1、基于 DGGE 方法對食品加工廠單增李斯特優(yōu)勢共棲菌的分析引言實驗材料與方法實驗結(jié)果與分析結(jié)論第一 針對課題的要求，了解當前李斯特菌以及生物被膜在國內(nèi) 外的研究進展及成果第二 挑選材料，利用各種儀器采用DGGE方法進行實驗第三 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析生物被膜中單增李斯特菌的優(yōu)勢共棲菌第四 對實驗進行全面的總結(jié)，并對以后的工作進行展望一、引言一、引言 單核細胞增生李斯特菌是一種人畜共患的食源性致病菌。李斯特菌的發(fā)病率不高，但是致死率卻高達20%-30%，目前已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列入四大食源性病原菌之一。近年來，大量的單核增生李斯特菌被發(fā)現(xiàn)于許多的食品加工廠中，許多消毒劑都難以有效清除。生物被膜的形成正是

2、對消毒劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一。單核增生李斯特菌與其共棲菌共同形成生物被膜，有效抵抗消毒劑的殺滅。因此研究單核增生李斯特菌生物被膜共棲菌菌種特征就尤其重要。研究背景一、引言一、引言 正是由于李斯特菌的嚴重危害性以及生物被膜在菌體對消毒劑的耐受中發(fā)揮非常重要的作用，現(xiàn)在用消毒劑已經(jīng)越來越難將其有效清除。因此本研究采用DGGE的實驗方法，重點研究單核增生李斯特菌生物被膜中優(yōu)勢共棲菌的菌群信息，旨在通過混合菌生物被膜特征的研究找到有效消滅單核細胞增生李斯特菌的辦法，并且為在食品加工環(huán)境中控制單核增生李斯特菌生物被膜的形成和污染奠定理論基礎(chǔ)。目的與意義二、實驗材料與方法二、實驗材料與方法 變形梯度電泳

3、儀 基因組 DNA 提取試劑盒 PCR儀二、實驗材料與方法二、實驗材料與方法實驗方法樣品DNA的提取DGGE前的PCR擴增和純化DGGE操作條帶回收及純化克隆 克隆子測序三、實驗結(jié)果與分析三、實驗結(jié)果與分析用基因組DNA提取試劑盒提取總DNA后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，得到8個樣品基因組的DNA提取結(jié)果，如下圖所示：提取DNA條帶亮度大，條帶清晰且無雜帶。注：M表示100bp ladder Marker，樣品左為3Q，中為5Q、6Q，右為1-2、1-3、2-3、3-2、3-3三、實驗結(jié)果與分析三、實驗結(jié)果與分析宏基因組的16S rDNA的V3區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖以8個樣本的基因組總DNA為

4、模板，采用帶GC夾子的引物擴增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如右圖所示，條帶清晰，無雜帶，無引物二聚體。三、實驗結(jié)果與分析三、實驗結(jié)果與分析由圖可知，8個不同的地漏樣品呈現(xiàn)出不同菌種的DGGE指紋特征譜帶，每個樣品有10-16個條帶，同一個地區(qū)不同取樣點的DGGE譜圖表現(xiàn)出一定的相似性，菌種差異性較少，微生物群落多樣性相似，優(yōu)勢條帶相似。 8個地漏樣品的DGGE電泳圖三、實驗結(jié)果與分析三、實驗結(jié)果與分析 8個地漏樣品的PCR-DGGE的亮帶分析（部分）獲得的測序結(jié)果如右圖，測序結(jié)果經(jīng)檢驗，最終確定條帶對應的菌株種屬。經(jīng)鑒定，b1、b3、b7三條條帶分別為3Q、5Q和6Q樣品中的優(yōu)勢菌種嗜冷假單胞菌，b12、b17、b20分別為1-2、3-2和3-3樣品的優(yōu)勢菌種嗜水氣單胞菌，條帶b13、b15分別為1-3、2-3樣品的優(yōu)勢菌種克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌。四、結(jié)論四、結(jié)論本實驗證實了地漏樣品中與單核增生李斯特菌共棲的優(yōu)勢菌有嗜冷假單胞菌、假單胞菌、克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌和嗜水氣單胞菌。正是這些共棲菌與LM共同形成的生物被膜給LM提供了一個避難所,使單增李斯特菌避免了來自消毒劑的清除和滅活。因此,本實驗從食品加工設(shè)備中分離鑒定出以上優(yōu)勢共棲菌,有利于為有效控制