1、第 五 章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能轉(zhuǎn)錄因子 目 錄引 言第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)及其研究方法第三節(jié) 一些常見(jiàn)的植物轉(zhuǎn)錄因子 第四節(jié) 動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄因子MyoD 第五節(jié) 熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF 第六節(jié) 一些轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例第七節(jié) 人工轉(zhuǎn)錄因子 引 言轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞內(nèi)一類重要的基因表達(dá)調(diào)控蛋白質(zhì)，它通過(guò)與基因上游啟動(dòng)子區(qū)中特異的DNA序列的相互作用，來(lái)決定被調(diào)控基因的開(kāi)啟和關(guān)閉以及表達(dá)量。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)基因的表達(dá)，而一個(gè)基因的表達(dá)又可受數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子水平的輕微變化，即會(huì)對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生重大影響。 引 言轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能缺陷，與人類的一些疾病（如腫瘤和炎癥）相關(guān)；

2、許多轉(zhuǎn)錄因子還是藥物作用的靶點(diǎn)。所以，轉(zhuǎn)錄因子活性的檢測(cè)對(duì)疾病的研究和藥物開(kāi)發(fā)都具有非常重要的意義。人工轉(zhuǎn)錄因子的研究和開(kāi)發(fā)，將在基礎(chǔ)研究、腫瘤等疾病的基因治療以及抗病毒治療等領(lǐng)域開(kāi)辟一個(gè)嶄新的途徑。 第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF），也稱反式作用因子，是指那些具有同真核生物啟動(dòng)子特定DNA序列結(jié)合活性的蛋白質(zhì)分子，或者是具有已知DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子。通過(guò)它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子一般含有4個(gè)功能區(qū)：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活和抑制域）、核定位信號(hào)以及寡聚化位點(diǎn)。

3、但是，不同的轉(zhuǎn)錄因子可能缺少某一結(jié)構(gòu)域（如轉(zhuǎn)錄調(diào)控域或特異的DNA結(jié)合域）。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)這些功能區(qū)域，在特定的時(shí)間進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與啟動(dòng)子順式作用元件或與其它轉(zhuǎn)錄因子的功能區(qū)域相互作用，來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)一、轉(zhuǎn)錄因子常見(jiàn)的基本結(jié)構(gòu)二、轉(zhuǎn)錄因子的種類一、轉(zhuǎn)錄因子常見(jiàn)的基本結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄因子有一個(gè)共同的特性，即由不同的功能結(jié)構(gòu)域組成可調(diào)變的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而這些功能結(jié)構(gòu)域從蛋白總體分離出來(lái)后，無(wú)論是單獨(dú)作用還是與其它來(lái)源的蛋白連接后，仍保持原有的功能。一、轉(zhuǎn)錄因子常見(jiàn)的基本結(jié)構(gòu)1、DNA結(jié)合域2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域3、核定位信號(hào)4、寡聚化位點(diǎn)1、DNA結(jié)合域DNA結(jié)合域，是指轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別

4、順式作用元件，并與之結(jié)合的一段氨基酸序列。通常由60100個(gè)氨基酸殘基組成。在相同類型的轉(zhuǎn)錄因子中，DNA結(jié)合域氨基酸序列較為保守。DNA與蛋白質(zhì)之間的相互識(shí)別，取決于DNA堿基對(duì)的外緣和氨基酸側(cè)鏈之間的相互作用。在DNA雙鏈中，互補(bǔ)堿基的外緣暴露于雙螺旋結(jié)構(gòu)外側(cè)，形成具有氫鍵供體和氫鍵受體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)可以被氨基酸側(cè)鏈所識(shí)別，并且是DNA-蛋白質(zhì)之間進(jìn)行特異性識(shí)別所必需的。1、DNA結(jié)合域DNA結(jié)合域帶共性的結(jié)構(gòu)主要有以下幾種： HTH和HLH結(jié)構(gòu)：-螺旋可與DNA的溝槽相互作用。 鋅指結(jié)構(gòu)：見(jiàn)于TF IIIA和類固醇激素受體中。鋅指上的堿性氨基酸與DNA的磷酸基有相互作用。鋅指結(jié)構(gòu)家

5、族的蛋白又可分為鋅指、鋅紐、鋅簇三類。 幾種鋅指結(jié)構(gòu) 1、DNA結(jié)合域 Leu-拉鏈結(jié)構(gòu)：見(jiàn)于真核生物DNA結(jié)合蛋白的C端。兩條肽鏈呈鉗狀與DNA相結(jié)合；拉鏈兩側(cè)的堿性氨基酸與DNA的磷酸基有相互作用。有的轉(zhuǎn)錄因子含有多個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域的特定氨基酸序列，決定了它們與順式作用元件識(shí)別及結(jié)合的特異性。 Leu-拉鏈結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域同一家族轉(zhuǎn)錄因子的主要區(qū)別在于：它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域各不相同。轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域可以分為兩種： 轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain） 轉(zhuǎn)錄抑制域（transcription repression d

6、omain）它們決定了轉(zhuǎn)錄因子功能的差異。 2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域該結(jié)構(gòu)域常見(jiàn)有4種特征類型： 富含酸性氨基酸； 富含脯氨酸； 富含谷氨酰胺； 富含絲氨酸/蘇氨酸。有的轉(zhuǎn)錄因子可同時(shí)具有幾個(gè)激活結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可能是轉(zhuǎn)錄因子與其它蛋白質(zhì)接觸作用的區(qū)域。 3、核定位信號(hào)核定位信號(hào)（NLS），是轉(zhuǎn)錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的核定位區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程受該區(qū)域的調(diào)控。不同轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號(hào)序列、所處的位置、數(shù)量有所不同。有些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程，是通過(guò)1至數(shù)個(gè)核定位信號(hào)進(jìn)行的；而沒(méi)有NLS區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子則借助于與具有NLS區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用進(jìn)入細(xì)胞核。4、寡聚化位點(diǎn)寡聚化位點(diǎn)，是不同轉(zhuǎn)

7、錄因子借以發(fā)生相互作用的功能區(qū)域。它們的氨基酸序列很保守，大多與DNA結(jié)合域相連，并形成一定的空間構(gòu)象。不同轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)寡聚化位點(diǎn)發(fā)生相互作用，形成異源或同源寡聚化物，以影響其DNA結(jié)合特異性、結(jié)合能力以及在細(xì)胞核內(nèi)的定位。 二、轉(zhuǎn)錄因子的種類 各種不同的轉(zhuǎn)錄因子，依據(jù)它們所具有的特殊的DNA結(jié)合模式而分成不同的大家族。因?yàn)樵S多轉(zhuǎn)錄因子可形成同二聚體和異二聚體，所以各大家族據(jù)此可進(jìn)一步細(xì)分成亞家族。正是由于許多轉(zhuǎn)錄因子能異二聚體化，從而極大地增加了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的多樣性和特異性。 二、轉(zhuǎn)錄因子的種類在真核生物中，基因的轉(zhuǎn)錄起始涉及兩類轉(zhuǎn)錄因子： 一般性轉(zhuǎn)錄因子（general transcripti

8、on factor，非特異性轉(zhuǎn)錄因子或基本轉(zhuǎn)錄因子）：是RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組因子，為所有mRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)共有。它們的主要作用是，在啟動(dòng)子的TATA-box區(qū)與RNA聚合酶組裝，形成轉(zhuǎn)錄的起始復(fù)合物，激活所有基因的轉(zhuǎn)錄。二、轉(zhuǎn)錄因子的種類真核生物中存在的三種RNA聚合酶，分別有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，即TF I、TF II、TF III。其中，TF II有幾個(gè)亞類：TF II A、B、D、E、F、G/J、H和I；TF II D是唯一能識(shí)別啟動(dòng)子TATA-box，并與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子；而TF II B則可促進(jìn)聚合酶II與啟動(dòng)子的結(jié)合。 二、轉(zhuǎn)錄因子的種類 特異性轉(zhuǎn)錄因子（specific t

9、ranscription factor）：也是一種DNA結(jié)合蛋白，是能夠選擇性調(diào)控某種或某些基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白質(zhì)因子。它和DNA上其它調(diào)節(jié)元件結(jié)合，只能激活特定的基因轉(zhuǎn)錄，為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所必需，決定該基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)。第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)及其研究方法 一、轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)二、轉(zhuǎn)錄因子的研究方法 轉(zhuǎn)錄因子作用示意圖一、轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn) 同一DNA順式作用元件可被不同的轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別； 同一轉(zhuǎn)錄因子也可識(shí)別不同的DNA順式作用元件； TF與TF之間存在相互作用； 當(dāng)TF與TF、TF與DNA 結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致構(gòu)象改變； TF在合成過(guò)程中，有較大的可變性和可塑性。二、轉(zhuǎn)錄因子的研究方

10、法根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)，可采取不同方式來(lái)研究各種轉(zhuǎn)錄因子。DNA芯片技術(shù)，也稱DNA微列陣技術(shù)（DNA microarray），是研究轉(zhuǎn)錄因子的方法之一。它是將不同序列的核酸樣品高密度排列在載體上，然后將各種可能的轉(zhuǎn)錄因子與之進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)分析結(jié)合信號(hào)來(lái)研究二者相互作用的特點(diǎn)。 二、轉(zhuǎn)錄因子的研究方法與傳統(tǒng)的“單基因” 技術(shù)比較，微陣列具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)能在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)數(shù)千個(gè)基因表達(dá)譜的差異進(jìn)行平行分析，從而可以對(duì)基因進(jìn)行大量、快速、平行研究，實(shí)現(xiàn)高通量篩選；而且，還可得出其所篩選出的特異性配基的相對(duì)親和力信息。 轉(zhuǎn)錄因子的DNA芯片技術(shù)研究第三節(jié) 一些常見(jiàn)的植物轉(zhuǎn)錄因子 一、植物中

11、常用的特異性轉(zhuǎn)錄因子二、植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子Dof一、植物中常用的特異性轉(zhuǎn)錄因子不同逆境相關(guān)基因的啟動(dòng)子往往含有相同的順式作用元件，顯示可以受到相同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因可以通過(guò)調(diào)控一系列與逆境相關(guān)的功能基因的表達(dá)，從而明顯提高植物對(duì)逆境的抵抗能力。因此，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子提高植物的抗逆性研究己經(jīng)成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。一、植物中常用的特異性轉(zhuǎn)錄因子 1、bZIP類轉(zhuǎn)錄因子2、ERF類轉(zhuǎn)錄因子3、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子4、MYB類轉(zhuǎn)錄因子1、bZIP類轉(zhuǎn)錄因子堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子是普遍存在于動(dòng)、植物及微生物中的一類轉(zhuǎn)錄因子。bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，可識(shí)別含核心序列ACGT的順式作用元件，如

12、CACGTG（G盒）、GACGTC（C盒）、TACGTA（A盒）等。一些受光或脫落酸（ABA）誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子區(qū)都含有這些元件。1、bZIP類轉(zhuǎn)錄因子G盒元件普遍存在于受ABA、生長(zhǎng)素、茉莉酸、水楊酸誘導(dǎo)的基因中，這證明它與植物的抗逆性有關(guān)。G盒元件還是光誘導(dǎo)基因中最常見(jiàn)的順式作用元件之一，能激活光誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。2、ERF類轉(zhuǎn)錄因子乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子（ERF），最先是從煙草中，作為GCC-box結(jié)合蛋白分離出來(lái)的。ERF蛋白具有一個(gè)高度保守的含58或59個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合域。在擬南芥基因組中，有124個(gè)ERF 基因，參與對(duì)低溫、干旱、病原體及其誘發(fā)因子的反應(yīng)，構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族。

13、這類基因家族在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、抗病、抗脅迫以及次生代謝等方面起著非常重要的作用。該家族現(xiàn)只在高等植物中被發(fā)現(xiàn)。3、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子WRKY是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的又一種植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。這類蛋白含有12個(gè)保守的60個(gè)氨基酸的WRKY結(jié)構(gòu)域。幾乎所有WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì) （T）（T）TGACC（C/T）（即W框）都有結(jié)合特性。從歐芹中分離到的Pc WRKY I 基因的啟動(dòng)子，即含有3個(gè)TTGACC/T核心序列的類W框，這說(shuō)明WRKY蛋白具有自我調(diào)節(jié)能力。3、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子許多WRKY蛋白在病原體侵染反應(yīng)和其它應(yīng)激反應(yīng)中起作用。有的WRKY蛋白在調(diào)控衰老中起作用，它們高水平的超表達(dá)可引起生長(zhǎng)遲緩

14、和其它抗性相關(guān)基因的表達(dá)。4、MYB類轉(zhuǎn)錄因子MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族，是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子。MYB結(jié)構(gòu)域是一段約51或52個(gè)氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。MYB蛋白的共同特征是：N-端高度保守，通常由2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域（R2、R3）或3個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域（R1、R2、R3）構(gòu)成。4、MYB類轉(zhuǎn)錄因子絕大多數(shù)的MYB轉(zhuǎn)錄因子可以起到轉(zhuǎn)錄激活的作用，但有的MYB轉(zhuǎn)錄因子也可以降低目的基因的表達(dá)。在擬南芥和玉米中都存在著大量的MYB轉(zhuǎn)錄因子，它們是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，并在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著多方面的重要作用。4、MYB類轉(zhuǎn)錄因子從轉(zhuǎn)錄層面上來(lái)說(shuō)，同一種脅迫可能會(huì)同

15、時(shí)激活多條途徑（多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與）；而同一轉(zhuǎn)錄因子也可能會(huì)由多種脅迫激活。從功能基因?qū)用嫔蟻?lái)說(shuō)，同一轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)同時(shí)激活多種功能基因；而同一功能基因也可能由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，因?yàn)樗膯?dòng)子區(qū)域可能存在不止一種順式作用元件。 二、植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子Dof Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。Dof類轉(zhuǎn)錄因子在植物中發(fā)揮著多種功能。其N末端是獨(dú)特和保守的，富含Cys殘基的單鋅指Dof結(jié)構(gòu)域，是既與DNA又與蛋白相互作用的雙重功能域，識(shí)別 的核心序列是AAAG；其C末端氨基酸序列較為多變，是Dof蛋白的特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域。擬南芥和水稻的

16、Dof轉(zhuǎn)錄因子家族為Aa、Bb、Cc、Dd這4個(gè)同源基因群，而同類群間可能有相似或相反的功能。二、植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子Dof1、Dof蛋白的結(jié)構(gòu)2、與Dof蛋白結(jié)合的DNA序列特異性 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用4、Dof蛋白的生物學(xué)功能 1、Dof 蛋白的結(jié)構(gòu)Dof蛋白僅在其N末端有1個(gè)52個(gè)氨基酸組成的高度保守的Dof結(jié)構(gòu)域，在此結(jié)構(gòu)域中CX2CX21CX2C基序形成一個(gè)單鋅指結(jié)構(gòu)，在此單鋅指結(jié)構(gòu)中，1個(gè)Zn2+與4個(gè)Cys殘基共價(jià)配位結(jié)合。Zn2+和Cys殘基對(duì)Dof蛋白的活性是必需的，二價(jià)離子螯合劑的存在以及對(duì)Cys殘基的任何替換都會(huì)使Dof蛋白失活。1、Dof 蛋白的結(jié)構(gòu)不同D

17、of蛋白，在與DNA結(jié)合的Dof結(jié)構(gòu)域中，除了單鋅指與DNA結(jié)合外，在鋅指旁邊C側(cè)鏈狀結(jié)構(gòu)中，某些特定氨基酸也參與和DNA的結(jié)合，這些細(xì)微的特征有可能決定和不同的DNA序列的結(jié)合。Dof蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域位于C末端，如玉米的ZmDof1的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域是位于C末端的44個(gè)氨基酸殘基；其它Dof蛋白，如擬南芥的OBP1、OBP2、OBP3和大麥的BPBF在C末端也有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。1、Dof 蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列較為多變，不具保守性，這與Dof蛋白功能的多樣性是一致的。綜上所述，Dof蛋白通常包含2個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)位于N末端的保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)位于C末端的調(diào)控結(jié)構(gòu)

18、域。在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通常還有1個(gè)Ser骨架，可能作為分子鉸鏈，連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。Dof蛋白的基本結(jié)構(gòu) 2、與Dof蛋白結(jié)合的DNA序列特異性Dof蛋白以其Dof結(jié)構(gòu)域與不同的植物特異性基因的啟動(dòng)子相互作用。在每一個(gè)Dof蛋白的DNA結(jié)合序列中，均存在AAAG序列（只有個(gè)別例外，如南瓜中的Dof蛋白AOBP識(shí)別AGTA序列），而且在這個(gè)序列上的任何單個(gè)突變都會(huì)取消Dof蛋白與DNA結(jié)合的特性，這說(shuō)明AAAG序列是Dof蛋白識(shí)別的核心序列。2、與Dof蛋白結(jié)合的DNA序列特異性而AAAG的數(shù)目對(duì)Dof與DNA的結(jié)合能力也有影響：2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的AAAG基序表現(xiàn)出的DNA親和 力比1個(gè)AAAG基序約

19、高2倍。外側(cè)序列對(duì)Dof-DNA相互作用也有影響，不過(guò)，是有限的，僅在某種程度上影響二者相互作用。其它轉(zhuǎn)錄因子與之發(fā)生蛋白-蛋白之間的相互作用，以及轉(zhuǎn)錄后的修飾對(duì)Dof蛋白與其靶序列的特異性相互作用也有影響。 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用Dof結(jié)構(gòu)域是一個(gè)雙功能的結(jié)構(gòu)域，它不僅介導(dǎo)與DNA的結(jié)合，而且還介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用。這種作用通常影響與DNA的結(jié)合，有時(shí)Dof與其它轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與DNA的協(xié)同結(jié)合作用共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用Dof蛋白與高遷移性染色質(zhì)蛋白（chromatin-associated high mobility group，HMG）之

20、間有相互作用，不同HMG蛋白提高Dof蛋白的DNA結(jié)合性的程度不同。不同家族的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行的復(fù)合調(diào)控，可能是對(duì)轉(zhuǎn)錄因子在體外與體內(nèi)作用有差異的一個(gè)比較合理的解釋。Dof結(jié)構(gòu)域的雙重功能可能有助于其在體內(nèi)對(duì)靶基因的正確激活或抑制。3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用除Dof結(jié)構(gòu)域外，Dof蛋白的C端區(qū)域也是與其它蛋白作用的區(qū)域。與保守的Dof結(jié)構(gòu)域不同，C末端變化多樣，它很可能通過(guò)與不同類型調(diào)控蛋白或物質(zhì)的反應(yīng)，受不同途徑信號(hào)的調(diào)控而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。這種多樣性可能是Dof功能多樣性的基礎(chǔ)之一。 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用玉米Dof1、擬南芥OBP13和大麥PBF的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域定位于每

21、個(gè)蛋白多變的C末端。玉米Dof1的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)不僅作用于植物細(xì)胞，也作用于動(dòng)物和酵母細(xì)胞。大麥PBF和SAD（scutellum and aleurone-expressed Dof）還與動(dòng)、植物中均存在的MYB轉(zhuǎn)錄因子相互作用。MYB結(jié)合位點(diǎn)和Dof結(jié)合位點(diǎn)對(duì)MYB蛋白激活靶基因的轉(zhuǎn)錄都是必需的，這表明靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控受多個(gè)調(diào)控因子協(xié)同作用。 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用作為轉(zhuǎn)錄因子，Dof蛋白不僅通過(guò)Dof結(jié)構(gòu)域直接與DNA結(jié)合，并在此區(qū)域與其它調(diào)控因子或蛋白結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)與DNA結(jié)合而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，而且與其它許多轉(zhuǎn)錄因子一樣，在C末端專門有與其它蛋白或因子結(jié)合激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域

22、。這些不同位點(diǎn)調(diào)控的組合可能是Dof蛋白功能多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。4、Dof蛋白的生物學(xué)功能在多種植物特異性基因的啟動(dòng)子中都發(fā)現(xiàn)有Dof蛋白結(jié)合元件，這表明Dof蛋白有多種功能，參與植物多種生命活動(dòng)的調(diào)控。第四節(jié) 動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄因子MyoD 轉(zhuǎn)錄因子家族，通常是由各種同源和異源的二聚體亞基組成。它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有不同的調(diào)控作用，這取決于細(xì)胞接受的刺激和信號(hào)因子的存在。因此，可通過(guò)檢測(cè)在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控作用中含有哪些轉(zhuǎn)錄因子家族成員，以幫助鑒定和提供潛在的基因有用信息。第四節(jié) 動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄因子MyoDmyoD 基因的全稱是myogenic differentiation antigen（成肌分化抗原），是以其

23、命名的一個(gè)調(diào)控成肌細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員。該家族成員的時(shí)空表達(dá)具有特異性，但是都參與成肌細(xì)胞的分化和特化過(guò)程，是對(duì)于肌肉組織發(fā)育具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子家族。單向分化（肌細(xì)胞分化涉及轉(zhuǎn)錄因子的次序表達(dá)）示意圖 第四節(jié) 動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄因子MyoD通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)的方法，確定了人的MyoD家族的4個(gè)成員：MyoD、Myogenin （Myf4）、 Myf5和Mrf4。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上類似的區(qū)域就是與DNA結(jié)合并且激活成肌作用的區(qū)域。從體節(jié)細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞時(shí)，需MyoD和Myf5兩種蛋白，而從成肌細(xì)胞合并發(fā)育分化為成熟的骨骼肌細(xì)胞則依賴于myogenin 基因。細(xì)胞融合前只有myoD 及myf5基因

24、表達(dá)，myogenin 基因只有在細(xì)胞融合發(fā)生后，才能表達(dá)，且受myoD 及myf5表達(dá)的誘導(dǎo)。 myoD 家族基因敲除對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞分化發(fā)育的影響 第四節(jié) 動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄因子MyoDMyoD家族在肌肉細(xì)胞系的分化特化過(guò)程中有重要作用，它們只表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞和它們的前體細(xì)胞中，非肌肉細(xì)胞系中MyoD家族成員的表達(dá)會(huì)被其它特異性的基因抑制。但myoD 基因可以激活自身的表達(dá)，這對(duì)于保持成肌作用具有重要意義。 第四節(jié) 動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄因子MyoD一、myoD 基因的定位二、myoD 基因的結(jié)構(gòu)與功能一、MyoD基因的定位 利用分子雜交的方法，將myoD 基因定位于人類的第11號(hào)染色體上，還利用小鼠的探

25、針做了檢測(cè)并顯示出相同的結(jié)果。進(jìn)一步研究將其定位在染色體11p15.4p15.1區(qū)域，但是利用熒光原位雜交（FISH ）的方法定位，結(jié)果是其位于11p14.3區(qū)域。 在不同生物中的這些表達(dá)和定位的結(jié)果顯示了，標(biāo)志性基因都包含myoD ，這為研究myoD 基因的表達(dá)和具體功能提供了方法和方向。 小鼠11.5天的胚胎圖（示myoD 基因的表達(dá)分布） 熒光原位雜交定位人類myoD 基因示意圖 非洲爪蟾發(fā)育尾芽時(shí)期X-myoD 的表達(dá) 原位雜交顯示myoD在斑馬魚(yú)中的表達(dá) 免疫染色和DAPI染色共定位二、myoD 基因的結(jié)構(gòu)與功能MyoD家族蛋白結(jié)構(gòu)上的最大特點(diǎn)是含有b-HLH結(jié)構(gòu)域。其中，Basic

26、結(jié)構(gòu)域是HLH螺旋結(jié)構(gòu)的延伸，也是這一家族蛋白與DNA相互作用的區(qū)域；而HLH螺旋結(jié)構(gòu)則是與許多其它因子相互作用的位點(diǎn)，是調(diào)控的重要區(qū)域。 MyoD的b-HLH結(jié)構(gòu)域 二、myoD 基因的結(jié)構(gòu)與功能在哺乳動(dòng)物中，MyoD能誘導(dǎo)肌細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄，與肌肉發(fā)育有緊密的相關(guān)性。MyoD家族蛋白在形成同源及異源二聚體后，可與基因調(diào)控區(qū)中的CANNTG序列（又稱E-box）相結(jié)合，通過(guò)DNA-protein相互作用，MyoD構(gòu)象發(fā)生改變，從而誘導(dǎo)肌細(xì)胞特異性的基因轉(zhuǎn)錄。 MyoD的作用過(guò)程 形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄 二、myoD 基因的結(jié)構(gòu)與功能前圖表明：MyoD及其它MRF（muscle

27、-related factor）與其它非組織特異性bHLH蛋白（如E2A）結(jié)合而成的異源二聚體，以及MEF （muscle-enhancer factor）同源二聚體，與調(diào)控元件E-box或MEF-box，或同時(shí)與二者結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。 總之，myoD 基因家族是一個(gè)與肌肉發(fā)育分化特化過(guò)程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它可以被多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控，對(duì)于維持體內(nèi)肌肉的生成和替代起著關(guān)鍵的作用。肌細(xì)胞分化與細(xì)胞周期 分裂中的成肌細(xì)胞不能分化 分化中的肌細(xì)胞不能分裂 第五節(jié) 熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF 熱休克基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，熱休克基因的表達(dá)受到一個(gè)重復(fù)DNA序列的可逆的順式負(fù)調(diào)

28、節(jié)（negative cis-acting control）。熱休克轉(zhuǎn)錄因子（ HSF，熱激蛋白）的結(jié)構(gòu)和功能在進(jìn)化中較少變異，因此具有廣泛的同源性，在真菌、果蠅、雞、人類等真核生物中都存在。熱休克蛋白（HSP）還可作為“分子伴侶”（molecular chaperone）參與其它蛋白的折疊。 第五節(jié) 熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF一、HSF的類別與功能二、HSF的結(jié)構(gòu)三、HSF活化及作用過(guò)程一、HSF的類別與功能 從HSF發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，隨著研究的深入及新技術(shù)的采用，在不同生物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的HSF及其基因，例如：人體內(nèi)有hHSF1、2、4，雞體內(nèi)有cHSF1、2、3，小鼠體內(nèi)有mHSF1、2；西紅

29、柿有3種HSF；而只有一種HSF的生物也 很多。HSF在熱應(yīng)激反應(yīng)中的主要功能是：在熱休克基因的表達(dá)過(guò)程中，與相應(yīng)啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，最終促進(jìn)HSP的表達(dá)。 一、HSF的類別與功能但在高等真核生物（如脊椎動(dòng)物及哺乳動(dòng)物）體內(nèi)，不同種類的HSF，雖然結(jié)構(gòu)上很相似，但功能上卻出現(xiàn)了不同程度的差異，在不同的應(yīng)激狀態(tài)下起作用。其中，只有HSF1是最有代表性、最具有完全意義的HSF，能在熱休克、氧化應(yīng)激、重金屬應(yīng)激等狀態(tài)下起作用，而其它HSF則不然，如：HSF2。HSF2對(duì)熱刺激信號(hào)耐受，能在精子形成和胚胎發(fā)育中起作用；它對(duì)代表生長(zhǎng)、發(fā)育、分化的信號(hào)更為敏感。一、HSF的類別與功能cHSF3

30、雖然也對(duì)熱刺激信號(hào)起反應(yīng)，但其活化閾值卻高于cHSF1，在較高溫度時(shí)仍能保持活性。而hHSF4似乎是一個(gè)通過(guò)減少熱休克蛋白效應(yīng)元件（HSE）結(jié)合位點(diǎn)，而專門起抑制作用的HSF，其生物學(xué)意義在于控制熱應(yīng)激反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡。 二、HSF的結(jié)構(gòu) 雖然從不同生物體內(nèi)分離出來(lái)的HSF分子種類和大小各有不同（如從酵母菌、果蠅、人類體內(nèi)分離出來(lái)的HSF，其分子量分別為：150、110、80 ku），但其結(jié)構(gòu)卻極為相似，共同具有一個(gè)極為保守的核心區(qū)域DNA結(jié)合區(qū)域（DNA binding domain）和三聚區(qū)域（trimerization domain）。 二、HSF的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合區(qū)域，靠近HSF的N末端，

31、位于HSF最保守的區(qū)域中。其晶體結(jié)構(gòu)與溶解狀態(tài)的結(jié)構(gòu)比較一致，都具有DNA結(jié)合蛋白特征性的helix-turn-helix motif，由3個(gè)螺旋（H1、H2和H3）和4個(gè)反向平行的片層（-sheet）（1、2、3和4）組成，其排列順序如下： 二、HSF的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合區(qū)域通過(guò)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)形成一個(gè)緊密的球形結(jié)構(gòu)。但與其它DNA結(jié)合蛋白（如：CAP）的DNA結(jié)合區(qū)域不同的是：HSF的DNA結(jié)合區(qū)域有一個(gè)螺旋凸起（-helical bulge）；一個(gè)由脯氨酸誘導(dǎo)的扭結(jié)（proline-induced kink），該扭結(jié)使H2發(fā)生明顯扭曲；在H2和H3之間有一段57個(gè)氨基酸的間隔。 二、HS

32、F的結(jié)構(gòu)對(duì)于非植物性來(lái)源的HSF，在3和4之間還有一個(gè)暴露的、易曲的可溶性環(huán)狀結(jié)構(gòu)。HSF的DNA結(jié)合區(qū)域，與DNA結(jié)合的部位起始于H1的N端后數(shù)個(gè)氨基酸處；終止位置對(duì)于不同的HSF并不一致，但多數(shù)終止位置位于4末端 之后的16個(gè)氨基酸處。二、HSF的結(jié)構(gòu)這16個(gè)氨基酸的功能，一方面是通過(guò)與疏水核心的相互作用，在空間結(jié)構(gòu)上封閉DNA結(jié)構(gòu)區(qū)域的一個(gè)側(cè)面；另一方面，是使HSF三聚體中各HSF單體的DNA結(jié)合區(qū)域相互協(xié)調(diào)，以獲得對(duì)熱休克元件（HSE）的高親和力。 DNA通過(guò)主溝與HSF結(jié)合，具體結(jié)合位點(diǎn)就是DNA上的HSE。HSF能識(shí)別HSE上特異性的“-nGAAn-”結(jié)構(gòu)，HSF單體與“-nGAA

33、n-”結(jié)構(gòu)以1:1的比例結(jié)合。熱激蛋白調(diào)控的基因表達(dá)二、HSF的結(jié)構(gòu)HSE上“-nGAAn-”結(jié)構(gòu)的數(shù)目，對(duì)HSF與HSE親和性有很大的影響。一個(gè)完整的HSE結(jié)構(gòu)上通常有3個(gè)“-nGAAn-”結(jié)構(gòu)，而完整的HSF也是以三聚體的形式與HSE結(jié)合，這樣的結(jié)合具有最大的親和力。若HSE上只有2個(gè)“-nGAAn-”結(jié)構(gòu)，兩者的親和力只能達(dá)到中等水平。許多物理學(xué)與遺傳學(xué)證據(jù)都表明，DNA結(jié)合區(qū)域螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)上的第3個(gè)螺旋（H3）起識(shí)別HSE上“-nGAAn-”結(jié)構(gòu)的作用。 二、HSF的結(jié)構(gòu)H3通過(guò)其極性及陽(yáng)性氨基酸殘基，在溶液中形成一個(gè)典型的雙岐性螺旋（Amphipathic helix），與D

34、NA通過(guò)離子鍵相互作用。當(dāng)HSF活化時(shí)，相互間需通過(guò)三聚區(qū)域結(jié)合形成HSF三聚體。相對(duì)于DNA結(jié)合區(qū)域，三聚區(qū)域位于HSF中部。三聚區(qū)域的特征性結(jié)構(gòu)是3個(gè)疏水七氨基酸重復(fù)序列（Hydrophobic heptad repeat array）。 二、HSF的結(jié)構(gòu)這3個(gè)序列由數(shù)目不等的七氨基酸重復(fù)（Heptad repeat）構(gòu)成。第1個(gè)序列較長(zhǎng)，有56個(gè)七氨基酸重復(fù)；第2和第3個(gè)序列較短，且基本上重疊在一起，前后只差一個(gè)氨基酸；第1個(gè)序列與 后兩個(gè)序列之間由QQQ基元（QQQ motif）隔開(kāi)。 每個(gè)七氨基酸重復(fù)單位的第一和第四個(gè)疏水氨基酸殘基，是螺旋型卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（Helical coiled

35、-coil structure）所特有的，可用于形成亮氨酸拉鏈（leucine zipper）。二、HSF的結(jié)構(gòu)但具有亮氨酸拉鏈的蛋白，通常形成同二聚體或異二聚體，像HSF這樣形成三聚體的非常少見(jiàn)。三聚體的空間結(jié)構(gòu)比預(yù)期的緊密。因此，HSF三聚區(qū)域的空間結(jié)構(gòu)并非如所想像的是一個(gè)簡(jiǎn)單的連續(xù)卷曲-螺旋（coiled-coil）。其構(gòu)型可能與流感病毒血凝素的三聚區(qū)域相似：較長(zhǎng)的七氨基酸重復(fù)序列內(nèi)部相互作用，形成一個(gè)三鏈螺旋型卷曲螺旋（triple-stranded -helical coiled-coil），其外部由較短的七氨基酸重復(fù)序列形成一個(gè)螺旋，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。 二、HSF的結(jié)構(gòu)除DNA結(jié)合區(qū)域

36、與三聚區(qū)域外，促進(jìn)熱休克基因轉(zhuǎn)錄的活化區(qū)域（activator domain）也是HSF較重要的結(jié)構(gòu)之一。但活化區(qū)域與上述兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域不同，其物種間的同源性不高，位置也不很確定。通過(guò)遺傳學(xué)方法，可將Kl HSF（Kluyveromyces lactis HSF）的C末端活化子（carboxy-terminal activator，CTA）定位于C末端的32個(gè)氨基酸殘基內(nèi)；而Sc HSF（Saccharomyces cerevisiae HSF）的CTA則散布于180個(gè)氨基酸殘基內(nèi)。二、HSF的結(jié)構(gòu)N-末端活化子（N-terminal activator，NTA）的具體位置尚未確定。高等真核生物

37、的活化區(qū)域可能位于C末端的某些區(qū)域。例如：hHSF1有2個(gè)獨(dú)立的活化區(qū)域，位于靠C端1/3處，受所謂中心調(diào)節(jié)區(qū)域（central regulatory domain）調(diào)節(jié)；該調(diào)節(jié)區(qū)域位于三聚區(qū)域與該活化區(qū)域之間，對(duì)熱刺激信號(hào)敏感。CE2是位于HSF的C末端的一小段序列，也是HSF最保守的序列之一，能夠抑制HSF的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)功能。但CE2僅見(jiàn)于酵母菌，高等生物缺乏這一結(jié)構(gòu)。 三、HSF活化及作用過(guò)程 多種內(nèi)、外界刺激因素均可活化HSF，其中以熱休克為最典型、最傳統(tǒng)的活化方式。細(xì)胞受到高溫刺激后，促進(jìn)HSF活化。 HSF從無(wú)活性到有活性，通過(guò)以下3個(gè)步驟被活化：（1）HSF由單體形式變成磷酸化的三聚

38、體形式而被激活；（2）三聚體與HSE結(jié)合；（3）轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域開(kāi)放，促進(jìn)HSP轉(zhuǎn)錄。 （1）HSF由單體形式變成磷酸化的三聚體形式而被激活在無(wú)應(yīng)激狀態(tài)下，HSF以無(wú)活性的單體形式存在。單體是在常溫時(shí)，HSF內(nèi)1區(qū)與C末端4區(qū)形成亮氨酸拉鏈維系高級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，解除了對(duì)HSF的活性抑制，促進(jìn)HSF由單體向三聚體轉(zhuǎn)換。HSF之間通過(guò)三聚區(qū)域結(jié)合，具體位點(diǎn)是三聚區(qū)域的3個(gè)七氨基酸重復(fù)序列，主要依賴三個(gè)單體 彼此的1區(qū)、2區(qū)、3區(qū)，形成單體之間的亮氨酸拉鏈。 （1）HSF由單體形式變成磷酸化的三聚體形式而被激活在無(wú)應(yīng)激時(shí)，這3個(gè)序列在HSF內(nèi)部形成穩(wěn)定的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，以

39、維持其單體狀態(tài)；在應(yīng)激時(shí)，在不明機(jī)制的作用下，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)打開(kāi)，相鄰HSF的七氨基酸重復(fù)序列之間相互作用，形成分子間的卷曲螺旋。在此結(jié)構(gòu)幫助下，每3個(gè)HSF單體結(jié)合在一起，形成一個(gè)三聚體。 （2）三聚體與HSE結(jié)合HSF單體基本上不能結(jié)合HSE，只有形成三聚體后，兩者的親和性才大大增強(qiáng)。HSF與HSE親和力的大小不僅與HSE內(nèi)的“-nGAAn-”數(shù)目有關(guān)，而且HSF三聚體之間的協(xié)作也能極大地促進(jìn)兩者的結(jié)合。在熱休克基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游數(shù)百bp處，往往有多個(gè)拷貝的HSE；HSF與2個(gè)緊鄰HSE的親和力比與單個(gè)HSE的親和力高出近2千倍。 （3）轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域開(kāi)放，促進(jìn)HSP轉(zhuǎn)錄對(duì)Kluyveromyc

40、es lactis 等較低等的真核生物而言，HSF與HSE的結(jié)合過(guò)程與HSF促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過(guò)程是偶聯(lián)的；兩者結(jié)合后，隨HSF上活化區(qū)域的暴露，即可促進(jìn)熱休克基因的轉(zhuǎn)錄。但高等真核生物的情況比較復(fù)雜，雖然通常兩者也能偶聯(lián)，但在一定的條件下，HSF與HSE結(jié)合并不能促進(jìn)熱休克基因的轉(zhuǎn)錄，即這兩者是兩個(gè)相互獨(dú)立而非偶合的過(guò)程。這說(shuō)明：在高等真核生物體內(nèi)，對(duì)HSF的DNA結(jié)合功能和轉(zhuǎn)錄促進(jìn)功能的調(diào)節(jié)各有其機(jī)制。 HSF活化后，促進(jìn)HSP轉(zhuǎn)錄示意圖 （3）轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域開(kāi)放，促進(jìn)HSP轉(zhuǎn)錄在通常情況下，兩者互相協(xié)調(diào)；但是在一定條件下，可將兩者分開(kāi)。與HSF活化緊密相關(guān)的還有HSF的定位及HSF的磷酸化等過(guò)程。

41、生物體內(nèi)、外多種調(diào)節(jié)因素對(duì)HSF的調(diào)節(jié)基本上是圍繞這3個(gè)HSF在熱應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮功能的關(guān)鍵步驟進(jìn)行的。HSF除了在熱應(yīng)激反應(yīng)中能調(diào)節(jié)HSP的合成外，有的還能在某些生理和病理狀態(tài)下發(fā)揮作用。第六節(jié) 一些轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例 一、腸特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX2二、轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1三、FOXP3四、免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3五、核轉(zhuǎn)錄因子B（NF-B）六、Spl七、PAX5一、腸特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX2 CDX2是腸表皮細(xì)胞早期分化和特性維系的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，不僅控制著胚胎的發(fā)育和分化，而且在成人組織的分化和增殖中起著重要作用。而作為腸型特異性基因的表達(dá)產(chǎn)物，CDX2表達(dá)于正常腸道組織，在小腸和盲腸中表達(dá)較

42、高，在遠(yuǎn)端結(jié)腸中表達(dá)降低，在腸道腫瘤組織中表達(dá)則明顯下降。CDX2具有抑制結(jié)腸癌的功能，過(guò)表達(dá)明顯抑制結(jié)腸生長(zhǎng)，而促進(jìn)其分化。 一、腸特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX2CDX2通過(guò)核移位和翻譯后磷酸化水平修飾，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)控作用。腸型胃腺癌的發(fā)生，與腸特異性轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控失常密切相關(guān)。 CDX2蛋白在不同胃粘膜病變中的表達(dá)（超敏SP法） ABCD一、腸特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX2CDX2蛋白主要表達(dá)于胃粘膜腸化生（intestinal metaplasia）灶中的杯狀細(xì)胞及柱狀上皮細(xì)胞（前圖A），以及腸型胃癌細(xì)胞的細(xì)胞核（前圖B），呈淺棕黃色顆粒樣著色，近核周的胞漿中也有少量細(xì)顆粒樣著色

43、；在部分彌漫型胃癌細(xì)胞胞漿及胞核中也有弱到中等程度的著色（前圖C）；在少部分CAG病例的胃腺凹上皮中也有棕黃色粗大顆粒樣胞漿著色（前圖D）。 二、轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1 轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1（B lymphocyte induced maturation protein 1）（人的蛋白被稱為PRDI-BF1）是具有5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，它可誘導(dǎo)成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)育為漿細(xì)胞并分泌抗體，因此被稱為“B淋巴細(xì)胞終極分化的主調(diào)控子”。 Blimp-1至少通過(guò)3個(gè)基因表達(dá)程序誘導(dǎo)了漿細(xì)胞發(fā)育：（1）Blimp-1阻斷B細(xì)胞增生程序，主要包括直接抑制c-myc，下調(diào)E2F-1及抗凋亡基因A1，上調(diào)cdk 抑

44、制子p18和p21；（2）Blimp-1上調(diào)促使Ig分泌的基因，包括重鏈及輕鏈基因、J鏈、XBP-1、CHOP、hsp70等；（3）Blimp-1下調(diào)在形成生發(fā)中心和B細(xì)胞激活中起重要作用的基因，包括Pax-5、Bcl-6、AID、BCR 信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因、CD72、CXCR5等。 二、轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1Blimp-1在生發(fā)中心B細(xì)胞和邊緣區(qū)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，它在漿細(xì)胞發(fā)育中的作用是不可缺少的。多發(fā)性骨髓瘤病人中B細(xì)胞表達(dá)Blimp-1，而 正常人B細(xì)胞不表達(dá)Blimp-1。未成熟Blimp-1的表達(dá)加上Pax-5表達(dá)的缺失，使B細(xì)胞過(guò)早增生和分化，可能與多發(fā)性骨

45、髓瘤的發(fā)生相關(guān)。三、FOXP3 FOXP3是FOX（forkhead box）家族（叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族）轉(zhuǎn)錄因子中的一員。FOX轉(zhuǎn)錄因子最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，如今FOX轉(zhuǎn)錄因子家族具有100多個(gè)成員。FOX轉(zhuǎn)錄因子在免疫調(diào)節(jié)的各個(gè)方面（包括從淋巴細(xì)胞的存活到胸腺的發(fā)育）發(fā)揮著重要作用。FOXP3主要是一個(gè)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成及功能有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。 三、FOXP3在小鼠體內(nèi)，僅表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，在人類則不僅可表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，還可表達(dá)于CD8+CD28-T細(xì)胞，但以前者為主。它的表達(dá)及功能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，TR細(xì)胞）密切相關(guān)。調(diào)節(jié)性T

46、細(xì)胞，是體內(nèi)非常重要的T細(xì)胞亞群，在自身免疫、腫瘤免疫及移植免疫中均能發(fā)揮作用。三、FOXP3胸腺中未成熟T細(xì)胞及外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在其受體被結(jié)合后，以及在TGF-和雌激素刺激下，F(xiàn)OXP3表達(dá)均增高，并可通過(guò)抑制IL-2的表達(dá)及上調(diào)血紅素加氧酶-1的表達(dá)等而發(fā)揮免疫抑制作用。如果FOXP3 基因發(fā)生突變，將影響TR細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致IPEX綜合征（immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) 。 四、免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 轉(zhuǎn)錄因子GATA-3屬鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)T細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)育

47、、增殖和分化。GATA-3是T祖細(xì)胞發(fā)育中所必需的轉(zhuǎn)錄因子，被稱為“T細(xì)胞的特異性活化子”，并可調(diào)節(jié)TCR 基因的表達(dá)。CD8+基因的啟動(dòng)子及增強(qiáng)子上具有GATA-3的結(jié)合位點(diǎn)，且GATA-3在胸腺細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中調(diào)控CD8+基因的表達(dá)。四、免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3GATA-3參與維持正常骨髓造血及微環(huán)境造血調(diào)控。在再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)的病理狀態(tài)下，骨髓微環(huán)境中GATA-3 基因的表達(dá)明顯受到影響，GATA-3的異常表達(dá)上調(diào)可能與AA的骨髓中出現(xiàn)異常活化的淋巴細(xì)胞有關(guān)。四、免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3GATA-3通過(guò)影響CD8+等相關(guān)基因表達(dá)和/或調(diào)控Th細(xì)

48、胞亞群來(lái)影響機(jī)體免疫功能。AA的骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）和骨髓細(xì)胞中GATA-3的表達(dá)異常，可能是導(dǎo)致AA骨髓中T細(xì)胞功能異常和自身反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生的主要原因之一。GATA-3的異常上調(diào)表達(dá)對(duì)AA的骨髓微環(huán)境和造血細(xì)胞均有影響，GATA-3可能從調(diào)控微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞兩方面參與AA的發(fā)病機(jī)制，也說(shuō)明在骨髓微環(huán)境中存在著AA致病的免疫素。 五、核轉(zhuǎn)錄因子B（NF-B） 核轉(zhuǎn)錄因子B（NF-B）是一類在動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，能與某些基因的增強(qiáng)子上B位點(diǎn)結(jié)合，并啟動(dòng)、促進(jìn)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。在B細(xì)胞核蛋白提取物中，有能與免疫球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)子B序列特異結(jié)合的蛋白。B位點(diǎn)還廣泛存在于淋巴細(xì)

49、胞、病毒、細(xì)胞因子的增強(qiáng)子上，其調(diào)控的基因大都與免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，NF-B是參與這類應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。 NF-B參與的信號(hào)傳導(dǎo)五、核轉(zhuǎn)錄因子B（NF-B）有生理功能的NF-B是由P50和P65兩個(gè)亞單位構(gòu)成的異源二聚體。其主要生理功能之一是：通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制基因的轉(zhuǎn)錄，拮抗細(xì)胞凋亡的發(fā)生，它們幾乎存在于所有細(xì)胞中。調(diào)節(jié)一系列的病理和生理反應(yīng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡，尤其在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中處于重要地位。抑制NF-B的過(guò)度表達(dá)可阻斷其靶基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。NF-B除了能介導(dǎo)多種炎性介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)外，它也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，主要通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)的重要基因表達(dá)。五、核

50、轉(zhuǎn)錄因子B（NF-B）當(dāng)NF-B激活時(shí)，可抑制細(xì)胞凋亡并延長(zhǎng)細(xì)胞生存周期，所以細(xì)胞凋亡及NF-B活化的異常會(huì)導(dǎo)致多種人類疾病。例如：NF-B在肝纖維化過(guò)程中一方面形成“炎性瀑布”，造成肝臟損傷；另一方面促進(jìn)HSC的增生、活化，并且抑制其凋亡，從而推進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。目前，許多研究者試圖通過(guò)改變NF-B活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激感染性，尤其在腫瘤及抗炎癥治療領(lǐng)域，這一思路引起了廣泛的興趣。 六、Spl Spl是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，可調(diào)控某些啟動(dòng)子中富含GC序列的細(xì)胞和病毒基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。近來(lái)，與Spl具有相似結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄特性的轉(zhuǎn)錄因子（Sp2、Sp3、Sp4）也相繼被發(fā)現(xiàn)和克隆，由此構(gòu)成了Sp

51、多基因家族。對(duì)許多可調(diào)控腫瘤細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和血管生成的基因而言，Spl是一個(gè)重要和必需的轉(zhuǎn)錄因子。 六、SplSpl的異常表達(dá)和活化，可通過(guò)促進(jìn)相關(guān)腫瘤生長(zhǎng)因子和血管生成基因表達(dá)等機(jī)制，營(yíng)造適宜腫瘤生長(zhǎng)的局部微環(huán)境，正向調(diào)節(jié)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移潛能和血管生成。可受Spl蛋白調(diào)節(jié)的基因有：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1、類上皮生長(zhǎng)因子受體、類胰島素生長(zhǎng)因子受體-1、類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、胸腺嘧啶激酶等。 六、SplSpl還可調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的啟動(dòng)子，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡影響腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移潛能。在正常胃黏膜和胃癌組織中，Sp1蛋白表達(dá)具有不同的

52、分布特征。Sp1可作為判斷胃癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)，并可能通過(guò)除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以外的其它機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲和發(fā)展。 七、PAX5 PAX（paired box）5基因是配對(duì)區(qū)PAX 基因家族的成員，該家族產(chǎn)生的蛋白都含有一個(gè)編碼128個(gè)氨基酸的配對(duì)結(jié)構(gòu)域。它編碼的核反式作用因子B細(xì)胞特異性激活蛋白（B-cell specific activator protein，BSAP）在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、成人睪丸和B淋巴細(xì)胞中表達(dá)。 七、PAX5比較不同化療階段B-ALL（兒童急性白血病）患兒PAX5 mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，初診化療前組患兒與復(fù)發(fā)組患兒的平均PAX5 mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著意義（P 0.0

53、5），而化療緩解組患兒的平均PAX5 mRNA表達(dá)下降（最小殘留白血病細(xì)胞，即MRD0.01%），與初診化療前組和復(fù)發(fā)組患兒的差異均具有顯著意義（P 0.05）。在B-ALL中，PAX5通過(guò)調(diào)控其目標(biāo)基因CD19 表達(dá)，來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)一步可能影響腫瘤的發(fā)展。第七節(jié) 人工轉(zhuǎn)錄因子 如前所述，轉(zhuǎn)錄因子是真核表達(dá)調(diào)控中非常重要的一類反式作用因子，通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域兩部分組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以各自獨(dú)立發(fā)生作用。基于轉(zhuǎn)錄因子的這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以人為地選擇針對(duì)特定序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與具有特定作用的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子。 第七節(jié) 人工轉(zhuǎn)錄因子目前，人工轉(zhuǎn)錄因子的D

54、NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域多為C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。每一個(gè)鋅指單元由大約30個(gè)氨基酸組成，識(shí)別DNA雙螺旋大溝中相連的3bp序列，并可通過(guò)氫鍵作用與相應(yīng)的堿基結(jié)合；多個(gè)鋅指可以串聯(lián)成簇，從而識(shí)別并結(jié)合較長(zhǎng)的DNA序列區(qū)域。常見(jiàn)的人工轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域有激活結(jié)構(gòu)域以及抑制結(jié)構(gòu)域，不同的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域賦予人工轉(zhuǎn)錄因子不同的功能。 第七節(jié) 人工轉(zhuǎn)錄因子一、人工轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)二、獲得特異識(shí)別DNA序列的鋅指蛋白三、人工轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用一、人工轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu) 早期的人工轉(zhuǎn)錄因子，只是簡(jiǎn)單地將某種已知轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與另一種已知轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域組合在一起，所得到的融合蛋白。例如：1985年Brent等將酵母

55、轉(zhuǎn)錄因子Gal4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌LexA蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合在一起，得到的新型轉(zhuǎn)錄因子可以作用于含有LexA操縱子序列的啟動(dòng)子，并激活其下游基因的表達(dá)。當(dāng)時(shí)人們將這種實(shí)驗(yàn)稱為“domain swap experiments”。如今，種類繁多的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及效應(yīng)結(jié)構(gòu)域被應(yīng)用于人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建。 一、人工轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域2、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（1）激活結(jié)構(gòu)域 （2）抑制結(jié)構(gòu)域（3）效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的拓展 1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在人工轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計(jì)中使用的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其構(gòu)成，分為：非蛋白結(jié)構(gòu)模塊與蛋白結(jié)構(gòu)模塊兩大類。非蛋白結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括三鏈形成寡核苷酸（

56、triplex-forming oligonucleotide，TFO）、肽核酸（PNA）以及聚酰胺（polyamides）等。 1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域TFO與PNA都是通過(guò)與靶序列形成三鏈而識(shí)別特異序列的；而聚酰胺則是通過(guò)與DNA的小溝結(jié)合來(lái)進(jìn)行序列識(shí)別的，已經(jīng)設(shè)計(jì)出了可以特異識(shí)別4bp序列的聚酰胺分子。蛋白結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)、類固醇受體以及鋅指結(jié)構(gòu)等。這些結(jié)構(gòu)是天然的轉(zhuǎn)錄因子中經(jīng)常出現(xiàn)的組成部分，其中鋅指結(jié)構(gòu)以其小巧靈活、結(jié)構(gòu)獨(dú)特而備受關(guān)注。 1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域C2H2鋅指結(jié)構(gòu)是Miller等最先在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子TF III A中發(fā)現(xiàn)的，是真核細(xì)胞中最常見(jiàn)

57、的DNA結(jié)合模體（motif）。在人類基因組中，大約有2%的基因編碼C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。多個(gè)鋅指單元可以串聯(lián)成簇，識(shí)別更長(zhǎng)的DNA序列。 鋅指單元的結(jié)構(gòu)1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白Zif-68包含3個(gè)鋅指單元。對(duì)于Zif-68與其靶DNA序列相互作用所形成復(fù)合物晶體的X射線衍射分析，揭示了C2H2鋅指與DNA作用的特點(diǎn)：每一個(gè)鋅指單元的螺旋伸入DNA的大溝中，通過(guò)螺旋外側(cè)的氨基酸來(lái)識(shí)別DNA雙螺旋大溝中的相鄰的34bp序列，并可通過(guò)氫鍵作用與相應(yīng)的堿基結(jié)合。 1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域C2H2鋅指結(jié)構(gòu)還能識(shí)別修飾過(guò)的DNA堿基，如5-甲基胞嘧啶。相對(duì)于其它DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C2H2鋅指有很多的優(yōu)點(diǎn)：例

58、如，許多DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由于自身是對(duì)稱或者二聚化的結(jié)構(gòu)而只能識(shí)別對(duì)稱序列，而C2H2鋅指則可以識(shí)別非回文序列；并且由于可以多個(gè)鋅指單元串聯(lián)，C2H2鋅指對(duì)于其識(shí)別序列的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)沒(méi)有太多的限制，僅僅需要改變幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸，就可以賦予鋅指新的識(shí)別特性。 1、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域從理論上講，對(duì)于任意DNA序列，都能找到能夠與之特異結(jié)合的C2H2鋅指。基于鋅指結(jié)構(gòu)相對(duì)于其它DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的優(yōu)勢(shì)，目前大多數(shù)人工轉(zhuǎn)錄因子都以鋅指結(jié)構(gòu)作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。自從應(yīng)用了鋅指結(jié)構(gòu)之后，人工轉(zhuǎn)錄因子才真正實(shí)現(xiàn)了模塊化設(shè)計(jì)。 2、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在早期人們發(fā)現(xiàn)，僅僅是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨蜣D(zhuǎn)錄以及表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生一定

59、的抑制作用。其原因可能是：諸如鋅指蛋白這樣的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域過(guò)量表達(dá)，并結(jié)合在基因的編碼區(qū)，從而阻礙了基因轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行；也有可能是：結(jié)合在基因啟動(dòng)子區(qū)域，占據(jù)了某些轉(zhuǎn)錄必需的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（如果是占據(jù)抑制因子的作用位點(diǎn)，則有可能有一定的上調(diào)作用）。2、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域不過(guò)這些作用的強(qiáng)度是很有限的，而且情況因研究體系的不同而差別很大。因此，目前在人工轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計(jì)中，通常都要加上不同的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，以賦予人工轉(zhuǎn)錄因子不同的功能。 2、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（1）激活結(jié)構(gòu)域（2）抑制結(jié)構(gòu)域（3）效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的拓展（1）激活結(jié)構(gòu)域常用的激活結(jié)構(gòu)域有來(lái)自NF-B的p65亞基（288548位氨基酸）以及來(lái)源于單純皰疹病毒（

60、herps simplex virus）的VP16等。利用VP16的413490位氨基酸部分，可很有效地激活（上調(diào)）基因的轉(zhuǎn)錄。VP16的437447位氨基酸DALDDFDLDML，也可產(chǎn)生明顯的激活作用；再縮小至78個(gè)氨基酸，或者DDFDL這5個(gè)氨基酸，仍有很強(qiáng)的激活作用。（1）激活結(jié)構(gòu)域許多被稱為AH（amphipathic helix）的模擬天然激活區(qū)域的15個(gè)氨基酸的人工肽也被用在人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建中。近年來(lái)，還發(fā)現(xiàn)形成發(fā)卡的RNA分子對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄，也能產(chǎn)生一定的激活作用。 （2）抑制結(jié)構(gòu)域常用的抑制結(jié)構(gòu)域有：轉(zhuǎn)錄因子KOX1的KRAB（krppel-associated box）結(jié)