1、第四部分第四部分 毛細管電泳毛細管電泳與超臨界流體色譜與超臨界流體色譜 第一章第一章 毛細管電泳毛細管電泳 第一節第一節 概述概述一、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間淌度和（或）分配系數的不同而進行分離的一類新型液相分離技術。 二、毛細管電泳的發展史及新動向 瑞典科學家Tiselius在1937年首先提出電泳，創造了Tiselius電泳儀，并建立了移動界面電泳方法。1948年他獲

2、得了諾貝爾化學獎。 1988年美國Bio-Rad公司研制出第一臺毛細管電泳儀HPE-100型 。 1989年在Boston召開首屆HPCE專題會議。 1981年，Jorgenson創立了毛細管電泳技術 。三、電泳與色譜1. 作用原理作用原理2. 分離過程分離過程3. 儀器構成儀器構成4. 分離通道的形狀分離通道的形狀四、毛細管電泳的特點 1. 高靈敏度 紫外檢測器的檢測限可達10- -1310- -15 mol，激光誘導檢測器可達10- -1910- -21 mol； 三高二少一廣三高二少一廣 2. 高分離效能 每米理論塔板數可達幾百萬甚至幾千萬； 3. 高速度 通常的分析時間不超過30 mi

3、n。有1.7 min內分離19種陽離子及3 min內分離30種陰離子的報道； 4. 樣品用量少 只需納升級的進樣量； 5. 分析成本低（消耗少） 只需少量（幾毫升）流動相，分析過程是在價格低廉的毛細管柱中進行行； 6. 應用范圍廣 可分離小分子（氨基酸、藥物等）、離子（無機及有機離子）、生物大分子（蛋白質等）、甚至各種顆粒（如細胞、硅膠顆粒等），具有“萬能”分析功能或潛力。 五、毛細管電泳的分類 1. 毛細管區帶電泳（CZE） 又稱自由溶液毛細管電泳 2. 毛細管凝膠電泳（CGE） 屬非自由溶液電泳，含有“分子篩”效應。 3. 毛細管等速電泳（CITP） 電泳型 4. 毛細管等電聚焦（CIEF

4、） 按等電點分離，屬電泳型，要求完全抑制電滲流動。 5. 膠束電動毛細管色譜（MECC） 又稱電動色譜（EKC），是電泳技術和色譜技術巧妙結合的分離新技術，為CZE擴展的色譜型。 6. 毛細管電色譜（CEC） 又稱毛細管電動色譜，屬非自由溶液色譜型。 7. 微乳液電動毛細管色譜（MEEKC） 為CZE擴展的色譜型 8. 非水毛細管電泳（NACE） 屬自由溶液電泳型。 第二節 毛細管電泳理論一、電泳和電泳淌度 電泳電泳是帶電粒子在直流電場作是帶電粒子在直流電場作用下于一定介質（溶劑）中所發用下于一定介質（溶劑）中所發生的定向移動。生的定向移動。 在電場作用下，帶電粒子定向遷移的速度（電泳速度）可

5、用下式表示： Euepep電泳速度淌度電場強度 電場強度是指單位距離的電壓降（V/cm）。 淌度（mobility）是指溶質在單位電場下的遷移速度，即單位電場下的電泳速度。 在無限稀釋溶液中（稀溶液數據外推）測得的淌度稱為絕對淌度（absolute mobility） 。 絕對淌度是在無限稀釋時單位電場強度下帶電粒子的平均遷移速度，是該離子在一定溶液中的特征物理常數。 電場力： 根據流體力學知道，（球型）離子的流動阻力F Ff ：qEFE離子電荷溶劑粘度離子有效半徑ErruFepf66 一定時間后，兩種力的作用達到平衡，即FE = Ff，此時離子作勻速運動，電泳進入穩態。 qEErep6iep

6、rq326溶液的介電常數粒子的Zeta電勢棒狀粒子： 4iep 顯然，分子半徑小，電荷大的離子具有較大的電泳淌度，而分子半徑大，電荷小的離子具有較小的電泳淌度。 有效淌度（effective mobility）是實際測出的離子淌度，可表示為：epiief樣品分子中的第i級解離度活度系數 它與帶電粒子的電荷、形狀、大小、離解度、溶劑化作用，溶劑的介電常數、粘度、pH值和溫度有關。 電泳分離的基礎是建立在各分離組分有效淌度的差異上。 二、電滲 電滲流（electroosmotic flow，EOF），簡稱電滲，是指管內溶液在外力電場作用下整體向一個方向運動的現象。 HPCE通常采用的是石英毛細管柱

7、，一般情況下（pH3），硅醇基（SiOH）電離為硅氧基負離子（SiO- -），使管壁表面帶負電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當在毛細管兩端加高電壓時，雙電層中的陽離子向陰極移動，由于離子是溶劑化的，所以帶動了毛細管中溶液整體向陰極移動，產生電滲流。 電滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度os表示。 EEuososos 一般情況下，電滲流的速度是電泳速度的57倍。電滲速度電滲淌度管壁的Zeta電勢三、表觀淌度和權均淌度 在毛細管電泳中，同時存在電泳和電滲，若不考慮它們之間的相互作用，粒子在毛細管內的遷移速度應當是電泳速度和電滲速度的矢量和，即 ：Eu

8、uu)(efosefosapefosap表觀遷移速度電滲速度電泳速度表觀淌度 組分 表觀淌度 表觀遷移速度正離子中性分子負離子efososefos-efosuuosuefosuu-分離后出峰次序為：正離子中性分子負離子+- -+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - -

9、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -圖圖 毛細管分離示意圖毛細管分離示意圖四、兩相分配與權均淌度 如果特意在毛細管中引入另一相，稱為 P 相，樣品在電遷移過程中同時會發生相間分配，其遷移速度或淌度將發生變化，這樣改變了的粒子遷移速度和淌度，稱為加權平均速度和加權平均淌度，簡稱權均速度和權均淌度。 設相分配過程遠快于電泳過程，則有： pppappkkkEu111容

10、量因子樣品在P相中的分子數樣品在溶劑相中的分子數P相的表觀淌度sppnnk P相在電場中可靜止，也可遷移，運動方向可正、可負。利用引入P相，可使中性組分產生不同的權均淌度，因而解決了中性組分在毛細管電泳中的分離問題。 （一）遷移時間tR五、分離效率與譜帶展寬 帶電粒子從進樣口遷移至檢測窗所用的時間，稱為遷移時間。 VLLuLtddRap遷移時間毛細管的有效長度毛細管的總長度外加電壓（二）柱效和塔板高度 25 . 0)(54. 5WtnRnLHd理論塔板數遷移時間半峰寬塔板高度毛細管的有效長度（三）譜帶展寬 1. 流型 以電場力驅動產生的EOF，與HPLC 中靠外部泵壓產生的液流不同。EOF的流

11、型屬扁平流型或稱“塞流”。扁平型的塞子流不會引起樣品區帶的增寬，是毛細管電泳高效的重要原因 。 HPLC的流型則是拋物線狀的層流，它在壁上的速度為零，中心速度為平均速度的2倍。 Van Deemter方程： 空心毛細管柱，則用Golay方程式表示：CuB/uAHCuB/uH渦流擴散項分子擴散項傳質阻力 由于在毛細管電泳中，無固定相和流動相兩相，因此不存在傳質項，而且速度流型又是扁平的，于是只有縱向擴散項：D/uB/uH2DELDu/Ln2/2dapd擴散系數 毛細管電泳特別適合分離生物大分子。 2. 自熱 15003cEd管徑是影響自熱的一個重要因素。理論上：E=50kV/m，c=0.01mo

12、l/L，d140 m實際應用2575 m的毛細管 使用小內徑、大外徑的毛細管，適當降低外加電壓、降低緩沖溶液的濃度以及對毛細管恒溫等均可以減小溫度梯度，提高柱效。3. 擴散與吸附（1 1）擴散 （2 2）吸附 組分與毛細管壁的相互作用主要為管壁對組分的吸附。 六、分離度 分離度是指將淌度相近的組分分開的能力。 4)(2121221RRRRttWWttR-遷移時間峰底寬度標準偏差分離度也可表示為柱效的函數： 不考慮電滲流時： )(4efefnR)(4uunR當考慮電滲流時： 2/1)(241osefdefDLVLR第三節 毛細管電泳儀器系統 毛細管電泳儀主要包括高壓電源、進樣系統、分離系統、檢測

13、系統和數據處理系統。 1234655圖圖 毛細管電泳裝置示意圖毛細管電泳裝置示意圖1高壓電源高壓電源 2檢測器檢測器 3液冷溫控毛細管液冷溫控毛細管 4數據記錄系統數據記錄系統 5緩沖液槽緩沖液槽 6緩沖液緩沖液一、高壓電源 常用的高壓電源為能提供030 kV，電流為200300 A的連續可調的直流高壓電源，為了獲得遷移時間的高重現性，操作電壓要穩定在0.1%范圍內。 高壓電源要能夠切換極性，最好是雙極性高壓源。 必須注意高壓的安全保護問題。 高壓源有恒壓、恒流或恒功率等方式。最常用的是恒壓源。 二、進樣系統 毛細管內徑很小，進樣量必須很少，一般進樣長度為毛細管總長度的1%2%。進樣體積為納升

14、（nl）級。所以毛細管的進樣采用無死體積的進樣方法。 毛細管的進樣是讓毛細管直接與樣品接觸，然后由重力、電場力或其他動力來驅動樣品流入管中，進樣量可以通過控制驅動力的大小或時間長短來控制。 在毛細管電泳中常采用的進樣方式為電遷移進樣和流體動力學進樣，除此還有擴散進樣。 1. 電遷移進樣apVSuQ ErcEScQcQosefosefVin)()(2000進樣體積毛細管的橫截面積進樣時間進樣量樣品濃度 電動進樣的控制參數是電場強度E和進樣時間 。通過改變進樣電壓和進樣時間可以控制進樣量。其中E是進樣動力，取值多在110 kV/60cm之間，僅為分離時操作電壓的1/51/3。 是進樣時間，取值通常

15、在110 s之間，有時可達1 min或更大。 電動進樣對毛細管內的填充介質沒有特別限制，可實現完全自動化，但在電遷移進樣中存在一種歧視效應，即電泳淌度大的組分進樣量大，電泳淌度小的組分進樣量小或不進，會降低分析的準確度和可靠性。2. 流體動力學進樣)(820PLSrcQin進樣量樣品濃度毛細管兩端壓力差毛細管長度溶液的黏度 顯然， P和 是控制參數，其中 P 是進樣動力，可以通過如下幾種方式進行：（a）在進樣端加氣壓（正壓）；（b）在出口端抽真空（管尾抽吸，負壓）；（c）利用虹吸作用，即所謂的重力進樣。 P 的取值一般在3450 Pa（約3447 Pa）附近。 的取值通常在15 s之間，有時可

16、超過60 s。 在流體動力學進樣中不存在像電遷移進樣中的歧視效應。利用重力虹吸進樣：HgP 顯然，進樣量也可由 H 控制。 H 的取值通常在520 cm之間，多數取10 cm，對應的 多在530 s間取值。緩沖溶液的密度重力加速度毛細管進、出口的液面落差 虹吸進樣方式一般為沒有壓力進樣功能的儀器系統所采納。3. 擴散進樣DScQin24000 擴散進樣動力屬不可控制參數，進樣量僅由擴散時間控制。擴散進樣時間在1060 s間，屬普適性進樣方法。 擴散系數三、分離系統 分離系統包括毛細管、毛細管恒溫系統、電極和緩沖液池。 1. 毛細管 目前最常用的是厚壁，內徑為2575 m，有效長度為3075 c

17、m的熔融石英毛細管柱。并定期清洗。 2. 毛細管恒溫系統 毛細管溫度的控溫精度應達到0.1。目前商品儀器配備的恒溫系統有高速氣流恒溫和液體恒溫兩種。 3. 電極和緩沖液池 在毛細管電泳系統中，正負鉑電極、進樣端緩沖液池、檢測端緩沖液池和充滿運行緩沖液的毛細管構成了一個導電回路。 緩沖溶液液面高度控制是保證毛細管電泳分離效率和遷移時間重現性的重要因素。 緩沖液要經常更新，這樣有助于提高電泳分離的重現性。 （一）紫外檢測四、檢測系統 紫外吸收檢測是目前毛細管電泳最常用的檢測方法，用于檢測有紫外吸收的物質。依檢測方式的差異，紫外檢測器可分為固定波長、可變波長、二極管陣列等類型 一般采用柱上檢測方式，

18、也可實現柱后檢測。質量檢測限為10-13 10-16 mol，濃度檢測限為10-5 10-8 mol/L，其特點為通用性好，二極管陣列可提供光譜信息。 紫外檢測器由光源、光路系統、信號接收和處理系統構成。（二）熒光檢測 一般采用柱上檢測方式。質量檢測限為10-1510-17 mol，濃度檢測限為10-710-9 mol/L，靈敏度高，需衍生化。（三）激光誘導熒光檢測 也可采用柱上和柱后兩種檢測方式。質量檢測限為10-1810-20 mol，濃度檢測限為10-1410-16 mol/L，靈敏度非常高，通常需樣品衍生化。 毛細管電泳的電化學檢測器有三個檢測模式：安培法、電導法和電位法。 （四）電化學檢測 安培法測量化合物在電極表面受到氧化或還原反應時，失去或得到電子，產生與分析物濃度成正比的電極電流。1. 安培檢測 是一種高靈敏度的電化學檢測法，質量檢測限為10-1810-19 mol，濃度檢測限為10-1010-11 mol/L，靈敏度高，只適用于電活性物質；需要特殊的電化學和毛細管柱改性。 電導法和電位法是測量兩電極間由于離子化合物的遷移引起的電導率或電位變化。 2. 電導檢測和電位檢測 電導檢測通用性好，質量檢測限為10-1510-16 mol，濃度檢測限為10-7