1、第三章 高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography (HPLC)1一、高效液相色譜法的特點1. 高效液相色譜法概述22. 高效液相色譜與氣相色譜的比較GCHPLC應用范圍熱穩定、低沸點的物質熱不穩定、高沸點、離子型的物質熱力學理論較成熟正在發展中分析成本低高分離能力與柱的類型有關較高33. 高效液相色譜法與經典液相色譜法的比較 經典液相色譜法高效液相色譜法粒徑(m)75-6003-50（常用5-10）柱前壓力(atm)0.01-1.020-300分析時間 (h)1-200.05-1.0色譜柱長度(cm)50-2002-30柱效(塊/m)2-501

2、04-105樣品用量(g)1-1010-6-10-244. 高效液相色譜法的特點高壓高速高效高靈敏度55. 應用舉例丹參Radix Salviae Miltiorrhizae6丹參的HPLC指紋圖譜7二、高效液相色譜理論基礎H=A+B/u+CuA=2dpB0C=?高效液相色譜中的速率方程8 遷移的流動相的傳質阻力9 滯留的流動相的傳質阻力10高效液相色譜中的速率方程渦流擴散項 縱向擴散 流動相傳質 滯留區傳質 固定相內傳質112. 對速率方程的討論選用細顆粒填料可獲高柱效流動相流速低，有利于達到高柱效選用黏度小的流動相有利于提高柱效溫度的影響液膜厚度的影響123. 柱外效應由于色譜柱之外的因素

3、引起的色譜峰的展寬，例如進樣系統、連接管路及檢測器的死體積等。13三、高效液相色譜儀1. 高效液相色譜儀流程14高效液相色譜儀152. 高壓輸液系統 往復泵原理示意圖 16往復泵17 梯度洗提梯度洗提 即程序控制流動相的組成，使在整個分離過程中，溶劑強度按照特定的變化規律增加。 優點：分離復雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內。 缺點：檢測器的使用受到限制，分析結果的重復性取決于流速的穩定性。柱子需進行再生處理。18溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A 高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖 梯度洗提流程19應用舉例203. 進樣系統 六通進樣閥結構示意圖

4、214. 分離系統色譜柱 包括柱管與固定相兩部分一般色譜柱長530cm，內徑為45mm凝膠色譜柱內徑312mm微柱內徑1-2mm，長1-5cm制備往內徑較大，可達25mm 以上225檢測系統 紫外檢測器示差折光檢測器熒光檢測器電導檢測器23 （1）紫外檢測器固定波長的紫外檢測器可變波長的紫外檢測器二極管陣列檢測器24固定波長的紫外檢測器25Z型流通池結構26 可變波長的紫外檢測器27 二極管陣列檢測器28二極管陣列檢測器之三維圖29二極管陣列檢測器之Isoabsorbance Plot 30響應特性選擇性檢測器，如芳烴類化合物的檢測靈敏度高，可檢測10-9g/mL的物質線性范圍寬，104-10

5、5對溫度及流動相的改變不敏感適合梯度洗提HPLC常規檢測器31應用舉例波長的選擇32 （2）示差折光檢測器結構33響應特性通用性檢測器低靈敏度基線易受溫度的影響不適合梯度洗提34熒光檢測器結構35響應特性選擇性檢測器。如PAH，蛋白質高靈敏度，比紫外高約1000倍適合梯度洗提36應用舉例37電導檢測器結構38響應特性選擇性檢測器，對離子型化合物有響應靈敏度高受溫度的影響不能梯度洗提39討論：液相色譜檢測器的選擇葡萄糖產品的含量測定地下水中酚類化合物的分析礦泉水中無機陰離子的測定痕量氨基酸的分析去痛片中有效成分的分析鏈烷基磺酸鹽的測定蛋白質的分子量測定40（5）幾種檢測器特性比較 示差折光紫外熒

6、光電導應用范圍通用選擇性高選擇性選擇性可否梯度淋洗不可可可不可線性范圍104105103104最小檢測量gngpgng對溫度敏感度敏感低低敏感溶劑使用情況無限制受限制受限制受限制41四、HPLC主要類型及其選擇 化學鍵合相色譜法 液固色譜法 離子對色譜法 離子色譜法 體積排阻色譜法 421. 化學鍵合相色譜法（1）分離機理正相鍵合相色譜法：固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強極性化合物。 分配機理：分配系數 x為溶質，M為溶劑 反相鍵合相色譜法：固定相的極性小于流動相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應用最廣泛43反相鍵合相色譜法的疏溶劑機理： 溶質進入極

7、性流動相后，排擠部分溶質分子，其疏水基團由于流動相的斥力推動而直接與非極性固定相上的烷基締合，構成單分子吸附層，這種作用時可逆的。當流動相極性減小時，這種疏溶劑斥力下降。44（2）固定相 疏水基團 如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等極性基團 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。45類型分離方式 應用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相分離糖類、核苷酸

8、、固醇等二醇基正相分離有機酸、排阻分蛋白質等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相pH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長常用固定相46應用舉例47（3）流動相表征溶劑特性的重要參數溶劑強度：溶劑分子與吸附劑的親合程度，越大，親合力約大。溶解度參數：衡量溶劑極性強度的指標，越大，極性越強。是溶劑和溶質分子間色散力、偶極力、接受質子或給予質子能力的總和。所以相近的混合溶劑，它的選擇性不同。極性參數P：溶劑與乙醇、二氧六環、硝基甲烷相互作用的度量，比較全面的反映了溶劑的性質。粘度：48溶劑EPxexdxn正己烷1.880.300.017.30.1四氫呋喃7.60.46

9、0.579.14.00.380.200.42乙腈37.50.340.6511.85.80.310.270.42甲醇32.70.540.9512.95.10.480.220.31水78.50.892110.20.370.370.2549 溶劑的選擇原則溶劑具有穩定的化學性質溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點不能太低溶劑的純度要高且價格便宜 50正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷 反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質子接受體甲醇，質子給予體乙腈，偶劑溶劑

10、四氫呋喃。51應用舉例522. 液固色譜法（1）分離機理 以固體吸附劑為固定相的液相色譜法。由于溶質分子和流動相分子在吸附劑表面的吸附活性中心上進行競爭吸附，這種競爭吸附形成不同溶質在吸附劑表面的吸附、解吸平衡。平衡常數的不同導致不同溶質得以分離。53 （2）固定相 極性固定相：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等 非極性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 54（3）流動相越大，洗脫力越強。合適的洗脫強度可通過混合溶劑來得到硅膠為固定相時：以弱極性的正構烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調節合適的洗脫強度。可用水對硅膠進行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑55舉例56（4）應

11、用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結構異構體和幾何異構體混合物的分離57應用舉例583. 離子對色譜法 （1）分離機理將一種或數種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜 59（2）固定相、流動相和離子對試劑固定相：多為C18,C8反相鍵合相流動相：以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等60 （3）應用有機酸、有機堿特別是強酸強堿的分析，如羧酸、磺酸

12、、胺類、酚類、藥物、染料等614. 離子色譜法 (1) 分離機理試樣中的離子與離子交換樹脂上的離子發生反應： 陽離子交換：樹脂SO3-H+M+=樹脂SO3-M +H + 陰離子交換：樹脂NR3+Cl-+X-=樹脂NR3+X -+Cl -不同的離子與樹脂離子的交換能力（親和能力）不同，親和力越大，離子越難洗脫，從而得以分離。62離子交換色譜與離子色譜的分離原理一樣離子色譜最大的改進是解決了微量組分的檢測問題 雙柱抑制型：在分離柱和檢測器之間加一個化學抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景電導，二是增加被測離子的電導值，改善信噪比。靈敏度高。 單柱非抑制型：淋洗液直接進入電導檢測器。簡單、分辨率

13、較好。6364（2）固定相 離子交換劑，最常用的是乳膠薄殼型離子交換樹脂小球，根據功能基可分為：強酸型（磺酸基團）、強堿型（季銨基）、弱酸型（羧酸）、弱堿型（伯、仲、叔胺）65（3）流動相 雙柱抑制型：分離陽離子，一般采用無機酸如HCl，HNO3等；分離陰離子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。 單柱非抑制型：分離陽離子，用低濃度的HCl，HNO3等；分離陰離子，可用苯甲酸及其鹽、酒石酸、檸檬酸等66 （4）應用分析無機陰離子的首選方法還可用于分析無機陽離子，有機酸、堿，糖類、蛋白質等。67應用舉例685. 體積排阻色譜法（SEC） (1) 分離原理以多孔凝膠為固定相，利用精確控制的

14、凝膠孔徑，使樣品中不同分子大小的組分得以分離。 VR=V0+KDVp 0KD1.0洗脫體積在V0 和V0 +Vp之間，峰容量有限，10-12個峰用于分離分子大小差大于10%的樣品69分離原理示意圖70使用水溶液的凝膠過濾色譜法（GFC），主要用于分析多肽、蛋白質、核酸、多糖等。使用有機溶劑的凝膠滲透色譜法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的測定71（2）固定相軟質凝膠：如交聯葡聚糖等，水相分離生化體系，適于低、中壓操作半剛性凝膠：較高交聯度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有機相洗脫，可承受10Mpa的壓力硬質凝膠高交聯度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝膠滲透色譜法多孔球形硅膠：凝膠過

15、濾色譜法、凝膠滲透色譜法羥基化聚醚多孔微球：凝膠過濾色譜法72 （3）流動相改善分離主要通過固定相來實現。流動相的選擇原則是：溶解樣品、與凝膠浸潤、與檢測器匹配、粘度小。如四氫呋喃；緩沖溶液73（4）應用大分子的分離分析聚合物分子量分布的測定74應用舉例1.聚乙二醇40000 2.聚乙二醇100003.聚乙二醇3000 4.聚乙二醇1000 5.聚乙二醇756. 液相色譜分離類型及條件選擇選擇合適的液相色譜分離類型 了解分析對象要分析的組分的大致濃度干擾物質 試樣的性質結構分子量酸堿性溶解性76 溶于水排阻色譜，水為流動相 相對分子質量 2000 不溶于水排阻色譜，非水流動相 同系物鍵合相色譜

16、 不溶于水 異構體液固色譜樣品 分子大小差異排阻色譜 反相鍵合相色譜 相對分子質量 溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動相 堿陽離子色譜 溶于水，可離解 酸陰離子色譜 溶于水，離子與非離子反相離子對色譜 77選擇合適的分析條件色譜柱流動相檢測器的種類及條件（波長等）樣品的預處理方法78標準銀杏提取物中中銀杏內酯的含量測定6%的內酯，24%的黃酮不汽化紫外末端吸收復雜、基體干擾較多舉例79醇溶性、中性：反相鍵合相色譜法無紫外吸收：RI、 ELS、 MS含量低：ELSD、MS干擾大：凈化，SPE、SFE80反相鍵合相色譜法色譜柱：C18柱流動相：H2OMeOH THF (70:20:10)

17、檢測器：RI detector內標法定量81討論液相色譜方法及主要分析條件選擇1. 地下水中酚類化合物的分析2. 礦泉水中無機陰離子的測定3. 去痛片中有效成分的分析4. 鏈烷基磺酸鹽的測定5. 蛋白質的分子量測定6. 磷脂Phospholipids的分離與分析82色譜分析方法及條件選擇 了解分析對象 明確分析要求 查找相關文獻 確定分析方法 選擇樣品前處理方法 優化分析條件 方法學驗證 樣品測試83奶制品中三聚氰胺的檢測方法主要難點：常壓熔點354（分解），弱堿性，強極性 奶制品干擾多841. 高效液相色譜分析方法離子對色譜法樣品預處理1) 沉淀離心去蛋白2) 固相萃?。宏栯x子交換固相萃取柱85未經樣品前處理的奶粉樣品經預處理后的奶粉樣品86色譜柱： Polaris C18-A （4.6X250mmX5m）緩沖液： 10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉流動相： 緩沖溶液:乙腈=85:15進樣量： 10uL流速： 1.0mL/min柱溫： 40波長： 240nm872. 液相色譜-質譜聯用LC 參考條件a) 色譜柱：強陽離子交換與反相