1、巨噬細胞移動抑制因子活性機制與炎癥性疾病東南大學附屬中大醫院麻醉科汪福洲景亮南京，210009巨噬細胞移動抑制因子(MIF)作為一種多能細胞調節蛋白，是與多種疾病有著密切關系的新型分子”。盡管最初因MIF能夠抑制豚鼠巨噬細胞隨機移動而得名，但隨著MIF在機體生命活動中一系列生理及病理生理作用的相繼確認，已激起了對其在體內多種疾病病理過程中重要調節作用的高度關注?，F今認為，MIF是集細胞因子、神經內分泌激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，雖然MIF只占腦垂體分泌總量的0.05%,但其可能是生物體系統性應激反應整體的一個重要調節部分。大量資料顯示MIF在細胞因子調節通路上與糖皮質激素(G。一樣起著

2、控制調定點”的作用。這里我們主要對MIF活性的分子機制、在炎癥性疾病中是作用及可能的治療學方法等方面的新進展作一介紹。1 .MIF分子結構和基因1.1 分子結構MIF的cDNA編碼含115個氨基酸殘基的蛋白質，其相對分子質量約為12.5 kDa,跟其它蛋白相比并無明顯生物序列同源性。放射圖譜分析顯示，人類與鼠MIF之間約90%的氨基酸序列相同，MIF晶體結構是由含2個反向平行螺旋和6個(3片層的三個單體組成的同源三聚體，形成一末端開放的中空結構。12.6 因人類MIF編碼基因位于染色體22q112,含3個外顯子205、173和183bp,2個內含子189和95bp。MIF啟動子包含多個GC,不

3、含TA盒，說明其多個轉錄起始位點的存在。然而，多個組織MIFmRNA分析只顯示出其單個轉錄位點的存在，約含800個核甘酸，應用高顯示液相染色體圖譜分析技術說明了MIF基因存在多態性1,其中CATTM復元彳包含5-8個等位基因，兩個內含子多態位點位于+254(T/C)和+656(C/G)。2.MIF生物學作用的分子機制2.1 MIF的分泌與受體用內毒素刺激單核細胞，顯示MIF不經過內質網而是通過一非傳統蛋白分泌路徑釋放出胞。非傳統蛋白出胞的典型抑制劑Glyburide和Probenicid能夠強烈抑制MIF的分泌，說明MIF分泌出胞時有ABCA1通道蛋白的參與。MIF活性的發揮需與多種胞內蛋白相

4、互作用，而這首先需要MIF信號的跨膜傳遞?？寺”磉_和功能分析發現CD74是MIF的高親合力膜結合蛋白，起著MIF跨膜受體的作用。在重組可溶性CD74分子，MIF結合于其109-149氨基酸殘基部位，從而活化胞外MAPK信號傳導、細胞增殖分化和前列腺素E2的產生。2.2 對糖皮質激素(GC)作用的調節32東南大學附屬中大醫院xx,xx2.2.1 cPLA2機制胞漿磷脂酶A2(cPLA2)及其活化后產物花生四烯酸是炎癥反應的重要調節因子。GC以cPLA2為目標靶點，通過抑制其活化來達到抗炎作用的發揮。無論外源性MIF的給予還是內源MIF的釋放都能誘導靜止成纖維細胞的活化增殖，此反應與絲裂源活化蛋白

5、激酶(MAPK)亞家族p44/p42ERK的持續活化相關，并且依賴于蛋白激酶A(PKA)的活性。ERK的信號傳導引起一系列胞漿蛋白磷酸化，其中包括cPLA2,c-myc和P90。而MIF誘使cPLA2發生的磷酸化后活化最終是通過ERK-MAPK制釋放花生四烯酸來實現對GC的反向調節。2.2.2NF-6途徑核轉錄因子-kappaB(NF-B)是炎性細胞因子基因表達的重要調節因子。而GC一方面通過抑制NF-6的p65亞單位與靶基因位點的結合而阻斷NF-B轉錄活性；另一方面促進NF-B的抑制因子I-B的合成，從而胞漿I-B濃度增加使NF-B/I-B復合物形成增多而阻斷NF-B向核內的轉移來實現其抗炎

6、作用。在內毒素刺激人外周血單核細胞實驗中，MIF顯示出對GC誘導的I-e合成的抑制，從而使移入核內的NF-6增多引起促炎細胞因子和黏附分子基因表達。2.2.3Rb調控腫瘤抑制蛋白Rb的磷酸化受到上游分子周期素D1的重要調節，當Rb活化后引起轉錄因子E2F的釋放，從而誘導S期急性酶的表達。在氣道平滑肌細胞，GC抑制凝血酶誘導的周期素D1mRNA的表達、Rb磷酸化和細胞增殖。同時GC可誘導血管平滑肌細胞及肺癌細胞分裂周期的停止并伴隨有Rb磷酸化的明顯下降。與GC相反的是，MIF通過使Rb磷酸化和E2F活性增加在整合素介導的細胞分裂過程中起著關鍵作用。這些表明周期素D1的表達和Rb的磷酸化可能是MI

7、F反向調節GC作用的關鍵點之一。2.2.4AP-1方式GC發揮作用的一個重要機制是其對活化蛋白-1(AP-1)調節基因的轉錄抑制，并且GC抵抗性疾病與AP-1活性的升高密切相關。與其它許多生物現象一樣，MIF的活性特征也呈現一鐘形”劑量反應曲線，高低水平的MIF可能產生明顯不同的細胞調節效果。MIF通過與Jab-1相互反應可能影響AP-1調節基因的轉錄活性，一方面Jab-1穩定AP-1/c-jun復合物與AP-1位點的結合；再者促進具有停止細胞分裂周期的p27Kip154rsk蛋白降解。然而，體內MIF過度表達時在抑制Jab-1促生長特性的同時使活化AP-1/c-jun復合物的穩定性下降。對A

8、P-1穩定性的正負調節說明MIF在影響內外源性GC作用發揮的過程中處于相當重要的位置。至此，MIF反向作用于GC可能的分子機制包括：ERK-cPLA2-花生四烯酸；I-冗-NF-k-細胞因子；周期素D1-Rb-E2F細胞分裂；Jab-1-AP-1/c-jun-促炎基因-p27裂。2.3對p53因子的調節腫瘤抑制因子p53主要從兩方面來阻止不適當的細胞增殖：誘導細胞分裂周期停止和凋亡。MIF通過拮抗myc-活性誘導的p53依賴的凋亡來保持巨噬細胞的存活及促炎功能。MIF對p53Kip16-細胞分東南大學附屬中大醫院麻醉科，南京的抑制使腫瘤生長加快，炎癥擴大。因此，MIF促細胞生長的特性可能是參與

9、多種炎癥性疾病病理過程的重要機制之一。2.4生物活性酶特性三維晶體結構分析顯示MIF和多種微生物活性酶一樣具有相同的結構、酶促活性位點及保守的殘基序列。MIF具有右旋多巴銘互變異構酶、苯丙酮酸同分酶及硫醇蛋白氧化還原酶等酶促活性。三種酶活性催化不同的反應底物，說明MIF酶促位點可能對其生物學作用的發揮起著重要作用。3.MIF與炎性相關疾病MIF在炎癥性疾病的發生發展過程中起著不容忽視的作用。與其它促炎細胞因子不同的是，MIF以前體形式儲存于包括垂體前葉細胞在內的多種細胞胞漿內，當受到應激刺激時迅速分泌出胞。循環MIF量增加，通過激活和促進TNF-%、IL-1區IL-2、IL-6、IL-8、IF

10、N-丫等炎性細胞因子表達，NO的釋放，COX-2的誘導而直接促使炎癥的發生和擴大。同時MIF抑制和反向調節GC對免疫和炎性細胞活性的抑制及對炎性細胞因子釋放的抑制來達到促炎的目的。敗血癥休克時炎性細胞胞漿內的MIF合成加強和聚集增加，與炎癥部位炎性細胞的聚集呈現平行相關關系。在ARDSMIF可能是通過中性細胞趨化性巨噬細胞炎性-2因子的上調而發揮作用987。人血管內皮細胞在LPS激后產生干細胞因子（SCF,由于SCFWMIF之間可能潛在著相互作用而激活和募集巨噬細胞，因此在炎癥局部高水平MIF協同升高的SCF共同加強炎癥反應。噬酸性粒細胞是MIF的重要來源之一。在過敏性炎性疾病的發病過程中噬酸

11、性粒細胞是重要的參與者。在過敏性炎癥部位MIF蛋白的表達增加與噬酸性粒細胞的聚集密切相關。慢性炎性疾病如風濕性關節炎和腎小球腎炎等，其中MIF基因啟動子的多態性與病情嚴重程度相關10,因此MIF的促炎功能直接影響炎性疾病的預后。4.炎癥性疾病時對MIF的相關治療4.1 抗MIF抗體的應用對炎癥性疾病的動物模型或病人給予抗MIF抗體處理，一方面炎性細胞在炎癥部位的聚集減少，同時GC治療的效果增加，并且在慢性炎癥疾病時長期應用GC的必要性降低；另一方面病人的28天病死率明顯下降，使病人的預后得到一定的改善。MakitaH等應用MIF單克隆抗體預處理LPS刺激的老鼠發現其支氣管內皮細胞和肺泡巨噬細胞

12、MIFmRNA表達明顯下降，中性粒細胞趨化因子MIP-2/CINC-3水平降低，肺組織中性粒細胞聚集減輕11?？筂IF抗體可以使格蘭12氏陰性和陽性菌引起的致死率降低，從而增強對內外毒素的耐受，起到一定的保護作用。CalandraT等通過盲腸結扎穿孔重癥月M膜炎模型，應用重組MIF后癥狀加重，而抗MIF抗體的給予使其癥狀得到一定的改善，血漿中促炎性介質水平下降13。因此，用MIF單克隆抗體中和MIF可以使免疫細胞穩定性增強，抗炎性能加強，炎癥得到一定好轉，但其臨床應用還需要進東南大學附屬中大醫院麻醉科，南京行大量臨床前期實驗。4.2 酶活性抑制劑的應用應用小分子量抑制劑與MIF催化活性位點結合

13、來不可逆地抑制MIF的促炎作用可能是一種比較理想的治療方案。親電子烷化劑NAPQIN-acetyl-p-benzoquinonimine,是乙酰氨基酚的氧化代謝產物之一，具有左旋二羥苯丙氨酸銘甲酯的亞氨基苯酶樣功能，能和親核試劑硫醇相互反應，但是硫醇的反應物碘乙酰胺和N-乙烷順丁烯二酰亞胺都不能抑制MIF的酶活性14,而SenterPD等發現MIFNH2末端的脯氨酸作為其主要親核中心與NAPQI以共價鍵相連，通過抑制MIF對GC抗炎作用的拮抗來達到對MIF蛋白的同分酶特性和促炎生物活性的抑制，并且呈現出濃度依賴性關系15。異噪類衍生物ISO-1(S,R)-3-(4-hydroxyphenyl)

14、-4,5-dihydro-5-isoxazoleaceticacidmethylester在水溶液中具有高度穩定性，通過對MIF/對羥苯丙酮酸復合物與氨基酸Schiff-基化合物結構活性關系的分析顯示ISO-1含有能和MIF催化活性位點結合的結構序列，當ISO-1與MIF結合形成MIF/ISO-1復合物后，MIF互變異構酶的活性受到抑制；再者，ISO-1可以對MIF刺激胞漿磷脂酶A2 (PLA2)活化而引起花生四烯酸產物釋放的過程產生抑制；第三，ISO-1能夠阻抑MIF對GC的拮抗，從而達到一定的抗炎效果16。這里NAPQI和ISO-1代表了小分子量化合物以細胞因子MIF為目標靶點，能夠不可逆

15、性抑制其促炎活性，從而為MIF相關性疾病的臨床治療新型藥物的發現提供了可能。3 .3基因水平介入在神經內分泌系統基因易感性對MIF表達的加強可能是一個治療相關的關鍵性決定因素，因此從基因水平MIF啟動子的多樣性入手，尋找合適的介入因子可能會對炎性疾病治療策略的優化及GC應用的效果產生比較滿意的結果。5.需進一步研究的問題5.1 分子機制方面(1) CD163是血色素-結合珠蛋白復合物的受體，其在循環單核細胞表面的表達在LPS刺激時明顯增加，并且有利于IL-10的產生17。接下來的研究應明確在循環白細胞表面CD163的表達是否有結合珠蛋白誘導產生MIF的參與，以及其受體CD74在不同細胞上的表達

16、情況；(2) ACTH誘導GC分泌時，Ca起著重要作用。因此，當機體處于應激狀態時，H-P-A軸、ACTHGC、MIF、Ca之間是否存在著相互關系仍未明了。5.2 疾病病因學方面(1)不同病因引起不同疾病，在不同時期，MIF的表達及炎性細胞的浸潤與疾病發生發展的關系如何，特別是與臟器功能的改變，疾病的預后轉歸的關系還有待進一步探討。(2)感染性疾病時，機體循環機能明顯下降，其中MIF是否發揮著致關的作用需待探討。2+2+東南大學附屬中大醫院xx,xx(3)GC的抗炎抗免疫作用受到MIF的反向調節。炎性疾病時GC量的相對增加而效能的相對低下，即GC抵抗是否由于MIF的參與；同時，MIF與GC的相互作用是否是以GC受體GR為聯橋，即是否以GR為作用相聯點尚需進一步實驗說明。5.3 治療學方面(1) GC治療是否誘導MIF生成細胞亞群的相對減少，以及GC治療是