1、 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫放射免疫技術(shù)技術(shù)發(fā)光免疫發(fā)光免疫技術(shù)技術(shù)酶免疫技酶免疫技術(shù)術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)-三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù)之一三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù)之一三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù)：三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù)：抗原抗體反響的抗原抗體反響的特異性特異性+酶高效催化反響的酶高效催化反響的專注性專注性酶免疫技術(shù)的原理及特點(diǎn)酶免疫技術(shù)的原理及特點(diǎn)鄰苯二胺鄰苯二胺 OPDOPD四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 TMBTMB5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 ABTS ABTS常用底物常用底物酶

2、免疫技術(shù)的中心酶免疫技術(shù)的中心組成部分組成部分 酶結(jié)合物酶結(jié)合物conjugateconjugate酶標(biāo)志物酶標(biāo)志物 經(jīng)過化學(xué)反響或免經(jīng)過化學(xué)反響或免疫學(xué)反響，讓酶與疫學(xué)反響，讓酶與抗體或抗原構(gòu)成的抗體或抗原構(gòu)成的結(jié)合物結(jié)合物 酶標(biāo)志抗體或抗原酶標(biāo)志抗體或抗原抗原要求純度高，抗原性完好抗原要求純度高，抗原性完好 抗體需求特異性好、效價(jià)高、抗體需求特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量消費(fèi)，易純化。量消費(fèi)，易純化。 制備方法要制備方法要求求酶標(biāo)志抗體或抗原酶標(biāo)志抗體或抗原制備方法要制備方法要求求技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，反復(fù)性技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，反復(fù)性好好標(biāo)志

3、反響不影響酶和抗原或抗體標(biāo)志反響不影響酶和抗原或抗體的活性的活性酶標(biāo)志物穩(wěn)定酶標(biāo)志物穩(wěn)定 ，不構(gòu)成聚合物，不構(gòu)成聚合物酶標(biāo)志抗體或抗原酶標(biāo)志抗體或抗原制備方法制備方法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)志抗體或抗原酶標(biāo)志抗體或抗原 改良過碘酸鈉法改良過碘酸鈉法純化及鑒純化及鑒定定標(biāo)志完成后應(yīng)除去反響液中的游離標(biāo)志完成后應(yīng)除去反響液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，防止游離酶及抗體或抗原聚合物，防止游離酶添加非特異顯色，以及游離抗體或添加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度強(qiáng)度 常用的純化方法：常

4、用的純化方法：葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-200/G-150G-200/G-150過柱層析純化過柱層析純化50%50%飽和硫酸銨沉淀提純飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)志抗體或抗原酶標(biāo)志抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)志物迅速分別的最常游離和結(jié)合的酶標(biāo)志物迅速分別的最常用方法用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的外表到固相載體的外表 固相載體固相載體要求要求 結(jié)合抗體或抗原的容量大結(jié)合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原結(jié)實(shí)地固定在其外表抗體或抗原結(jié)實(shí)地固定在其外表 不影響免疫反響性不影響免疫反響性 利

5、于反響充分進(jìn)展利于反響充分進(jìn)展 固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì)固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì)種類種類塑料制品塑料制品 微顆粒微顆粒膜載體膜載體 固相載體固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用用1%1%5%5%的牛血潔白蛋白或的牛血潔白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相載體外表未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非清消除固相載體外表未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附特異性吸附包被包被coatingcoating封鎖封鎖blockinblocking g包被與封鎖包被與封鎖酶酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定均均 相相非均相非均相固相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免

6、疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 液體標(biāo)本中抗原或液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原如藥物的測(cè)定用于小分子激素和半抗原如藥物的測(cè)定 酶標(biāo)志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，酶標(biāo)志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)志酶的活性會(huì)發(fā)生改動(dòng)，不用分別結(jié)合標(biāo)志酶的活性會(huì)發(fā)生改動(dòng)，不用分別結(jié)合和游離酶標(biāo)志物，經(jīng)過測(cè)定標(biāo)志酶的活性和游離酶標(biāo)志物，經(jīng)過測(cè)定標(biāo)志酶的活性的改動(dòng)，而確定抗原或抗體的含量。的改動(dòng)，而確定抗原或抗體的含量。原原理理均相酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定最具代表性的兩種技術(shù)最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測(cè)定技酶放大免疫測(cè)定技

7、術(shù)術(shù)EMITEMITenzyme-mutiplied enzyme-mutiplied immunoassay immunoassay techniquetechnique克隆酶供體免疫分析克隆酶供體免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme cloned enzyme donor immunoassay donor immunoassay 均相酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定與均相與均相不同之不同之處處需分別游離與結(jié)合的酶標(biāo)志物需分別游離與結(jié)合的酶標(biāo)志物非均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定底物顯色底物顯色定性或定定性或定量的分析量的分析原原理理包被包被反響反響參與待參與待測(cè)抗體測(cè)抗體或或抗

8、原和抗原和酶標(biāo)抗酶標(biāo)抗原原或抗體或抗體洗滌洗滌使結(jié)合使結(jié)合在固相在固相上上的抗原的抗原抗體復(fù)抗體復(fù)合物合物與未結(jié)與未結(jié)合的分合的分別別1234一、根本原理一、根本原理固相的抗原或固相的抗原或抗體抗體 酶標(biāo)志物酶結(jié)酶標(biāo)志物酶結(jié)合物合物 酶反響的酶反響的底物底物 三個(gè)必要試三個(gè)必要試劑劑 二、方法類型及反響原理二、方法類型及反響原理雙抗體夾心法雙抗體夾心法方法：用知抗體包被，參與待檢血清，方法：用知抗體包被，參與待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色運(yùn)用：運(yùn)用： 二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定原測(cè)定 常用于檢測(cè)乙型肝炎外表抗原常用于檢測(cè)乙型肝炎外表抗

9、原和和e e抗原等抗原等ELISAELISA檢測(cè)抗原的方法檢測(cè)抗原的方法雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE EELISAELISA檢測(cè)抗原的方法檢測(cè)抗原的方法競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待檢物、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合結(jié)合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不顯色的底物不顯色或顯色弱或顯色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色的底物顯色1 1、知抗體包、知抗體包被于載體外表被于載體外表1 1、知抗體包、知抗體包被于載體外表被于載體外表2 2

10、、加待測(cè)物、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合體結(jié)合E E1 1、間接法、間接法方法方法 用知抗原包被，參與待測(cè)血清，再加酶標(biāo)用知抗原包被，參與待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人的抗人IgGIgG抗抗體或二抗加底物顯色。抗抗體或二抗加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體運(yùn)用運(yùn)用 常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒螺旋體抗抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定體等的測(cè)定ELISAELISA檢測(cè)抗體的方法檢測(cè)抗體的方法間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E2 2

11、、雙抗原夾心法、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似操作步驟：類似 運(yùn)用：乙型肝炎外表抗體運(yùn)用：乙型肝炎外表抗體ELISAELISA檢測(cè)抗體的方法檢測(cè)抗體的方法ELISAELISA檢測(cè)抗體的方法檢測(cè)抗體的方法4 4、捕獲法、捕獲法 運(yùn)用：運(yùn)用： 病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗型抗體體 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗體抗體 乙型肝炎病毒中心乙型肝炎病毒中心HBc-IgMHBc-IgM抗體抗體ELISAELISA檢測(cè)抗體的方法檢測(cè)抗體的方法原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包鏈抗體包被被捕獲待測(cè)標(biāo)本中捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgMIgM類抗體類抗體參與特異性抗原和酶參與特異性抗原和酶標(biāo)志特異性抗原的抗標(biāo)志特異性抗原的抗體體 底物顯色底物顯色 捕獲法原理捕獲法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待測(cè)物、加待測(cè)物特異性特異性IgMIgM與與非特異性非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結(jié)合性抗體