1、2-1 DNA超螺旋與拓撲異構現象 第二章 DNA、染色體與基因組1Superhelix of SV40 DNA (Vinograd, 1965)一、 DNA超螺旋（superhelix or supercoil）2DNA超螺旋結構Linear DNA. LOpen Circle DNA OC relexed formSupercoiled circle(高級結構)Covalent Closed Circle CCC指雙螺旋環狀分子再度螺旋化即成為超螺旋結構。3超 螺 旋 形 成 示 意末端固定的線型雙螺旋額外的張力不能釋放雙螺旋以扭曲方式緩解應力，形成超螺旋4二、 DNA超螺旋的方向性松弛（

2、relaxed）狀態： DNA在水溶液中, 構型偏B型狀態。DNA以10.5 bp/helix為最穩定構型。正超螺旋：小于10.5bp/helix，則其二級結構處于緊縮狀態，由此產生的超螺旋為正超螺旋。 負超螺旋：大于10.5bp/helix，則其二級結構處于松纏狀態，由此產生的超螺旋為負超螺旋。 由此可見，超螺旋總是要向著抵消初級螺旋改變的方向發展；雙螺旋DNA的松開導致形成負超螺旋；而DNA的擰緊，則導致形成正超螺旋；所有的超螺旋都比松弛型含有更多的自由能。 5拓撲學(topology)是研究幾何圖形在平面位置關系不變情況下空間結構變化規律的數學分支。三、DNA超螺旋拓撲學定義實驗證明，細

3、胞內的DNA存在拓撲異構現象(topoisome)，即在保持DNA一級和二級結構不變的情況下，兩條單鏈可以相互纏繞，形成不同的空間構型。6超螺旋發生的規律Vinograd. J (1968)Vinograd equationL = T + W ( = + )L Linking number ( 雙鏈DNA的交叉數)T Twisting number (雙鏈DNA的纏繞數，初級螺旋圈數，即DNA分子中的Watson-Crick螺旋周數，其數值可直接在處于最穩定狀態下的雙鏈環形（或超螺旋形式）DNA中的實際螺旋周數計數得到，不一定是整數)W Writhing number (直觀上為雙螺旋數, 可

4、為小數)W= 負值（negative superhelix）W = 正值 ( positive superhelix） Non-breaking Non-unwinding Non-overwindingL為定值，整數7l B-DNA是力學上穩定的結構（ 10 bp/ helix）l 雖交叉數減少，但需轉換為一種應力，以維持10bp/helix的螺旋數，l 應力的重新分配 或在B-DNA狀態中保留一單鏈區或螺旋力將維持B-DNA的右旋結構, 形成超螺旋 420bpL=42T=42W=0無應力松弛狀態應力的分配L = 36T = 36W = 0L = 36T = 42W = -6 鏈松弛后再結成

5、環鏈未松弛再結成環松開6圈螺旋L = 682比連系差（Specific linking difference） = Lk Lk0 = Lk- Lk0 Lk0 能夠根據DNA分子Lk的改變描述螺旋不足（超螺旋），也叫超螺旋密度（superhelix density）。 9DNA分子形成超螺旋的生物學意義：1 超螺旋DNA具有更緊密地形狀，因此在DNA組裝中具有重要作用；2 DNA的結構具有動態性，DNA超螺旋程度的改變介導了這種結構的變化，這有利于其功能的發揮。3 DNA是一種熱力學上的穩定結構，超螺旋的引入提高了他的能量水平。10拓撲異構體(topoisomer)：具有不同連接數的同一種DNA

6、分子稱為DNA拓撲異構體。四、DNA拓撲異構體與拓撲異構酶拓撲異構酶(topoisomerase) 作用方式：拓撲異構酶與DNA共價結合形成中間體，使磷酸二酯鏈暫時斷裂形成切口，DNA分子的一條單鏈或雙螺旋穿越另一條單鏈或雙螺旋，改變其拓撲狀態，但一級和二級結構并無變化。即在保持DNA一級和二級結構不變的情況下，兩條單鏈可以相互纏繞，形成不同的空間構型。拓撲異構酶(topoisomerase) 細胞內存在著一類能催化DNA拓撲異構體相互轉化的酶，稱為拓撲異構酶。或者說，能改變DNA拓撲聯系數的酶就叫拓撲異構酶。11型酶在兩條單鏈上都產生切口，每次作用使連接數改變2。在型酶的作用是增加負超螺旋數

7、，或減少正超螺旋數，在真核生物中還有減少負超螺旋的作用。 拓撲異構酶分為型和型兩類。拓撲異構酶的生物學功能 消除DNA復制和轉錄等過程產生的正負超螺旋。在細胞中，型酶與型酶的活性保持一種平衡狀態，型酶使DNA超螺旋化的作用為型酶使DNA松馳化的作用所抗衡，從而使DNA保持適當的超螺旋密度。型酶在DNA的一條單鏈上產生切口，使另一條單鏈得以穿越，每作用一次使DNA連接數改變1；原核生物中，型酶只作用于負超螺旋DNA，減少負超螺旋數，使其松弛；在真核生物中，型酶還可以作用于正超螺旋DNA，減少正超螺旋數。12Top I (swivelase, niking-closing enzyme) Brea

8、kage & rejoining of S.S. DNA at phospho-diester bonds每次L of +1（在酶的作用下，DNA單鏈斷裂）松弛B-雙螺旋消除負超螺旋CCC OC onlyNo ATP, NADattach Negative supercoilGet energy from Negative supercoil13圖3.30 型拓撲異構酶作用機理Function Mechanism of Topoisomerase I14Top II (gyrase) ATP neededCutting & ligation of D. S. DNAtetramer 每次L o

9、f 2緊縮B-雙螺旋引入負超雙螺旋Cut D.S. DNAATPLigateAABB15Function Mechanism of Topoisomerase II 162-2 基因和基因組一、基因、基因組的概念二、基因組的大小與C值矛盾三、基因組的復性動力學四、重復序列五、真核與原核生物基因組比較17指DNA分子所攜帶遺傳信息總和，即指一個細胞所有基因和基因間DNA的總和，稱基因組。遺傳學定義為：一個物種的單倍體的染色體的數目為該物種的基因組。在真核生物中，每種生物的單倍體基因組的DNA總量是恒定的，稱之為C值。一、基因、基因組的概念產生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列，在遺傳學

10、上也稱順反子（cistron）。 (二)基因組(三)C值一個單倍體基因組中DNA的總量(一)基因18霉菌藻類G+細菌G-細菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類賴皮類甲殼類昆蟲類軟體動物蠕蟲類真菌枝原體C value paradoxof nucleotide A 生物體進化程度高低與C值的相關性不強 B 親緣關系相近的生物C值相差較大 低等生物單倍體基因組DNA的含量與生物復雜性呈正相關，但高等生物這種關系并不一致。19真核生物 DNA 染色體數 （2C） （2N）兩棲鯢 168.0 pg 24肺魚 100 38蠑螈 85.3 24警蛙 28.2 24牛 6.4 60人 6.4 46

11、綿羊 5.7 54果蠅 0.2 8貝母 196.7 24豌豆 28 12玉米 11 20原核生物 DNA （C）Salmonella 0.0143 pg(沙門氏菌)E.coli 0.0040T2 0.00022 0.0000055174 0.000005這種形態學的復雜程度與C值大小的不一致稱為C值矛盾。20三、基因組的復性動力學 Hydroxyapatite column 羥基磷灰石柱Low C of PHigh C of Prelease D.S. DNA absorb D.S. DNA21復性發生的過程的討論dCt / dt = -KC2 反應初始 t = 0 單鏈DNA的隨機碰撞 過程

12、（ randomly collision ）（二級反應動力學）單鏈 DNA濃度 = C0反應達 t 時單鏈DNA濃度 = Ct 兩條部分同源(小于20dNt)的S.S. DNA, 在復性過程中形成的部分雙鏈區是不穩定的22 dCt / dt = -KCt2 積分 Ct / C0 = 1 / 1+KC0t 當 Ct / C0 = 1/2 時Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)K = 1 / Cot(1/2)Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 任一DNA分子達到Ct / C0 = 的速率是定值230101C0t(1/2) C0t(1/2) Fra

13、ction reassociated在控制反應條件相同的前提下, 兩種DNA分子的C0t(1/2)值,取決于dNt 的排列復雜性 。 AAAAAAAA K. C. = 1 C0t(1/2) = 210-6ATCGATCGATCG K.C. = 4 K.C. = 5 105 C0t(1/2) = 1( 復性動力學的復雜性，Kinetic complexity，K.C )24Eukaryotic genomes have several sequence components25變性程度 部分變性的DNA可直接通過拉鏈作用迅速復性，而完全變性的DNA一般需要幾個小時才能復性。 除溫度、離子強度、p

14、H等變性條件外，影響復性的因素有：DNA的濃度 濃度越大有效碰撞的頻率越高。DNA分子大小 越小的分子復性越快。DNA復雜性(complexity) 指最長的沒有重復序列的核苷酸對數之和。ATATATATATAT的復雜性為2；ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC的復雜性為4；ATGCATGCCTCAGTATGCATGCATGC的復雜性為10；ATGCTGACGTAGCA的復雜性為14。序列復雜的DNA更容易發生非對應配對，所以復雜性越高的DNA復性越困難。263.高度重復序列（Highly repetitive sequence）四、重復序列單一序列（Unique

15、sequence） 主要是蛋白質編碼基因。2.中度重復序列（Moderately repetitive sequence）包括rRNA、tRNA、組蛋白的編碼基因。研究較多的是Alu家族。長度不到10bp，多是串聯集中分布，一般不轉錄。有些AT含量很高的高度重復序列，在離心時常會在主要的DNA帶的上面有一個次要的DNA帶相伴隨，這就是所謂的“衛星DNA”27 著絲點（centromere）功能必需的DNA序列約130bp長，并富含A=T堿基對；在著絲點附近，還有高度重復的衛星DNA。 端粒（telomere）順序長約100bp，起到穩定染色體的作用。是由： 5(Tx Gy)n x約為14 3(

16、Ax Cy)n y約為18反向重復序列（Inverted repetitive sequence） 又稱回文序列（Palindrome）,易形成發夾結構，在DNA雙鏈中可能形成十字形結構。 CATGAACGTCCTATTGTCGGACGTTCTGA GTACTTGCAGGATAACAGCCTGCAAGACT28基因家族：真核生物基因組中有許多來源相同、結構相似、功能相關的基因，這樣一組基因稱為基因家族。（4）有些可以編碼蛋白質，在某些基因的轉錄中作為調控成分。五. 斷裂基因（split gene）也叫不連續基因，指在真核生物中，大多數編碼蛋白質的基因是不連續的，即基因的編碼序列之間插入了不編碼

17、的序列，稱為斷裂基因。內含子的意義：（1）可能是遺傳的殘留物。（2）Walter Gilbert假說：是使蛋白質進化過程的殘跡。（3）可以保護基因家族中基因的完整性。29五、真核與原核生物基因組比較（ P78 ） 作為總結性的問題，課后總結。同時掌握斷裂基因、假基因、內含子、外顯子的概念。302-3染色體312-3染色體一、組成1. 核小體（nucleosome）：染色質是由重復單位構成的，每個重復單位由約200bp的DNA和H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成，這個重復單位叫核小體。2. 組蛋白（histone）五種： H1、H2A、H2B、H3、H4。呈堿性。除了H1以外，其余四種有相互

18、作用形成聚合體的趨勢。它們通過C端的疏水氨基酸相互結合，而N端的堿性氨基酸則向四面伸出以便與DNA分子相互作用。323.構成：每個核小體含8個組蛋白；200bp DNA中，146bp 緊緊纏繞著組蛋白，其余用于連接兩個核小體，稱為連接DNA（linker DNA）。H1通常和連接DNA相結合，把核小體“封鎖”起來。334. 核小體包裝的高級形式343536（1）核小體（壓縮比為7，200bp長為68nm，壓縮后為10nm ） （2）30nm的核小體纖維（30nm fiber，壓縮比為40）。（3）染色體DNA的某一部分和“核骨架”（nuclear scaffold）相連，把染色體DNA隔成許多含20000至100000堿基對的DNA環。（4）約6個環與核骨架形成一個梅花結，每30個梅花結形成一盤。一條染色單體大約有10盤。4. 核小體包裝的高級形式37染色體模型基于的原理：真核染色體DNA包裝好象是一次纏繞再接一次更高級的纏繞。即在螺旋上形成螺旋，再形成螺旋。38名詞解釋DNA的拓撲異構體，DNA拓撲異構酶，基因，基因組，C值，C值悖理，衛星DNA，基因家族，斷裂基因，內含子，外顯子，假基因，核小體判斷：1.DNA拓撲異構酶能夠切開DNA的1條鏈，而DNA拓撲異構酶能同時切開DNA的2條鏈，但都可以使DNA產生正向超