輕搖EP管幾次使膠完全融化；參加10 L玻璃奶玻璃奶使用前請充分搖勻，顛倒混勻，冰浴下放置10分鐘。每隔23分鐘混勻一次，12000rpm離心30秒，吸棄上清；加250 L漂洗液濃縮漂洗液使用前，按濃縮漂洗液：無水乙醇= 3：7配制成工作濃度，用加樣器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻，12000rpm離心30 秒，吸棄上清；重復步驟4盡量吸盡漂洗液。吸取完漂洗液后再離心10秒鐘，用Tip頭將最后一點兒漂洗液吸干凈。然后，放置于37烘箱枯燥直至沉淀呈白色，約1520分鐘；加適量洗脫緩沖液即無菌水20 L為一次標準反響，混勻，60 水浴5

37、分鐘，12000rpm離心1分鐘，回收上清備用。重復步驟6，能提高回收率。3.3酶切及連接：實驗原理：迄今已發現了3000多種限制性切酶。傳統上將限制性切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類。II型酶在其識別位點之中或臨近確實定位點特異地切開DNA鏈。它們產生確定的限制片段，因此是三類限制性切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I這樣在識別序列中進展切割的酶。這一類酶是構成商業化酶的主要局部。大局部這類酶都以同二聚體的形式結合到DNA上，因而識別的

38、是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續的序列如EcoR I識別GAATTC；Hind III識別AAGCTT;Bam HI識別GGATCC; Not I識別GCGGCCGC；而另一些識別不連續的序列如BgL I識別GCNNNNGGC。限制性切酶酶切DNA后形成兩種類型的末端：(i)兩條鏈斷裂的位置是交織地，產生粘性末端，如EcoR I酶切后產生末端；(ii)兩條鏈的斷裂位置處在一個對稱構造5-GGCC-33-CCGG-5。的中心，產生平末端，如Hae III酶切后產生Ligase5353DNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在

39、一條DNA鏈的3-末端具有一個游離的羥基-OH，和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個磷酸基團-P。 反響體系選平衡液，依據查閱切酶供給商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表，如果有一種buffer能同時使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反響buffer。對于本實驗所用的酶為BamHI和Not I在bufferH均有最高酶活性。 具體操作步驟：按如下雙酶切體系30 L混合 ：反響物LpEGFP-N3 pET-28a質粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10bufferH3 3 0.1%BSA緩沖液 3 3 1.離心10s，混勻。2

40、.37水浴酶切3h。3.配制1.0%M/V普通瓊脂糖凝膠30mL。4.適當放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5.待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6.酶切樣品中參加5 L溴酚藍-GeneFinder混合液混勻，上樣。7.在1TAE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min8.回收連接好的目的基因，依次參加5 L回收純化的pET-28a質粒,GFP基因片段12 L，T4連接酶1L，緩沖液102 L3.4E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態制備及轉入：實驗原理:感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有開展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。受體細胞經過

41、一些特殊方法如：電擊法，CaCL2等化學試劑法的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許帶有外源DNA的載體分子進入的感受態細胞。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCL2 法，簡便易行，且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可參加占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCL2法為使用更廣泛。將正在生長的大腸桿菌細胞在0下參加到低滲的CaCL2溶液中，便會使細胞膜的透性發生改變，此時的細胞即呈現為感受態。這一方法可以用于批量制備感受態細胞，其轉化效率可到達5106-2107個轉化克隆子/g超螺旋質粒DNA。制備好的大腸桿菌感受態細胞可在-70凍存。在

42、0下外源DNA可吸附到感受態細胞外表，短時間的熱刺激42，90s誘導細胞吸收DNA。 轉化了質粒DNA的大腸桿菌隨后在培養基中37培養1h，可使質粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達，因此，轉化了質粒DNA的大腸桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養基上生長，而沒有轉化的細胞則無法生長。具體實驗操作步驟：用槍頭挑一大腸桿菌E.coLi DH5或BL21單菌落放入2 mL LB液體培養基含Kana 1 L/mL，37 培養過夜。活化大腸桿菌：取4mL新鮮的LB液體培養基參加80 L的過夜菌，培養3個小時。將昨夜搖出來的E.coLi DH5或BL21培養液轉入離心管中,冰上放置10min,然后于4 下

43、4000rpm離心5min。 棄去上清,用預冷的0.1mol/L 的CaCL2溶液600L輕輕懸浮細胞,冰上放置20 min, 4下4000rpm離心5min。 棄去上清,參加300 L預冷的0.1mol/L的CaCL2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置5min,即成感受態細胞懸液，可-80長期保存。6 取2個無菌離心管，分別參加100 LDH5感受態細胞懸液，第1管加5 L無菌水，第2管參加質粒DNA溶液5 L,輕輕搖勻,冰上放置30min。7 42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 8 分別向管中參加400 L LB液體培養基,混勻后在37振蕩培養60min。 9 從管1中取1

44、00 L涂布于含抗生素,從管2中取100 L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿,37培養14小時。3.5酶切驗證重組質粒：原理：經同種酶切后BamH I和Not I，重組質粒從新被切開，經瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外分析儀下看其跑過的膠圖，進展分析。實驗步驟：按如下雙酶切體系20 L混合 ：提取E.coLi DH5中的重組質粒，在以下體系下反響反響物LpET-28-pEGFP-N3質粒8BamH I500Not I50010bufferH20000.1%BSA緩沖液3Trio*-100(0.1%) 1BSA(0.1%) 1ddH2O6水浴2h后，經過

45、瓊脂糖凝膠電泳。3.6GFP基因的表達3.6.1活化菌種用黃色槍頭蘸取表達菌E.coLi BL21種單菌落，連同槍頭一起垂直放入裝有2 mL的LB液體培養基的試管含有卡那青霉素，其工作濃度為1L /mL中。于37 搖床振蕩培養14小時。3.6.2擴大培養將試管中活化的80L菌液接種到4 mL LB培養基，同時參加卡那青霉素終濃度1L /mL培養基于37 恒溫培養箱中培養3小時。3.6.3 IPTG誘導GFP基因的表達實驗中在不同的培養時間用OD值表征菌體密度參加IPTG誘導表達發現，當OD=0.8時，加的 IPTG至終濃度為0.8mM時GFP的表達量到達最大4.結果與分析4.1質粒提取過程中現

46、象與結果：階段溶 液I溶 液溶 液:氯 仿現 象EP管中溶液為混濁液。EP管中出現上層變澄清，下層沉淀EP管中溶液溶液有絮狀物產生參加氯仿離心后溶液分層圖表六 3- SEQ 圖表一 * ARABIC 1堿法提質粒過程中的現象Figure6 sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process e*traction結果分析:參加溶液的作用是維持細胞滲透壓，使細胞懸浮在溶液中，故呈現渾濁；參加溶液作用使細胞裂解，釋放涵物，含物溶于溶液，故上層變澄清；參加溶液作用是時變性的質粒在酸鹽環境下從新復性，但大量基因組DNA不能復性，在PDS作用下產生絮狀沉淀。參加氯仿破壞

47、了蛋白質，使其變性沉淀。4.2瓊脂糖凝膠電泳如圖七所示電泳結果圖可以看到，第一孔道和第九孔道跑的帶在紫外分析儀下,明顯跑帶量少,效果不如其余七條帶。中間幾條帶總共出現五條帶如圖八，條帶1 最為明亮，說明第一條帶出所含的核酸物質最多。大腸桿菌中RNA的拷貝數遠大于質粒DNA的拷貝數，而核酸電泳分析過程的實驗操作過程中沒有參加RNase降解所制樣品中含有較多的RNA，所以判斷該條帶一定為RNA。提取的質粒多數以超螺旋型存在，超螺旋的質粒DNA中一個螺旋由10個堿基組成，當分子上有一個缺刻時，分子會立即松弛，形成開環分子。如果質粒的雙鏈配對處都斷裂則形成線性質粒。分子量一樣的情況下，可以判定：條帶2

48、為超螺旋DNA，條帶3為線性DNA，條帶4為開環DNA，條帶5可能為線性DNA，超螺旋DNA，開環DNA中的兩者或是三者纏在一起未得到別離。-. z.圖七：瓊脂糖凝膠電泳九條孔道電泳Figure7 All channels in Agarose Gel El ectrophoresis圖八：瓊脂糖凝膠電泳中間七條孔道電泳圖Figure8 Seven channels amid Agarose Gel Electrophoresis-PAGE . z.4.3E. coLi DH5或E. coLi BL21感受態制備及轉入結果 ：管1中取100 L無菌水涂布于含抗生素LB平板結果如圖九為：LB平板

49、未生長任何菌落;管2中取100 L重組質粒涂布于含抗生素的平板上結果如圖十為：生長少量菌落;分析：管1做空白對照，說明在含抗生素的培養基上無法生存任何自然條件菌落；管2實驗組，說明重組質粒能表達*種蛋白物質，使重組均在此環境能生存。-. z.圖九：空白對照管 SEQ 圖十：空白對照 * ARABIC 1Figure9 Negative contrast 圖十：實驗組管2Figure 10 E*perimental group-PAGE . z.4.4酶切驗證重組質粒如圖十一所示所有孔道，其中第七八孔道是濃度不同的Maker蛋白。其余九條孔道為實驗酶切的帶。兩條Maker蛋白明顯可見六條帶，而實

50、驗組的帶型都很模糊。pEGFP-N3的分子量為4700bp,而pET-28a分子量為5369 bp，故在一樣的構型下，pEGFP-N3應比pET-28a跑的快一些。圖中所示的六條帶，有上述原理可以判斷為：條帶1 pEGFP-N3超螺旋DNA，條帶6pET-28開環DNA，剩下帶2、3、4、5難以準確判斷，但線性pEGFP-N3肯定在環形 pEGFP-N3之前，超螺旋pET-28也肯定在線性pET-28之前的。圖十一：酶切驗證質粒Figure11 Validate plasmid via enzyme-cutting4.5 GFP基因的表達結果：參加IPTG誘導后，可觀察到菌體細胞呈現綠色如圖十

51、二所示，說明目的基因在表達菌E. coLi BL21中表達。如圖十三所示在紫外光下可以觀察到菌體細胞發綠色熒光。-PAGE . z.圖十二：GFP基因在表達菌表達Figure12 GFP gene e*pression inE. coLi BL21圖十三：GFP在紫外光照射下Figure13 GFP e*hibites green fluorescentunder ultraviolet light-PAGE . z.5.討論：5.1提取質粒出現圖六的原因是：參加溶液的作用是制備菌懸液，參加葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部，所以觀察到得溶液呈乳白渾濁狀；參加溶液的作用是

52、使細胞破裂，蛋白質和細胞壁沉淀，質粒溶出，NaOH是最正確的溶解細胞的試劑，它使細胞膜發生了從biLayer雙層膜構造向miceLLe微囊構造的相變化導致細胞溶解，因此觀察到有大量白色絮狀沉淀；參加溶液的作用是使大腸桿菌基因組DNA沉淀，SDS遇到鉀離子后變成PDS，而PDS是水不溶的，基因組DNA較長因此發生了沉淀，因此觀察溶液較為澄清；氯仿為有機溶劑可以使蛋白質變性，進一步除去初提質粒中的蛋白質沉淀，氯仿不溶于水，所以觀察到分層現象5.2瓊脂糖凝膠電泳出現圖七、圖八原因：核酸電泳圖譜中凝膠的最前端條帶較亮，說明該處有較多的核酸物質，而在質粒提取分析過程的實驗操作過程中沒有參加RNase降解所制樣品中含有較多的RNA由E. coLi DH5a轉錄產生，所以判斷該條帶一定為RNA，但是由于電泳的時間不夠，導致不同大小的RNA未分開。第一孔道和第九孔道條帶沒有其他孔道的核酸物質得多，條帶不明顯。分析可能的原因是，第一孔道最先上樣，而總共有九個道操作時間過長導致開場電泳時孔道中的樣品已經發生擴散，所以導致電泳時條帶不明顯，而第九孔道上樣是樣品還未來得及在重力作用下進入孔道，電源就一接通，致使局部質粒樣品在緩沖液分子的作用下，擴散到緩沖液中，所以導致電泳時條帶不明顯第一孔道由于樣品時間放置過長后擴散，僅僅觀察1條帶，