1、豇豆根腐病病原分離鑒定及其核糖體rDNA-ITS序列分析豇豆根腐病病原分別鑒定及其核糖體rDNA-ITS序列分析03Pathogeny Isolation and Identification of Cowpea Root Rot Disease and Sequencingof Ribosomal rDNA-ITS ， ， ， V S， ， ， ， ， ： rot disease， ， ， rot disease ： rot disease； ； ； ； 豇豆是我國主要蔬菜作物之一，其多季節(jié)、多模式、多花色和短周期栽培成為農(nóng)民增收的主導(dǎo)性蔬菜。湖北常年種植面積萬，武漢市豇豆種植面積約萬，作為

2、“豇豆之鄉(xiāng)的武漢市新洲區(qū)雙柳街，年種植約萬次。但是生產(chǎn)中，常因栽培治理不當(dāng)或環(huán)境條件的影響，造成病害的流行，特殊是土傳病害。豇豆根腐病 是豇豆的一種典型的土傳病害，隨豇豆種植年數(shù)的增加、面積的擴大、品種的改變等，已成為豇豆上發(fā)病最重、危害最大、防治最困難的病害。本討論從武漢地區(qū)豇豆種植區(qū)采集并分別發(fā)病豇豆根腐病病菌，并進行鑒定，為后續(xù)的討論提供基礎(chǔ)材料和條件。 材料與方法 標(biāo)原來源與病原菌的分別純化標(biāo)樣于年采自武漢市蔬菜科學(xué)討論所試驗基地。病原真菌的分別方法參照方中達的植病討論方法有關(guān)介紹，選取新發(fā)病豇豆植株莖基部的根頸作為分別材料，進行常規(guī)組織分別，經(jīng)單孢純化、培育獲得單孢菌株。 致病性測定

3、接受法將發(fā)病組織上分別到的病原菌純培育物孢子制成懸浮液個孢子。接受自然傷根浸孢子液接種植株。取生長良好的無病豇豆苗，用無菌水將根頸部外表沖洗潔凈，然后使根完全浸在孢子懸浮液中 ，接種后植株定植于裝有滅菌沙土的花盆中。每個菌株接種 株苗，次重復(fù)，以無菌水為對比。植株置于 下光照培育箱中，接種后每隔 觀看次。發(fā)病后，從病斑處再次分別病原菌，確認致病菌。 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 上的病菌形態(tài)特征觀看 將供試菌株接種到培育基上， 恒溫培育。 后觀看培育基上的菌落形態(tài)，制作玻片，光學(xué)顯微鏡下觀看分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特征，并測量分生孢子的大小。 產(chǎn)孢表型觀看 產(chǎn)孢表型的觀看接受濾紙片法。參照張?zhí)煊畹姆椒ǎ?/p>

4、取濾紙剪成比載玻片稍小的長方形，將中心挖一邊長約 的方孔，滅菌后用無菌水潤濕放于無菌載玻片上。挑取少量活化的菌絲塊勻稱涂于濾紙ZY方孔的邊緣，然后將載玻片置于鋪有潮濕濾紙的滅菌培育皿中， 恒溫培育。 后顯微鏡下觀看產(chǎn)孢表型。 形態(tài)學(xué)鑒定根據(jù) 依據(jù)菌落形態(tài)、生長速度和色素顏色，大型分生孢子的樣子、頂細胞和基細胞的特征，小型分生孢子的有無、樣子和著生方式，分生孢子梗的特征和瓶梗類型，厚垣孢子有無和著生位置等特征，參照的分類系統(tǒng)進行病原菌種的鑒定。 病菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列比較 菌絲體的培育與收集 將斜面保存的菌株接種在培育基上進行活化。將活化后的菌株移接在鋪有滅菌玻璃紙的平板上每皿約 培育基

5、，每皿勻稱接種個菌絲塊，每菌株接個平板。于 暗培育 后，用滅菌解剖刀刮取菌絲，置于 保存?zhèn)溆谩?基因組的提取 基因組接受十六烷基三甲基溴化銨Cetrimo ，法提取和純化。將 菌絲體放入已滅菌的研缽中，倒入適量液氮充分研磨，將菌絲粉末裝入滅菌的 離心管中。每一離心管中加入 ×提取緩沖液 ， ， ， ， ， ， 巰基乙醇，渦旋混勻， 水浴鍋中水浴 ，期間顛倒混勻次。每管加入 氯仿異戊醇體積比抽提液，充分混勻后于 離心 。吸取上清液至潔凈離心管中，加等體積氯仿異戊醇再抽提次。將上清液轉(zhuǎn)入潔凈的離心管中，加倍體積的無水乙醇沉淀 ， 離心 ，去上清液，沉淀用乙酸沖洗次。將離心管置于 溫箱中枯

6、燥后用溶解沉淀，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后 冰箱保存?zhèn)溆谩?擴增 用真核生物核糖體通用引物和進行擴增。其序列為，：，：。 反應(yīng)條件 反應(yīng)體系總體積為 ，反應(yīng)液組分為：× ， ， ， 酶 ，模板 ，引物和 各 ，用使總體積到達 ，在 擴增儀上擴增。擴增條件： 預(yù)變性 ； 變性 ； 退火 ； 延長 ，共個循環(huán)； 延長 。產(chǎn)物托付南京金斯瑞生物公司進行純化和測序。 序列分析 將測序所得的菌株的序列與中核酸數(shù)據(jù)庫：中的區(qū)相關(guān)序列進行同源性比較。 結(jié)果與分析 病原菌的分別與培育從田間采集的發(fā)病植株，切取病株莖基部的維管束組織，按常規(guī)的組織分別法進行分別。經(jīng)組織分別，獲得個根腐病菌菌株。進行單孢純化

7、后，用于致病性測定。 致病性測定接種初期植株不顯癥狀，接種 左右見部分植株萎蔫，拔出植株，發(fā)覺其根部自根尖開始發(fā)生褐色病變，由側(cè)根延及主根，致整個根系壞死腐爛，剖檢病根，維管束呈紅褐色，并可延及根頸部，對比植株不發(fā)病圖。 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 上的病菌形態(tài)特征觀看 菌株在平板上培育，其菌落邊緣白色絮狀，生長快，底奶油黃色。菌絲濃密，質(zhì)地松軟，隆起。大型分生孢子較易產(chǎn)生，彎或直筒形，兩端鈍圓，較腫，多數(shù)為隔，大小為 × ；小型分生孢子微彎，為卵形或橢圓形，個分隔，大小為 × ；厚垣孢子較易產(chǎn)生，頂生或間生，單個球形或成對頂生，細胞壁粗糙圖。 產(chǎn)孢表型觀看 保濕培育 后在濾紙上可以

8、觀看到濾紙孔邊緣的薄層菌絲向ZY生長。培育 后在顯微鏡下觀看菌絲直徑、產(chǎn)孢表型。氣生菌絲有隔、無色、細長多分枝，產(chǎn)生種孢子，即大型分生孢子和小型分生孢子。大型分生孢子紡錘形至鐮刀形，多數(shù)為隔，大小為 × ；小型分生孢子梗發(fā)達而細長，分生孢子 個分隔，卵形至腎形，假頭狀著生，大小為 × 圖，。菌落生長 左右大量產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子頂生或間生，多數(shù)單個，球形，直徑 圖。 病原形態(tài)學(xué)鑒定 通過對菌株菌落形態(tài)、色素顏色、分生孢子梗、大小分生孢子形態(tài)，厚垣孢子形態(tài)等特征描述，參照檢索方法確定，該豇豆根腐病病原為半知菌亞門茄腐皮鐮孢菌 。 序列分析豇豆根腐病菌產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一個約為 的擴增條帶，與期望值相符。產(chǎn)物送南京金斯瑞生物公司進行序列測序結(jié)果說明，目的片段由個核苷酸組成，測序結(jié)果與中的序列用軟件進行同源性分析。序列分析說明，所分別的病原菌與中已公布的 登錄號為、相應(yīng)片段完全一致，同源性為，能夠比對上的堿基數(shù)目最多，值為最小值。依據(jù)生物信息學(xué)同源性比對的結(jié)果，將該菌鑒定為茄腐皮鐮孢菌 。此結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。 小結(jié)與商量本討論在真菌鑒定上以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，分子鑒定為補充，序列分析結(jié)果作為形態(tài)學(xué)鑒定的幫助驗證。在病原菌鑒定中，主要依據(jù)病菌在和其他培育基上的菌落形態(tài)、色素、大型分生