1、會計學1第一頁，共28頁。1 CRISPR-Cas概述概述(i sh)u1987年，日本大阪大學（年，日本大阪大學（Osaka University）在對一種細菌編碼）在對一種細菌編碼(bin m)的堿性磷酸酶（的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，發現在這個）基因進行研究時，發現在這個基因編碼基因編碼(bin m)區域的附近存在一小段不同尋常的區域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片片段，這些片段是由簡單的重復序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的段是由簡單的重復序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。特有的序列。u2013

2、以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature biotechnology等等著名雜志上發表多篇文章介紹著名雜志上發表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統，并且已成功在人類、小系統，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現精確的基因修飾。鼠、斑馬魚等物種上實現精確的基因修飾。第1頁/共27頁第二頁，共28頁。1 CRISPR-Cas概述概述(i sh)CRISPR-Cas：一種來源是細菌獲得性免疫的由：一種來源是細菌獲得性免疫的由RNA指導指導Cas蛋白對蛋白對靶向基因靶向基因(jyn)進行修飾的技術。進行修飾的技術。第2頁/共27頁第三頁，共28頁。CRISPR-C

3、as主要由兩部分主要由兩部分(b fen)組成：組成：識別識別(shbi)(shbi)切割切割(qig)(qig)1 CRISPR-Cas概述概述第3頁/共27頁第四頁，共28頁。1.1 CRISPR結構結構(jigu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的是一個特殊的DNA重復序列家族重復序列家族, 廣泛分布廣泛分布(fnb)于于細菌和古細菌基因組中。細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守的重復位點通常由短的高度保守的重復序列序列(repeats) 組

4、成組成, 重復序列的長度通常重復序列的長度通常 2148 bp, 重復序列之間重復序列之間被被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開。隔開。CRISPR就是通過這些間隔序就是通過這些間隔序列（列（space）與靶基因進行識別。）與靶基因進行識別。第4頁/共27頁第五頁，共28頁。1.1 CRISPR結構結構(jigu)第5頁/共27頁第六頁，共28頁。1.2 Cas家族家族(jiz)Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導下對靶位點進行切割。它與引導下

5、對靶位點進行切割。它與folk酶功能酶功能(gngnng)類似，但類似，但是它并不需要形成二聚體才能發揮作用。是它并不需要形成二聚體才能發揮作用。第6頁/共27頁第七頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)的發現的發現 CRISPR-Cas是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統，通過是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統，通過(tnggu)對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。切割，從而達到對自身的免疫。第7頁/共27頁第八頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)的發

6、現的發現第8頁/共27頁第九頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)的發現的發現第9頁/共27頁第十頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)的的發現發現 CRISPR-Cas系統賦予原核細胞針對外源系統賦予原核細胞針對外源DNA特異性免疫特異性免疫, 而而這種特異性是由間隔序列（這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細菌進化了擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細菌進化了CRISPR 介導介導的適應性免疫。這種免疫功能的發揮是由的適應性免疫。這種免疫功能的發揮是由CRI

7、SPR 間隔序列的動態間隔序列的動態性變化，即通過增加性變化，即通過增加(zngji)或刪除間隔序列（或刪除間隔序列（spacer）來實現的。）來實現的。第10頁/共27頁第十一頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)靶向要求靶向要求最主要最主要(zhyo)的要求：的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。第11頁/共27頁第十二頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)靶向靶向要求要求 在人類在人類(rnli)基因組中，平均每基因組中，平均每8bp就出現一個就出現一個NGG PAM。第12頁/共27頁第十三頁，共28

8、頁。2 CRISPR-Cas系統系統(xtng)靶向靶向要求要求第13頁/共27頁第十四頁，共28頁。3 CRISPR-Cas系統系統(xtng)介導基因修介導基因修飾飾第14頁/共27頁第十五頁，共28頁。3.1 dual-RNA：Cas介導編輯介導編輯(binj)模板替換模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發表的上發表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系統用設計好系統用設計好的的DNA模板替換的相應

9、模板替換的相應(xingyng)基因來達到基因的定向修飾。基因來達到基因的定向修飾。第15頁/共27頁第十六頁，共28頁。3.1 dual-RNA：Cas介導編輯介導編輯(binj)模板替換模板替換第16頁/共27頁第十七頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導基因修飾介導基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發表的上發表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用一文中，作者利用(lyng)人工合成的人工合成的sgRNAs能指導能指導Cas9

10、內源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。內源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。第17頁/共27頁第十八頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導基因修飾介導基因修飾第18頁/共27頁第十九頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導基因修飾介導基因修飾第19頁/共27頁第二十頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導基因修飾介導基因修飾Cas9sg-RNA第20頁/共27頁第二十一頁，共28頁。 2013年年2月月15日在日在science上發表的上發表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一個一文中

11、，作者利用一個(y )包含兩個靶向不同基因的包含兩個靶向不同基因的spacers的的crRNA實現了同時對兩個基因實現了同時對兩個基因進行編輯。進行編輯。3.3 cr-RNA：Cas介導雙基因修飾介導雙基因修飾 第21頁/共27頁第二十二頁，共28頁。3.3 cr-RNA：Cas介導雙基因修飾介導雙基因修飾 第22頁/共27頁第二十三頁，共28頁。4 CRISPR-Cas系統系統(xtng)前景分析前景分析 這是一項靶向基因修飾的革新這是一項靶向基因修飾的革新(gxn)技術，一項極具有可技術，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術。能獲得諾貝爾獎技術。第23頁/共27頁第二十四頁，共28頁。4 CRI

12、SPR-Cas系統系統(xtng)前景分析前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上發表上發表(fbio)的的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用一文中，作者利用TALENs和和CRISPRs對同一基因進行修飾，效率分別為對同一基因進行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。第24頁/共27頁第二十五頁，共28頁。4 CRISPR-Cas系統系統(xtng)前景分析前景分析

13、而且從實際應用的角度來說，而且從實際應用的角度來說，CRISPRs比比TALENs更容易更容易(rngy)操作，因為每一對操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個核苷酸就行。個核苷酸就行。第25頁/共27頁第二十六頁，共28頁。4 CRISPR-Cas系統系統(xtng)前景分析前景分析u 只需合成一個只需合成一個sgRNA就能實現對基因的特異性修飾，就能實現對基因的特異性修飾，Cas蛋蛋白不具特異性。白不具特異性。u 編碼編碼sgRNA的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構建，因此比構建TALENs和和ZFNs更簡單方便。更簡單方便。u 較短的較短的sgRNA序列也避免了超長、高度序列也避免了超長、高度(god)重復的重復的TALENs編碼載體帶來的并發癥。編碼載體帶來的并發癥。技術(jsh)優勢第26頁/共27頁第二十七頁，共28頁。NoImage內容(nirng)總結會