1、2022-5-3海南大學農學院wss1第三章第三章 吸附層析吸附層析Absorption chromatographyAbsorption chromatography2022-5-3海南大學農學院wss2 背景資料背景資料1 1 色譜和色譜分析色譜和色譜分析2 2 層析法發展簡史層析法發展簡史3 3 層析過程和基本概念層析過程和基本概念4 4 層析法分類層析法分類2022-5-3海南大學農學院wss31.1.色譜和色譜分析色譜和色譜分析n色譜法和色譜學（色譜法和色譜學（Chromatography），也），也稱色層法或層析法。此種方法基于物質溶稱色層法或層析法。此種方法基于物質溶解度、蒸氣壓

2、、吸附能力、立體結構或離解度、蒸氣壓、吸附能力、立體結構或離子交換等物理化學性質的微小差異，使其子交換等物理化學性質的微小差異，使其在流動相和固定相之間的分配系數不同，在流動相和固定相之間的分配系數不同，而當兩相作相對運動時，組分在兩相間進而當兩相作相對運動時，組分在兩相間進行連續多次分配，從而達到彼此分離。行連續多次分配，從而達到彼此分離。2022-5-3海南大學農學院wss42022-5-3海南大學農學院wss52.2.色譜法發展簡史色譜法發展簡史nTswett19031903植物葉色素的實驗植物葉色素的實驗n19061906開創了液固色譜法理論開創了液固色譜法理論nKuhn,Ledere

3、r 19311931 重復實驗，并成功地分離了重復實驗，并成功地分離了6060多多種色素。種色素。nMartinMartin19401940提出液液色譜分配法提出液液色譜分配法n19411941提出氣液色譜分配法提出氣液色譜分配法nMartinMartin，SyngeSynge 1952 1952出臺完整的理論及實踐，并出臺完整的理論及實踐，并獲當年諾貝爾化學獎。獲當年諾貝爾化學獎。nGolayGolay19571957開創開管柱氣相色譜法開創開管柱氣相色譜法2022-5-3海南大學農學院wss6n20 20 世紀世紀 505060 60 年代年代氣相色譜為突破口的發展階段。氣相色譜為突破口的

4、發展階段。n70 70 年代進入高效色譜為代表的現代色譜階段。高壓液相年代進入高效色譜為代表的現代色譜階段。高壓液相色譜，高效快速色譜。色譜，高效快速色譜。n75 75 年出現離子色譜。年出現離子色譜。n70 70 年代末，計算機進入色譜領域，出現計算機控制的全年代末，計算機進入色譜領域，出現計算機控制的全自動色譜儀自動色譜儀n1981 1981 年，杜邦公司生產的能自動選擇最佳方案的液相色年，杜邦公司生產的能自動選擇最佳方案的液相色譜儀譜儀 “探索者探索者”。2022-5-3海南大學農學院wss73.3.色譜過程色譜過程 色譜方法的共同特點：色譜方法的共同特點：色譜分離體系都有流動相和固定相

5、兩個相。色譜分離體系都有流動相和固定相兩個相。 色譜過程中，流動相對固定相作連續的相對運動。色譜過程中，流動相對固定相作連續的相對運動。被分離樣品在兩相中具有不同的作用力，各組分被分離樣品在兩相中具有不同的作用力，各組分混合物在流動相的帶動下通過固定相，實現分離?；旌衔镌诹鲃酉嗟膸酉峦ㄟ^固定相，實現分離。 樣品在分離時的兩個基本點：樣品在分離時的兩個基本點：混合物中不同組分在柱內的差速遷移?；旌衔镏胁煌M分在柱內的差速遷移。同種組分在色譜體系遷移過程中分子分布離散。同種組分在色譜體系遷移過程中分子分布離散。2022-5-3海南大學農學院wss84.4.色譜法分類色譜法分類1 1）按兩相物理狀

6、態分類）按兩相物理狀態分類n用氣體作流動相氣相色譜；用液體作流動相用氣體作流動相氣相色譜；用液體作流動相液相色譜；固定相可以是液體或氣體，便可組合液相色譜；固定相可以是液體或氣體，便可組合成四種主要色譜類型。成四種主要色譜類型。 氣固色譜氣固色譜（gas-solid chromatography，GSC ） 氣液色譜氣液色譜（ gas-liquid chromatography ，GLC ） 液固色譜液固色譜（liquid - solid chromatography ，LSC) 液液色譜液液色譜（ liquid - liquid chromatography ，LLC)2022-5-3海南大

7、學農學院wss92）按固定相的形態分類）按固定相的形態分類柱層析柱層析 (column chromatography) 固定相裝在柱內即為層析柱固定相裝在柱內即為層析柱, ,根據層析柱的尺寸，根據層析柱的尺寸，結構和制備方法不同，分為填充柱層析和毛細管柱或結構和制備方法不同，分為填充柱層析和毛細管柱或開管柱層析。開管柱層析。平板層析平板層析(planar chromatography) 固定相呈平板狀，包括薄層層析、薄膜層析和紙層固定相呈平板狀，包括薄層層析、薄膜層析和紙層析。固定相以均勻薄層涂敷在玻璃板、塑料板或有機析。固定相以均勻薄層涂敷在玻璃板、塑料板或有機薄膜，或將固定相直接制成薄板狀

8、，稱為薄層層析薄膜，或將固定相直接制成薄板狀，稱為薄層層析(TLC)，用濾紙作為固定相或固定相載體的層析為紙，用濾紙作為固定相或固定相載體的層析為紙層析層析(PC)。 2022-5-3海南大學農學院wss103)3)按分離過程物理化學原理分類按分離過程物理化學原理分類吸附層析吸附層析 (absorption chromatography)(absorption chromatography)n 用固體吸附劑作層析的固定相，樣品各組分在吸用固體吸附劑作層析的固定相，樣品各組分在吸附劑上吸附力的大小不同，而將各組分分離。如氣附劑上吸附力的大小不同，而將各組分分離。如氣固吸附層析和液固吸附層析。固吸

9、附層析和液固吸附層析。分配層析分配層析 (partition chromatography)(partition chromatography)n 用液體作固定相，樣品組分（溶質）在固定相中用液體作固定相，樣品組分（溶質）在固定相中溶解、吸附或吸著能力不同，因而在兩相之間分配系溶解、吸附或吸著能力不同，因而在兩相之間分配系數不同將樣品組分分離。如氣液分配層析、液液數不同將樣品組分分離。如氣液分配層析、液液分配層析。在液液分配層析中，根據流動相和固定分配層析。在液液分配層析中，根據流動相和固定相對極性不同，又分為相對極性不同，又分為正相色譜正相色譜和和反相層析反相層析。 2022-5-3海南大學

10、農學院wss11正相分配色譜與反相分配色譜正相分配色譜與反相分配色譜A.正相分配層析正相分配層析 normal phase partition chromatographyn 一般以強極性、親水性物質或溶液為固定相，非一般以強極性、親水性物質或溶液為固定相，非極性、弱極性或親脂性溶劑為流動相，稱極性、弱極性或親脂性溶劑為流動相，稱正相層析正相層析（ NPC)。B.反相分配層析反相分配層析 reversed phase partition chromatographyn 以非極性、親脂性物質或溶液為固定相，以極以非極性、親脂性物質或溶液為固定相，以極性、親水性溶劑或水溶液為流動相，稱性、親水性溶

11、劑或水溶液為流動相，稱反相層析反相層析（ RPC)。2022-5-3海南大學農學院wss12其他層析其他層析離子交換層析離子交換層析 ion-exchange chromatography離子對層析離子對層析 ion-pair chromatography凝膠層析凝膠層析 gel chromatography絡合層析絡合層析 complexation chromatography親和層析親和層析 affinity chromatography2022-5-3海南大學農學院wss132022-5-3海南大學農學院wss14操作簡便、快速、自動化操作簡便、快速、自動化效果靈敏、精確效果靈敏、精確2

12、022-5-3海南大學農學院wss15層析法的優點層析法的優點n生物大分子的特點：生物大分子的特點：以多樣性，復雜性的形式存在；以以多樣性，復雜性的形式存在；以混合物，復雜的結構形式存在；對環境如溫度、混合物，復雜的結構形式存在；對環境如溫度、pH 條條件，離子強度的要求較高。件，離子強度的要求較高。n用于研究的樣品要求：用于研究的樣品要求：一定的質和量，保存生物活性和一定的質和量，保存生物活性和嚴格的構象。嚴格的構象。n層析法的優點：層析法的優點：在室溫下操作，流動相可以具有與生理在室溫下操作，流動相可以具有與生理液相似的液相似的 pH 值，可以為含鹽的緩沖溶液或可與水互溶值，可以為含鹽的緩

13、沖溶液或可與水互溶的有機溶劑，柱填料的表面經各種相應化學修飾和覆蓋的有機溶劑，柱填料的表面經各種相應化學修飾和覆蓋為生物大分子的分離提供了溫和的條件和為生物大分子的分離提供了溫和的條件和 軟接觸軟接觸 ，利于保持其原有的構象和生理活性。利于保持其原有的構象和生理活性。2022-5-3海南大學農學院wss16色譜文獻色譜文獻 n專著：專著：色譜技術叢書色譜技術叢書，化學工業出版社，一套，化學工業出版社，一套23本，涵蓋本，涵蓋所有色譜技術：所有色譜技術：色譜分析概論色譜分析概論 色譜儀器維護與故障排除色譜儀器維護與故障排除色譜定性和定量色譜定性和定量 制備色譜技術及應用制備色譜技術及應用氣相色譜

14、檢測方法氣相色譜檢測方法 親和色譜方法及應用親和色譜方法及應用液相色譜檢測方法液相色譜檢測方法 裂解氣相色譜方法及應用裂解氣相色譜方法及應用氣相色譜方法及應用氣相色譜方法及應用 色譜手性分離技術及應用色譜手性分離技術及應用高效液相色譜方法及應用高效液相色譜方法及應用 氣相色譜在石油化工中的應用氣相色譜在石油化工中的應用平面色譜方法及應用平面色譜方法及應用 色譜在環境分析中的應用色譜在環境分析中的應用離子色譜方法及應用離子色譜方法及應用 色譜在食品安全分析中的應用色譜在食品安全分析中的應用毛細管電泳技術及應用毛細管電泳技術及應用 色譜在生命科學中的應用色譜在生命科學中的應用色譜分析樣品處理色譜分

15、析樣品處理 色譜在藥物分析中的應用色譜在藥物分析中的應用色譜聯用技術色譜聯用技術 色譜在無機材料分析中的應用色譜在無機材料分析中的應用色譜柱技術色譜柱技術2022-5-3海南大學農學院wss17主要期刊與雜志主要期刊與雜志n色譜科學雜志（色譜科學雜志（J，Chromatography Sci）1963年創刊年創刊,原原名氣相色譜雜志，名氣相色譜雜志，1969年改為現名，主要發表氣相、液相原年改為現名，主要發表氣相、液相原始論文和總結性文章（英文）和色譜標準圖譜。始論文和總結性文章（英文）和色譜標準圖譜。n色譜雜志（色譜雜志（J， Chromatograpy）1958年創刊年創刊,系多科性（包系

16、多科性（包括氣相、液相色譜，薄層色譜，紙色譜，離子交換色譜等）括氣相、液相色譜，薄層色譜，紙色譜，離子交換色譜等）國際雜志，刊登各種原始論文及講座性文章，并附有定性、國際雜志，刊登各種原始論文及講座性文章，并附有定性、定量數據及色譜文摘，文章以英文、法文或德文發表，從定量數據及色譜文摘，文章以英文、法文或德文發表，從1993年起分年起分A、B卷發行，每年還有卷發行，每年還有Review專輯。專輯。nJouynal of Chromatography Library, 不定期出版。不定期出版。n色層法（色層法（Chromatographia），），1968年創刊，多科性國際雜年創刊，多科性國際雜

17、志，亦稱色譜快報，文章以英文、法文、或德文發表，并附志，亦稱色譜快報，文章以英文、法文、或德文發表，并附有三種文字的摘要。有三種文字的摘要。2022-5-3海南大學農學院wss18n液相色譜雜志（液相色譜雜志（J, of Liquid Chromatography），），1978年創年創刊，主要發表刊，主要發表HPLC的研究報告。的研究報告。n高分離色譜與色譜通訊（高分離色譜與色譜通訊（J.of High Resolution Chromatography and Chromatography Communication）1978年創刊。年創刊。n色譜色譜，1984年創刊，刊登各種原始論文和綜

18、述，為雙年創刊，刊登各種原始論文和綜述，為雙月刊。月刊。n刊登色譜文章和評論性文章的還有各種分析化學相關的雜刊登色譜文章和評論性文章的還有各種分析化學相關的雜志，如各國的志，如各國的“分析化學分析化學”（美、英、日、德等），（美、英、日、德等），Analytical Chemistry；Analytical Chemistry Acta；Journal of Analytical and Applied Pyrolysis。2022-5-3海南大學農學院wss19色譜網站色譜網站 (日本島津公司日本島津公司)qhttp:/(瓦里安公司瓦里安公司)qhttp:/www.perkin-(PE公司公

19、司)qhttp:/ 第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析 第二節第二節 薄層層析薄層層析 第三節第三節 聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析2022-5-3海南大學農學院wss21n吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相是以固體吸附劑為固定相（床），以有機溶劑或緩沖液為流動相構（床），以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱狀的一種層析方法。成柱狀的一種層析方法。極性：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁極性：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁非極性：活性炭非極性：活性炭吸附劑吸附劑2022-5-3海南大學農學院wss22第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術語一、常用術語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗

20、脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss23一一. .常用術語：常用術語：1. 1. 固定相固定相2. 2. 流動相流動相3. 3. 層析層析4. 4. 操作容量操作容量5. 5. 床體積床體積6. 6. 洗脫體積洗脫體積7. 7. 膨脹度膨脹度8. 8. 分配系數，遷移率分配系數，遷移率 固定相固定相流動相流動相層析層析洗脫體積洗脫體積 Ve床體積床體積 Vt2022-5-3海南大學農學院wss24 1.固定相固定相 固定相固定相是能與相關的化合物進行可逆性的吸是能與相關的化合物進行可逆性的吸附、溶解和交換

21、作用的物質。附、溶解和交換作用的物質。固定相由層析基質組成，基質包括固體物質固定相由層析基質組成，基質包括固體物質（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質（如固定在（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質（如固定在纖維素或硅膠上的溶液）。纖維素或硅膠上的溶液）。2022-5-3海南大學農學院wss25 2.流動相流動相 流動相流動相是在層析過程中推動固定相上的物質是在層析過程中推動固定相上的物質向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相。向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相。2022-5-3海南大學農學院wss26 3.層析層析 以基質為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或以基質為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣

22、體為流動相，有效成分和雜質在這兩個相中連續氣體為流動相，有效成分和雜質在這兩個相中連續多次地進行分配、吸附或交換作用，最終結果是使多次地進行分配、吸附或交換作用，最終結果是使混合物得到分離。混合物得到分離。平衡液、洗滌液、洗脫液平衡液、洗滌液、洗脫液2022-5-3海南大學農學院wss27 4.操作容量操作容量 即在特定條件下，某種成分與基質反應達到即在特定條件下，某種成分與基質反應達到平衡時，存在于基質上的飽和容量，一般以每克平衡時，存在于基質上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質結合某種成分的毫摩爾數或毫克（或毫升）基質結合某種成分的毫摩爾數或毫克數來表示。數來表示。 2022-5-3海南

23、大學農學院wss285.床體積（床體積（Vt） 通常床體積是指膨脹后的基質在層析柱中所通常床體積是指膨脹后的基質在層析柱中所占有的體積（占有的體積（Vt）。）。Vt是基質的外水體積（是基質的外水體積（Vo）和內水體積（和內水體積（Vi）以及自身體積（）以及自身體積（Vg）的總和。）的總和。即即 VtVo十十Vi十十Vg2022-5-3海南大學農學院wss297.膨脹度膨脹度 在一定溶液中，單位重量的基質充分溶脹后所占在一定溶液中，單位重量的基質充分溶脹后所占有的體積，用有的體積，用V表示。即每克溶脹基質所具有的表示。即每克溶脹基質所具有的床體積。床體積。6.洗脫體積（洗脫體積（Ve） 洗脫體積

24、是指某一成分從柱頂部到底部的洗洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現濃度達到最大值時的流動相體積。脫液中出現濃度達到最大值時的流動相體積。2022-5-3海南大學農學院wss308.分配系數和遷移率分配系數和遷移率 分配系數分配系數是指一組分在固定相與是指一組分在固定相與流動相中含量的比值。常用流動相中含量的比值。常用K表示。表示。 遷移率遷移率是指一組分在相同時間內，是指一組分在相同時間內，在固定相移動的距離與流動相移動距在固定相移動的距離與流動相移動距離之比值，常用離之比值，常用Rf表示。表示。 2022-5-3海南大學農學院wss31外水體積外水體積 VoVo洗脫體積洗脫體積

25、VeVe流流動動相相固固定定相相層析柱層析柱層析床層析床床體積外水體積基質體積內水體積床體積外水體積基質體積內水體積 Vt Vt Vo Vo Vg Vg ViViK 在固定相中的含量在固定相中的含量在流動相中的含量在流動相中的含量Rf 在固定相中移動的距離在固定相中移動的距離在流動相中移動的距離在流動相中移動的距離2022-5-3海南大學農學院wss32第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術語一、常用術語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss33二、基

26、本原理二、基本原理 生物大分子在層析柱中與吸附劑顆粒的表生物大分子在層析柱中與吸附劑顆粒的表面吸附位點以范德華引力、靜電引力作用進行面吸附位點以范德華引力、靜電引力作用進行可逆性結合。在洗脫劑，流動相的作用下，生可逆性結合。在洗脫劑，流動相的作用下，生物大分子通過吸附解吸附再吸附再解吸物大分子通過吸附解吸附再吸附再解吸附的連續歷程。依據分子各成份與吸附劑結合附的連續歷程。依據分子各成份與吸附劑結合力之間的差異而達到分開。力之間的差異而達到分開。2022-5-3海南大學農學院wss342022-5-3海南大學農學院wss35例：豬腎二胺氧化酶在羥基磷灰石吸附層析例：豬腎二胺氧化酶在羥基磷灰石吸附

27、層析柱中的分離柱中的分離梯度鹽緩沖液梯度鹽緩沖液雜蛋白雜蛋白 氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶雜蛋白雜蛋白鹽析的樣品液鹽析的樣品液吸收值吸收值2022-5-3海南大學農學院wss36關于吸附層析分離效果的因素關于吸附層析分離效果的因素n吸附劑的性質吸附劑的性質n洗脫劑的性質洗脫劑的性質n層析柱及裝填技術層析柱及裝填技術n對樣品的要求對樣品的要求n加樣方式及加樣量加樣方式及加樣量n柱效（踏板理論）柱效（踏板理論） 柱長柱長 L樣品高度樣品高度H踏板理論數踏板理論數N 樣品高度樣品高度H柱長柱長 L2022-5-3海南大學農學院wss37第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術語一、常用術語二、基本原

28、理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss38三、吸附劑三、吸附劑1.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇n選擇性好選擇性好: : 對不同物質的吸附力的差異性。對不同物質的吸附力的差異性。n表面積大：表面積大：增加吸附容量。增加吸附容量。n性質穩定：性質穩定：不與被分離物、洗脫劑及溶劑發生化不與被分離物、洗脫劑及溶劑發生化學反應學反應, ,不分解不破壞被分離物，在一定范圍的不分解不破壞被分離物，在一定范圍的酸堿，一定的操作壓時不變形、不破碎。酸堿，一定的操作壓時不變形、不破碎。n

29、顆粒的大小尺寸適合、均勻、顏色淺、便于觀察。顆粒的大小尺寸適合、均勻、顏色淺、便于觀察。 2022-5-3海南大學農學院wss392.常用吸附劑的特點常用吸附劑的特點1）羥基磷灰石：羥基磷灰石：性質穩定，吸附容量大，適用范性質穩定，吸附容量大，適用范圍廣。圍廣。2 2）硅膠：硅膠：化學惰性，吸附容量大。化學惰性，吸附容量大。n極性強的吸附劑易吸附極性強的物質，非極性極性強的吸附劑易吸附極性強的物質，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質。為便于解吸附，的吸附劑易吸附非極性的物質。為便于解吸附，故在分離極性大的物質應選擇極性小的吸附劑，故在分離極性大的物質應選擇極性小的吸附劑，反之亦然。反之亦然。 2

30、022-5-3海南大學農學院wss402022-5-3海南大學農學院wss41第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術語一、常用術語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss42四、溶劑與洗脫劑四、溶劑與洗脫劑n溶劑：溶劑：溶解樣品的溶液。溶解樣品的溶液。n洗脫液：洗脫液：洗脫吸附柱的溶液。洗脫吸附柱的溶液。n通常為相同的成份或同一種組分。通常為相同的成份或同一種組分。n選擇時，根據樣品組分的溶解度、吸附劑的性選擇時，根據樣品組分的溶解度、吸附劑的性質、溶劑

31、的極性方面考慮極性大的洗脫能力大，質、溶劑的極性方面考慮極性大的洗脫能力大，因此可先用極性小的作溶劑，使組分易被吸附，因此可先用極性小的作溶劑，使組分易被吸附，然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分易從然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分易從吸附柱中洗出。吸附柱中洗出。 2022-5-3海南大學農學院wss43洗脫劑的性質洗脫劑的性質n性質穩定：性質穩定：不改變吸附劑的性質，如溶脹或收不改變吸附劑的性質，如溶脹或收縮?？s。n純度高：純度高：防止流動相中的雜質在吸附柱上的積防止流動相中的雜質在吸附柱上的積累形成的污染。累形成的污染。n無吸收背景：無吸收背景：提高檢測的靈敏度。提高檢測的靈敏度。n低

32、粘度：低粘度：高粘度時降低溶質擴散、增加柱壓，高粘度時降低溶質擴散、增加柱壓，降低效率。降低效率。n溶解度理想溶解度理想n樣品容易回收樣品容易回收2022-5-3海南大學農學院wss44第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術語一、常用術語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss45五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作 柱層析的設柱層析的設備主要有層析柱、備主要有層析柱、部分收集器、磁部分收集器、磁力攪拌器和恒流力攪拌器和恒流泵。有條件時，

33、泵。有條件時，配置一臺檢測儀配置一臺檢測儀就構成一個完整就構成一個完整的層析系統。詳的層析系統。詳見下圖見下圖3-4。2022-5-3海南大學農學院wss462022-5-3海南大學農學院wss472022-5-3海南大學農學院wss482022-5-3海南大學農學院wss492022-5-3海南大學農學院wss501 1層析柱層析柱n柱材質：柱材質：通常是玻璃的通常是玻璃的n柱子的裝填（干裝與濕裝）及大小類型柱子的裝填（干裝與濕裝）及大小類型n吸附層析柱吸附層析柱 d: h 1:10d: h 1:101:40 1:40 ，特殊，特殊的可為的可為4 4：3.63.6。n層析柱的床體積是由吸附劑

34、的量和膨脹度層析柱的床體積是由吸附劑的量和膨脹度決定的。決定的。2022-5-3海南大學農學院wss512吸附劑的用量及準備吸附劑的用量及準備n吸附劑的用量是根據其自身的操作容量和分離物吸附劑的用量是根據其自身的操作容量和分離物中各成分的性質所決定。中各成分的性質所決定。n當操作容量高時，吸附劑用量少。當操作容量高時，吸附劑用量少。n在裝柱前吸附劑要用溶劑平衡，另外還需作一些在裝柱前吸附劑要用溶劑平衡，另外還需作一些預處理。預處理。2022-5-3海南大學農學院wss523.3.裝柱裝柱n裝柱裝柱是是最關鍵最關鍵的一步。的一步。n重力沉降法裝柱。重力沉降法裝柱。n陸續不斷地添加糊狀物，使其形成

35、的膠粒床面上陸續不斷地添加糊狀物，使其形成的膠粒床面上有膠粒連續有膠粒連續均勻地沉降均勻地沉降，直至裝柱物完全沉降至，直至裝柱物完全沉降至適當的柱床體積為止。適當的柱床體積為止。 n柱的表面始終要保持著一層溶劑柱的表面始終要保持著一層溶劑( (一般一般l l3cm3cm柱柱高高) )柱的任何一部分絕對柱的任何一部分絕對不能不能“流干流干”。2022-5-3海南大學農學院wss53加適量溶劑加適量溶劑到柱內到柱內攪勻攪勻預先用溶劑浸泡好的預先用溶劑浸泡好的吸附劑，吸附劑，連續連續傾入柱中傾入柱中自然沉降自然沉降至柱高的至柱高的1/41/3時時打開柱下端出口打開柱下端出口裝柱（干裝法和濕裝法）裝柱

36、（干裝法和濕裝法）懸浮液徐徐下降至需要的高度懸浮液徐徐下降至需要的高度2022-5-3海南大學農學院wss544.4.平衡平衡 n層析柱正式使用前，必須平衡至所需的層析柱正式使用前，必須平衡至所需的pHpH和離和離子強度，一般用起始緩沖液在恒定壓力下走柱，子強度，一般用起始緩沖液在恒定壓力下走柱，其洗脫體積相當于其洗脫體積相當于3 35 5倍床體積，使交換劑充倍床體積，使交換劑充分平衡，柱床穩定。分平衡，柱床穩定。2022-5-3海南大學農學院wss555上樣和洗脫上樣和洗脫平衡層析柱平衡層析柱分離樣品的溶液加到固定相表面分離樣品的溶液加到固定相表面樣品液的液面流到固定相表面時，用滴管加入洗脫

37、劑樣品液的液面流到固定相表面時，用滴管加入洗脫劑收集收集濃度或活性測定濃度或活性測定2022-5-3海南大學農學院wss56(1)(1)層析樣品的要求層析樣品的要求n樣品的溶解度好，樣品中的不溶物在上樣前用離樣品的溶解度好，樣品中的不溶物在上樣前用離心法或過濾法除去。心法或過濾法除去。n加入的樣品量利于提高分辨率；加樣量加入的樣品量利于提高分辨率；加樣量 VtVt VtVt。n樣品的濃度與粘度的考慮。樣品的濃度與粘度的考慮。n一般使其與起始緩沖液有相同一般使其與起始緩沖液有相同pHpH，低的離子強度，低的離子強度和盡可能小的體積。和盡可能小的體積。210112022-5-3海南大學農學院wss

38、57（2 2）加樣方法）加樣方法 有有3 3種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：A.A.簡單的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心簡單的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加樣；地用移液管加樣；2022-5-3海南大學農學院wss58B.B.不需要讓柱流干至床表面，而是加入不需要讓柱流干至床表面，而是加入1 1濃度濃度的蔗糖來增加樣品的密度；的蔗糖來增加樣品的密度；C.C.方法是用一個毛細管和一個注射器或蠕動泵把方法是用一個毛細管和一個注射器或蠕動泵把樣品直接傳送到柱表面樣品直接傳送到柱表面( (如一些商品柱附有專門如一些商品柱附有專門加樣裝置加樣

39、裝置) )。 2022-5-3海南大學農學院wss59(3(3）洗脫）洗脫 洗脫：洗脫：吸附在柱中的混合樣品在洗脫劑的推動下不吸附在柱中的混合樣品在洗脫劑的推動下不斷發生溶解（解吸附）、吸附、再溶解、再吸附，斷發生溶解（解吸附）、吸附、再溶解、再吸附，被吸附的物質解吸并隨洗脫劑向前移動，又吸附到被吸附的物質解吸并隨洗脫劑向前移動，又吸附到新的吸附劑上，新流出的洗脫劑又進行解吸，如此新的吸附劑上，新流出的洗脫劑又進行解吸，如此反復，各組分的分子結構不同，其吸附能力及溶解反復，各組分的分子結構不同，其吸附能力及溶解能力的差別，導致移動距離的差異，使各種成份形能力的差別，導致移動距離的差異，使各種成

40、份形成各自的區帶，若分離物是有色的，便看見色譜層，成各自的區帶，若分離物是有色的，便看見色譜層，使樣品得以分離及純化。使樣品得以分離及純化。2022-5-3海南大學農學院wss60 圖中的圖中的A A峰和峰和B B峰均呈對稱形，峰均呈對稱形，二者沒有重疊，二者沒有重疊，這表明樣品液中這表明樣品液中的組分已完全分的組分已完全分開。開。 層析峰的面積層析峰的面積（FEGFEG）、峰高）、峰高（BEBE）和半峰高）和半峰高寬度（寬度（HIHI）等參）等參數是定性、定量數是定性、定量洗脫物的依據。洗脫物的依據。2022-5-3海南大學農學院wss616.6.流速與分離效果流速與分離效果流速太慢，前峰流

41、速太慢，前峰托尾與后峰相連托尾與后峰相連流速太快，流速太快，組分分不開組分分不開正常的流速使正常的流速使組分完全分離組分完全分離0-1 M(NH4)2SO4梯梯度解吸附氧化酶度解吸附氧化酶2022-5-3海南大學農學院wss62 為了獲得滿意的分離結果，洗脫液的流速務為了獲得滿意的分離結果，洗脫液的流速務必恰當控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡必恰當控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡過程不完全；如果太慢，洗脫物會擴散。過程不完全；如果太慢，洗脫物會擴散。 流速可以通過調節流速可以通過調節“操作壓操作壓”來控制，來控制，“操操作壓作壓”相當于在柱上部的貯液瓶中溶劑的水平和相當于在柱上部的貯液

42、瓶中溶劑的水平和柱出水口位置的水平之差。柱出水口位置的水平之差。 獲得穩定流速的另一方法是利用蠕動泵把洗獲得穩定流速的另一方法是利用蠕動泵把洗脫液泵入或泵出柱，并保持穩定流速。脫液泵入或泵出柱，并保持穩定流速。 2022-5-3海南大學農學院wss637.7.分部收集分部收集 8.8.檢測和合并收集檢測和合并收集 n為了測定收集的各部分中各種成分的分布須用一為了測定收集的各部分中各種成分的分布須用一些能特異地檢測被分離化合物的方法來進行分析，些能特異地檢測被分離化合物的方法來進行分析，一般可用直接或間接方法：一般可用直接或間接方法： n直接法有分光光度法、光折射法、熒光法等。直接法有分光光度法

43、、光折射法、熒光法等。 n間接法包括化學顯色法、等電聚焦法、電泳法、間接法包括化學顯色法、等電聚焦法、電泳法、薄層層析法和生物活性測定法等。薄層層析法和生物活性測定法等。2022-5-3海南大學農學院wss64n洗脫液的合并方法對目的物質量和產量有較大的洗脫液的合并方法對目的物質量和產量有較大的影響。欲得高純度的化合物，一般根據洗脫峰位影響。欲得高純度的化合物，一般根據洗脫峰位置收集合并較窄的部分；欲得產量較多目的物，置收集合并較窄的部分；欲得產量較多目的物，則合并較寬部分。則合并較寬部分。2022-5-3海南大學農學院wss659.9.層析峰的分析及處理層析峰的分析及處理AB 1 B2 B3

44、A:體積超載體積超載B B ：質量超載。：質量超載。B1 樣品有沉淀；B2 流動相有溶質； B3 組分出現結晶2022-5-3海南大學農學院wss6610吸附劑的再生吸附劑的再生 用過的吸附劑，經適當方法處理后，又恢復用過的吸附劑，經適當方法處理后，又恢復其性能的過程稱吸附劑的再生。其性能的過程稱吸附劑的再生。 一般不同吸附劑（或基質）的再生方法是不一般不同吸附劑（或基質）的再生方法是不同的。同的。2022-5-3海南大學農學院wss6711.11.最佳加樣量與踏板理論最佳加樣量與踏板理論 踏板理論是把整個層析柱長比喻為蒸餾塔（踏板理論是把整個層析柱長比喻為蒸餾塔（ L L ），），在某一段柱

45、長范圍內溶質在固定相和流動相之間達到在某一段柱長范圍內溶質在固定相和流動相之間達到平衡，這一段柱長便相當于一個理論踏板的高度（平衡，這一段柱長便相當于一個理論踏板的高度（H H）踏板理論數（）便表示柱內溶質譜帶的分布。踏板理論數（）便表示柱內溶質譜帶的分布。 表示法：表示法：踏板理論數與踏板理論高度呈反比的關系。踏板理論數與踏板理論高度呈反比的關系。N=LH2022-5-3海南大學農學院wss682022-5-3海南大學農學院wss69提高踏板理論數提高踏板理論數n降低洗脫液的粘度降低洗脫液的粘度n適當降低流速適當降低流速n提高柱溫提高柱溫n匹配微量分離檢測技術匹配微量分離檢測技術 n選用毛細

46、管層析柱選用毛細管層析柱n柱定長時加大柱直徑柱定長時加大柱直徑n固定相的粒度細小固定相的粒度細小n減少上樣的體積減少上樣的體積n較小的樣品分子較小的樣品分子2022-5-3海南大學農學院wss70 程序程序n裝填層析柱裝填層析柱n柱的平衡柱的平衡n加樣加樣n洗脫洗脫n收集收集n鑒定鑒定n繪制洗脫曲線繪制洗脫曲線n合并有效成份合并有效成份n計算含量（酶活力）計算含量（酶活力）n基質的再生基質的再生 注意注意n柱的柱的 d:h=1:101:40n吸附劑用量為樣品的吸附劑用量為樣品的 30 50 倍倍n分析時的加樣量一般分析時的加樣量一般 110Vtn 制備時的加樣量一般制備時的加樣量一般 12Vt

47、2022-5-3海南大學農學院wss71第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術語一、常用術語二、基本原理二、基本原理三三 、吸附劑、吸附劑四四 、洗脫劑、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss72六、應用實例六、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss732022-5-3海南大學農學院wss742022-5-3海南大學農學院wss75內容提要內容提要 第一節第一節 吸附柱層析吸附柱層析 第二節第二節 薄層層析薄層層析 第三節第三節 聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析2022-5-3海南大學農學院wss76第二節

48、第二節 薄層層析薄層層析Thin layer chromatography, TLCn將吸附劑在玻璃或滌綸膠片片基上均勻涂布成將吸附劑在玻璃或滌綸膠片片基上均勻涂布成薄膜或薄板，經過活化后，即可對樣品進行展薄膜或薄板，經過活化后，即可對樣品進行展層，達到分離、純化、制備、分析鑒定等目的。層，達到分離、純化、制備、分析鑒定等目的。優點：優點：n展層時間短展層時間短 設備簡單設備簡單 干擾因素小干擾因素小n適合定性及定量研究適合定性及定量研究 靈敏度高靈敏度高 顯色方便。顯色方便。2022-5-3海南大學農學院wss77R f值值nR f值為遷移率（值為遷移率（rate of flow, R f）

49、在一定條件下，某種物質的在一定條件下，某種物質的R f 值是常數。值是常數。R f值表示為：值表示為：原點到層析點中心的距離原點到層析點中心的距離 原點到溶劑前沿的距離原點到溶劑前沿的距離R f =2022-5-3海南大學農學院wss78第二節第二節 薄層層析薄層層析一、固定相支持介質的選擇一、固定相支持介質的選擇 二、操作及注意事項二、操作及注意事項三、應用實例三、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss79一、固定相支持介質的選擇一、固定相支持介質的選擇 （一）支持介質（基質）的性能（一）支持介質（基質）的性能 就其性質，可分為無機吸附劑就其性質，可分為無機吸附劑( (如氧化鋁、硅藻如

50、氧化鋁、硅藻土、磷酸鈣等土、磷酸鈣等) )和有機吸附劑和有機吸附劑( (如硅膠、聚酰胺、纖如硅膠、聚酰胺、纖維素和葡聚糖等維素和葡聚糖等) )。 吸附劑應具備的條件：吸附劑應具備的條件：(1)(1)純度高、雜質少。純度高、雜質少。 (2)(2)結構均勻，有一定比表面積。結構均勻，有一定比表面積。 (3)(3)穩定而具有一定機械強度，不與樣品組分和展層劑發穩定而具有一定機械強度，不與樣品組分和展層劑發生化學反應。生化學反應。 (4)(4)有適當的吸附能力，容易用展層劑把樣品組分從它的有適當的吸附能力，容易用展層劑把樣品組分從它的表面解吸下來。表面解吸下來。2022-5-3海南大學農學院wss80

51、（二）（二） 支持介質的選擇原則支持介質的選擇原則 介質的選擇應從兩方面考慮：介質的選擇應從兩方面考慮：(1)(1)樣品各組分的性質，即它們的溶解性、酸堿性樣品各組分的性質，即它們的溶解性、酸堿性及極性大??；及極性大小；(2)(2)支持介質的親和能力強弱。支持介質的親和能力強弱。 2022-5-3海南大學農學院wss812022-5-3海南大學農學院wss82第二節第二節 薄層層析薄層層析一、固定相支持介質的選擇一、固定相支持介質的選擇 二、操作及注意事項二、操作及注意事項三、應用實例三、應用實例2022-5-3海南大學農學院wss83操作及注意事項操作及注意事項n薄層層析薄層層析操作（以硅膠

52、吸附劑為例）操作（以硅膠吸附劑為例）薄板制備（鋪板）薄板制備（鋪板）點樣點樣展層展層顯顯色色R f值測定值測定結果分析等步驟結果分析等步驟2022-5-3海南大學農學院wss841.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇n硅膠硅膠n氧化鋁氧化鋁n吸附劑與樣品性質的關系吸附劑與樣品性質的關系2.2.制備薄板、薄層、薄膜制備薄板、薄層、薄膜n薄層的厚度與薄層的厚度與 R Rf f值值n薄層的活性測定薄層的活性測定2022-5-3海南大學農學院wss85硅膠的分類硅膠的分類l硅膠型號很多，其性質和組分硅膠型號很多，其性質和組分各不相同各不相同。l硅膠硅膠H系粘性差的純硅膠；系粘性差的純硅膠； 硅膠硅膠G系含系

53、含1015鍛石膏和鍛石膏和5淀粉的硅膠，粘性淀粉的硅膠，粘性好；好； 硅膠硅膠CMC系含有適量的羧甲基纖維素的硅膠；系含有適量的羧甲基纖維素的硅膠； 硅膠硅膠HF254系含有熒光劑的硅膠系含有熒光劑的硅膠H。l硅膠硅膠H能用腐蝕性顯色劑檢測，而硅膠能用腐蝕性顯色劑檢測，而硅膠G和硅膠和硅膠CMC則不能用。則不能用。2022-5-3海南大學農學院wss861.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇n硅膠硅膠n氧化鋁氧化鋁n吸附劑與樣品性質的關系吸附劑與樣品性質的關系2.2.制備薄板、薄層、薄膜制備薄板、薄層、薄膜n薄層的厚度與薄層的厚度與 R R f f值值n薄層的活性測定薄層的活性測定2022-5-3海

54、南大學農學院wss87n鋪板鋪板 ：（2.5 cm7.5 cm玻板）玻板） 鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀。鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀。l過稠，板容易出現拖動或停頓造成的層紋；過稠，板容易出現拖動或停頓造成的層紋；l過稀，水蒸發后，板表面較粗糙。過稀，水蒸發后，板表面較粗糙。l勻漿配比一般是硅膠勻漿配比一般是硅膠G : 水水=1 : 23，硅膠，硅膠G : 羧羧甲基纖維素鈉水溶液甲基纖維素鈉水溶液=1 : 2。2022-5-3海南大學農學院wss88簡易涂布簡易涂布半自動涂布半自動涂布自動涂布自動涂布2022-5-3海南大學農學院wss89硅膠薄層薄板的活性測定硅膠薄層薄板的活性測定蘇丹黃、蘇丹紅

55、、靛酚藍在活化蘇丹黃、蘇丹紅、靛酚藍在活化的薄層薄板上的層析行為的薄層薄板上的層析行為A B C D2022-5-3海南大學農學院wss904.4.展層劑的選擇展層劑的選擇種類：單一溶劑、混合溶劑種類：單一溶劑、混合溶劑 要求：要求：*將混合樣品分開將混合樣品分開 * *易揮發，粘度小，組成簡單易揮發，粘度小，組成簡單 * *對樣品的定性與定量無干擾對樣品的定性與定量無干擾 * *毒性小，對人與環境安全毒性小，對人與環境安全選擇：選擇：選用時考慮展層劑的極性與溶解度，極性、溶選用時考慮展層劑的極性與溶解度，極性、溶解度與樣品展層距離呈正比的關系。解度與樣品展層距離呈正比的關系。 3.3.點樣點

56、樣2022-5-3海南大學農學院wss91不同展層劑對物質的分離影響不同展層劑對物質的分離影響n咖啡酸與綠原酸在極性不同的咖啡酸與綠原酸在極性不同的展層劑中的分離效果展層劑中的分離效果2022-5-3海南大學農學院wss92單一溶劑極性大小的次序單一溶劑極性大小的次序n石油醚環己烷二硫化碳四氯化碳苯石油醚環己烷二硫化碳四氯化碳苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙酸丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙酸2022-5-3海南大學農學院wss935.展層與顯色展層與顯色展層方式展層方式n上行展開與下行展開上行展開與下行展開n一次展開與二次展開一次展開與二次展開n連續

57、展開與填補展開連續展開與填補展開n單向展開與雙向展開單向展開與雙向展開n濃度梯度展開濃度梯度展開n圓心展開圓心展開顯色選擇顯色選擇n特異性顯色劑特異性顯色劑n腐蝕性顯色劑腐蝕性顯色劑n薄板中含熒光素薄板中含熒光素2022-5-3海南大學農學院wss942022-5-3海南大學農學院wss95n顯色顯色 噴顯色劑顯色噴顯色劑顯色最重要是有好的霧最重要是有好的霧化器?；鳌?022-5-3海南大學農學院wss962022-5-3海南大學農學院wss972022-5-3海南大學農學院wss986.特殊薄層特殊薄層n針對某些性質特殊的化合物的分離與檢出，有時針對某些性質特殊的化合物的分離與檢出，有時需

58、采用一些特殊薄層。需采用一些特殊薄層。 熒光薄層熒光薄層 絡合薄層絡合薄層 酸堿薄層和酸堿薄層和pH緩沖薄層緩沖薄層 2022-5-3海南大學農學院wss99 熒光薄層熒光薄層n有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當的顯色劑時，則可當的顯色劑時，則可在吸附劑中加入熒光物質在吸附劑中加入熒光物質制成熒光制成熒光薄層進行層析。薄層進行層析。n展層后展層后置于紫外光下照射置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒斑點處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質多

59、為無機物。其一是在光物質多為無機物。其一是在254 nm紫外光激發下顯出紫外光激發下顯出熒光的，如錳激活的硅酸鋅。另一種為在熒光的，如錳激活的硅酸鋅。另一種為在365 nm紫外光紫外光激發下發出熒光的，如銀激化的硫化鋅等。激發下發出熒光的，如銀激化的硫化鋅等。 2022-5-3海南大學農學院wss100 絡合薄層絡合薄層n常用的有硝酸銀薄層。用來分離碳原子數相等而其常用的有硝酸銀薄層。用來分離碳原子數相等而其中中CC雙鍵數目不等的一系列化合物，如不飽和醇、雙鍵數目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。酸等。n其主要機理是由于不飽和其主要機理是由于不飽和CC鍵能與硝酸銀形成絡鍵能與硝酸銀形成絡合

60、物，而飽和的合物，而飽和的CC鍵則不與硝酸銀絡合。因此在鍵則不與硝酸銀絡合。因此在硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時飽和化合物由于吸附最弱而分離。層析時飽和化合物由于吸附最弱而R f最高，最高，含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的Rf值高，含一個三鍵值高，含一個三鍵的較含一個雙鍵的的較含一個雙鍵的Rf值高。此外，在一個雙鍵化合值高。此外，在一個雙鍵化合物中，順式的與硝酸銀絡合較反式的易于進行。因物中，順式的與硝酸銀絡合較反式的易于進行。因此，還可用來分離順反異構體。此，還可用來分離順反異構體。 2022-5-3海