1、單核苷酸多態性理理 論論 及及 應應 用用SNP1Contents 1. SNP概述 2. 常用SNP檢測技術 3. SNP的應用 4. 科研進展 5. 存在的問題2有的人吸煙喝酒卻長壽，也有人自幼就病痛纏身；同有的人吸煙喝酒卻長壽，也有人自幼就病痛纏身；同一種治療腫瘤的藥物對一些人非常有效，對另一些人則一種治療腫瘤的藥物對一些人非常有效，對另一些人則完全無效。這是為什么？答案是他們基因組中存在的差完全無效。這是為什么？答案是他們基因組中存在的差異。這種差異很多表現為單個堿基上的變異，也就是單異。這種差異很多表現為單個堿基上的變異，也就是單核苷酸的多態性（核苷酸的多態性（SNPSNP）。）。

2、34SNP全稱Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因組上單個核苷酸的變異,包括置換、顛換、缺失和插入。一般而言,SNP 是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000 個堿基就有一個SNP ,人類基因組上的SNP 總量大概是3 106 個 。 從理論上來看每一個SNP 位點都可以有4 種不同的變異形式,但實際上發生的只有兩種,即轉換(為主)：以一種嘧啶置換另一種嘧啶CT 或一種嘌呤置換另一種嘌呤AG和顛換：嘌呤與嘧啶互換CG,CG,AT。SNP 在CG序列上出現最為頻繁,而且多是C轉換為T ,原因是CG中的C 常為甲基化的,自發地脫氨后即

3、成為胸腺嘧啶。 5 根據SNP在基因組中的分布位置可將其分為基因編碼區SNP(cSNP)，基因調控區SNP(pSNP)，基因間隨機非編碼區SNP(rSNP)等三類。因為編碼區內的變異率僅占周圍序列的1/5，SNP的總量顯著小于其他兩類SNP。 從對生物遺傳性狀影響上看，cSNP又可以分為2種，一種是同義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所導致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP)，指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的但標準序列發生改變，從而影響蛋白質的功能。這種改變通常

4、是導致生物性狀發生改變的直接原因。 位于基因調控區的SNP則會影響基因表達量的多少。6 在描述SNP時，當前的一致意見是用術語“ haplotype”（ 單倍型）代替術語“allele”（ 等位基因）。 單倍型的定義為在給定的一條染色體的緊密連鎖的位點上多個等位基因的集合，通常3-4個相鄰等位基因彼此靠近而構成的單倍型可作為一個整體而遺傳（ 稱為單倍型塊，haploblock）（ Edwards et al.,2001;Rafaski,2002），見表1。78SNP 的分型技術可分為兩個時代，一為凝膠時代，二為高通量時代。凝膠時代的主要技術和方法包括限制性酶切片段長度多態性分析（RFLP）、寡

5、核苷酸連接分析（OLA）、等位基因特異聚合酶鏈反應分析（AS2PCR）、單鏈構象多態性分析（SSCP）、變性梯度凝膠電泳分析（DGGE），雖然這些技術與高通量時代的技術原理大致一樣，但是由于它不能進行自動化，只能進行小規模的SNP分型測試，所以必然會被淘汰。 9 基因芯片技術是在固相支持介質上進行分子雜交和原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。10 這種方法也稱為核酸外切酶法(5-nuclease assay) ,是在PCR過程中實現等位特異性雜交,而不需以往等位特異性雜交中樣品PCR后分離及洗滌等步驟。11 分子信標是一種新型的發卡結構的寡核苷酸探針,是在樣品PCR過程中因和樣品DNA 雜

6、交后而使自身熒光構象改變從而實現對SNP的檢測。12 四種酶催化同一反應體系中的酶級聯反應，包括DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、熒光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶( apyrase) 。 原理：DNA 聚合酶在一種dNTP的存在下進行引物延伸反應,而引物的成功延伸將伴隨焦磷酸的釋放,焦磷酸在熒光素酶的存在下能引一種發化學發光反應,通過發光計的實時監測來達到檢測的目的。1314 Cereon Ginomics公司（2001）公開的信息指出，在擬南芥的兩個生態型序列中，平均每3.3kb有1個SNP，對這個擁有130Mb的基因組而言，這種堿基

7、轉換的變異大約為40,000 個SNPs。Cho et al.（1999）用一種抗真菌病基因Eds16 序列中的237個SNPs 標記在擬南芥中構建了分辨率為3.5cm 的二等位基因遺傳圖譜。這是第一次在二倍體植物中構建的二等位基因標記的遺傳圖譜，它所確立的一系列方法也可用于其他植物的SNPs遺傳圖譜構建。在F2代收獲以后，這個二等位基因圖譜構建的整個過程花了不到兩天的時間，而要用ONF8 標記得到同樣的結果須花幾個月時間。15 SNPs指紋在區分近緣種的研究中非常有效。例如：紅云杉和黑云杉在形態上難以區分，它們和白云杉在北美地區又是分布區重疊的種。為了鑒定3個近緣種之間的多態性，German

8、o（1999）從每個種代表不同地理群體的3 個個體取樣，對葉綠體trnK 的內含子、trnK、rpl33-psaJ-trnK區域以及核DNA的ITS 區域進行測序，結果發現了13個葉綠體的和12個核DNA的種間SNPs，其分布如圖所示。 這些方法簡單而靈敏，通常比等位酶、RELP 和RAPD 等分子標記更為有效。16 SNPs還在 人類基因單體型圖譜的繪制； 疾病易感的相關性分析； 指導用藥和用藥分析等方面 有諸多應用。1718通過在南洋楹上采用多路復用的單核苷酸引物延伸技術開發SNP標記和DNA分型。We developed SNPs in Paraserianthes falcataria

9、 and arranged them for multiplexed DNA typing using single nucleotide primer extension (SNuPE). Seventeen sequence characterized amplified regions (SCARs) were developed from random amplified polymorphic DNA (RAPD). In 12 SCARs of them, a SNP which possessed high heterozygosity was selected, and thr

10、ee sets of multiplexed SNuPE analysis system with 4 SNPs were constructed. Estimating the discrimination power (DP) revealed that set A had the highest DP (0.968), followed by set B and set C. The ability to discriminate could be almost 100% (1.000 of DP) when all sets were used. This SNuPE system p

11、rovides a practicable method for individual identification of this forest tree species.19 犬類的全基因組SNP和單體型分析To understand the process of dog diversification better, we conducted an extensive genome-wide survey of more than 48,000 single nucleotide polymorphisms in dogs and their wild progenitor, the g

12、rey wolf. Here we show that dog breeds share a higher proportion of multi-locus haplotypes unique to grey wolves from the Middle East, indicating that they are a dominant source of genetic diversity for dogs rather than wolves from east Asia, as suggested by mitochondrial DNA sequence data. Furtherm

13、ore, we find a surprising correspondence between genetic and phenotypic/functional breed groupings but there are exceptions that suggest phenotypic diversification depended in part on the repeated crossing of individuals with novel phenotypes. Our results show that Middle Eastern wolves were a criti

14、cal source of genome diversity, although interbreeding with local wolf populations clearly occurred elsewhere in the early history of specific lineages. More recently, the evolution of modern dog breeds seems to have been an iterative process that drew on a limited genetic toolkit to create remarkab

15、le phenotypic diversity.2021 在國際SNP及復雜基因分析會議上透露出許多問題，利用SNP 尋找致病基因的工作并不象最初想象的那樣簡單。 研究者除需要大量的SNPs，有時需要弄清被研究人群的歷史,如他們的遷移模式等，在對心臟病危險因素LPL 基因的研究中，由于減數分裂中的基因重組，使SNP的關聯分析很困難；科學家們用SNPs 研究鐮刀細胞貧血的B球蛋白基因時也遇到了困難，他們認為研究者除依靠SNP外，還需知道疾病的模式及被研究人群的歷史。 22 目前雖然有大量檢測SNP的方法，但大都價格昂貴，速度較慢，這限制了其在法庭科學中的應用，所以迫切需要有低成本，高生產率的新方

16、法涌現。 23 目前沒有一個統一標準的命名方法, 這對于Y2SNP來說尤為緊迫，由于不同SNP由不同實驗室測定，現在至少存在6種不同的命名系統。 24 1.鄒喻蘋,葛頌. 新一代分子標記SNPs及其應用. 2003,11(5):370-382 2.唐棣,王志民. SNPs檢測方法研究進展.上海交通大學學報(農業科學版),2007,Vol.25,No.2:406-418 3. Vivi Yuskianti, Susumu Shiraishi. Developing SNP markers and DNA typing using multiplexed single nucleotide primer extension (SNuPE) in Paraserianthes falc