1、外周動脈閉塞癥中通過吲哚布芬降低中性粒細胞活化Chello, Massimo; Mastroroberto, Pasquale; Celi, Vittoria; Romano, Ferdinando; Marchese, Antonietta R.; Colonna, Alfredo Chello作者信息Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Catanzaro; and *Cattedra di Igiene, Facoltá di Medicina

2、 e Chirurgia “G. D'Annunzio,” Chieti, Italy1995年6月19日收到，1995年11月27日同意修訂。地址通信和副本聯系Dr. M. Chello at Via S. Giacomo dei Capri 29, 80128 Napoli, Italy。摘要在缺血再灌注臨床模型中，我們評估吲哚布芬降低中性粒細胞活化的有效性。三十位穩定患者隨機分為兩組，他們因腿部閉塞性外周動脈病導致間歇性跛行。第一組患者用吲哚布芬治療（200 mg口服，每日兩次 (p.o. b.i.d.)，持續一個星期）；第二組患者接受安慰劑治療。兩組患者在標準跑步機上練習，直到

3、發生跛行。在股靜脈引流缺血腿血液樣本上，對血栓素B2（TxB2）和6酮前列腺素F1（6-k-PGF1alpha）中性粒細胞過濾性和中性粒細胞活化（使用硝基四氮唑藍試驗法）的血漿水平進行評估，在休息時和出現跛行5、30和60分鐘后測量數值。在休息時和跛行出現后1小時，測定尿白蛋白排泄。安慰劑組出現跛行后5分鐘，血栓素TxB2和6酮前列腺素F1血漿水平顯著增加，而吲哚布芬治療組只是略有增加。血小板和中性粒細胞活性偏高，被認為在病理生理上和外周血管疾病相關，可通過增加小血管閉塞和血液粘度（低剪切速率）導致微循環功能不全。以往的研究表明，間歇性跛行的患者可能出現凝血活性，增加血液粘度（增加紅細胞和血漿

4、纖維蛋白原引起），增加白細胞活化以及僵硬性（1-3）。與正常人相比（4,5），嚴重缺血患者全血過濾性受到損害；在靜脈引流缺血區，過濾性能的降低，具有系統性和局部性。在缺血條件下，中性粒細胞局部包封能夠損害灌注，并可以確定不良的系統性影響，因為它們可以和血管內皮細胞發生相互作用（6），并釋放各種化合物，例如花生四烯酸代謝產物（7）、氧自由基（8）和血小板活化因子（9），這將導致內皮細胞損傷和血管通透性增加。先前證明能反映血管通透性的尿白蛋白排泄，在跛行者運動后將顯著增加，并與中性粒細胞過濾性降低和血清溶菌酶活性增加相關（10）。吲哚布芬是一種環氧化酶可逆抑制劑。它在改善外周血管阻塞疾病臨床癥狀的

5、療效，已通過不同時間（11,12）的臨床實驗進行評估。我們希望在臨床缺血再灌注情況下，確定吲哚布芬的服用對中性粒細胞活化的影響。方法三十名明顯間歇性跛行患者按照醫院編號隨機分成兩組，這種間歇性跛行因血管造影證實的腿部外周血管閉塞疾病造成。第一組患者用吲哚布芬治療（200 mg口服，(p.o.)每日兩次，(b.i.d.) 持續一個星期）；第二組患者接受安慰劑治療。在研究前2周或研究期間，無患者報告在休息時疼痛或呈壞疽癥狀或接受主動的血液流變性用藥。慢性肺病、糖尿病、下肢骨關節病或限制他們步行距離的其他疾病患者被排除在外。在所有下肢間歇性跛行癥狀患者中，踝關節及上肢收縮壓之間比值<0.85。

6、這項研究采用雙盲方式，并經卡坦扎羅醫學院倫理委員會批準。所有患者知情同意。研究方案在受影響的腿上，用18-gauge軟導管進行股靜脈逆行插管。在患者休息10分鐘后，從股靜脈中取血液樣本。然后患者都在跑步機測功儀上走，參數為12°仰角和3公里/h速度，直至跛行疼痛發生。患者停止鍛煉5分鐘后，從股靜脈取第2個血液樣本。在鍛煉30和60分鐘，取第3個和第4個樣品。中性粒細胞過濾性：中性粒細胞過濾性使用粒細胞懸浮液流過過濾器（5µm孔徑）的能力評估。粒細胞微粒（大于97%中性粒細胞）通過密度梯度離心法與肝素血液分離，并修正到恒定濃度1.5 × 109個細胞/L。然后在靜水

7、壓力下，這種懸浮液落下并通過聚碳酸酯過濾器（5µm），在90秒內每隔10秒記錄所收集的濾液累積量。繪制累積量與時間log圖，得出1條直線（所有情況均為r>0.99），從中算出流速為（每分鐘毫升數）。中性粒細胞存活率大于98%，和胎盼蘭拒染試驗結果相同。通過在此程序中復制血液樣本，我們評估該技術重現性；每個復制樣本流量差異<5%。氮藍四唑（NBT）：中性粒細胞活化特性是可以降低NBT染色，這與增強性超氧陰離子自由基有關。這是中性粒細胞激活后的呼吸爆發主要現象。按照Neumann及其同事所述方法在新鮮血液做NBT測試（5）：0.2ml肝素化血液在37下培養10分鐘，之后添加0

8、.2ml 0.1% NBT溶液（在磷酸鹽緩沖鹽水中）。該混合物37°C下培養15分鐘，然后在室溫（21°C25°C）下保持15分鐘。涂片制備時，使NBT和血液混合物快速滴落到預先清潔的載玻片上。空氣干燥后，涂片用瑞氏色素染色。在每個載玻片上，100個中性粒細胞計數。以含有甲臜沉積物（至少1核葉大小）的中性粒細胞百分比作為Positive NBT得分。類花生酸測量：血栓素B2（TxB2）和6酮前列腺素F1（6-k-PGF1alpha）評估用的血液樣，取自研究方案所述4個時間點的股靜脈；血栓素B2和6酮前列腺素F1分別表示體內TxA2和前列環素產生的情況。對于每個樣品

9、，用聚丙烯注射器抽取5 ml血液（含0.2 mg阿司匹林），并放到含0.05 ml 15% EDTA溶液的試管中。在室溫下，管子在擺動籃轉頭中離心15分鐘（2300 g）。然后收集血清，在-20°C時冷凍，直到使用標準免疫技術檢測類花生酸檢測（13）。所有的結果報告，均使用每毫升血清復合物皮克數。尿肌酐/白蛋白比值：從每位患者中獲取尿液樣品，并使用Hickey及其和同事所述方法（10）。受試者排凈膀胱尿液，并休息1小時，然后排凈膀胱，獲取中段尿（MSU）樣本。受試者在跑步機上行走，其中12°仰角和3公里/h速度，等到疼痛時停止。再休息1小時后，獲取第2個中段尿（MSU）樣本

10、。使用標準比濁法（Cobas Mira Plus, Hoffman-Roche，巴塞爾，瑞士）測定尿白蛋白，并用尿白蛋白-肌酐比值（每微摩爾毫克數）表達，以補償尿流在研究過程中的變化。統計分析數據為平均值± SEM：在組內測試隨時間過程出現的重大變化時，首先對變異進行重復測量分析，然后采用Scheffé多重對比分析。比較兩組時，使用Student's t test方法。由于觀測值的分布存在異常值，因運動產生的ACR變化通過Wilcoxon配對秩和檢驗進行分析。變量之間的關系通過線性回歸分析確定，計算所選擇生化變量之間的相關系數；p < 0.05被認為具有統計學

11、意義。只由一名不清楚藥物情況的人員來分析數據。和生化及血液流變學測量有關的人員，則完全不清楚研究設計情況。結果在入院時，兩組具有相似的間歇性跛行特征。在兩組患者中，下肢動脈血管病變明顯為單側主導型。在髂/股-腘區，兩組具有類似的血管狹窄閉塞分布。在吲哚布芬或安慰劑治療前，無痛行走距離平均分別為161.4 ± 15.5 m和155.6 ± 16.7 m（p值 = NS）。經過1周有效藥物或安慰劑治療，此參數無明顯改變（吲哚布芬組167.7 ± 15.4m，安慰劑組158.5 ± 16.4m，p = NS）。兩組具有相似的心血管風險（吸煙、高血壓、高脂蛋白血

12、癥和肥胖）、家族心血管疾病和代謝性疾病歷史。治療組平均年齡為55 ± 3歲（45-70歲），安慰劑組平均年齡為57 ± 4歲（43-71歲），p = NS。在吲哚布芬治療時，沒有觀察到主觀或客觀性副作用。這兩組（治療組和安慰劑組）整個試驗過程中，沒有觀察到血小板計數、紅細胞壓積、纖維蛋白原水平方面的差異（表1）。兩組患者出現疼痛后5分鐘，觀察到中性粒細胞總的顯著增加（p < 0.05）。原文右側有表1，下面有圖1等，請核實乳酸釋放運動前，兩個治療組的乳酸含量在正常范圍。發生跛行5分鐘后，兩組患者乳酸大幅釋放（圖1）。發生跛行后30和60分鐘，觀察到逐步回復到基線值。在

13、整個研究過程中，兩組之間在血清乳酸水平上沒有觀察到顯著差異。TxB2和6-K-PGF1alpha在整個實驗中，與安慰劑組比較，吲哚布芬組的6-kPGF1alpha和TxB2值顯著降低（對基線值而言）（見表1）。疼痛出現后5分鐘，安慰劑組患者的6-kPGF1alpha和TxB2顯著增加，即與基線值比較（6-kPGF1alpha：450.3 ± 41.4 vs. 313 ± 24 pg/ml, p < 0.01；TxB2：308.6 ± 43.4 vs. 177.5 ± 25.6 pg/ml, p < 0.01）。而在同一時間點上，吲哚布芬組6-

14、kPGF1alpha和TxB2只是略微增加。發生跛行后30和60分鐘再次測量時，這兩個值向基線值回歸。過濾性和基線值相比，所有跛行患者在疼痛發作后5分鐘，他們的中性粒細胞過濾性明顯減少（圖2）。在兩組患者中，疼痛發作后30和60分鐘，可觀察到向基線值回歸的趨勢。用Wilcoxon檢驗分析表明，和安慰劑組比較情況下，在發生跛行后，吲哚布芬組的血細胞比容過濾顯著降低（即5分鐘時為0.39 ± 0.03 vs. 0.51 ± 0.03 ml/min, p < 0.05，30分鐘時為0.43 ± 0.02 vs. 0.55 ± 0.03 ml/min, p

15、 < 0.05）。NBTNTB得分值見圖3。疼痛發作后5分鐘，兩組患者NBT得分顯著高于基線值；然而，吲哚布芬組NBT得分值均顯著降于安慰劑組（7.98 ± 0.9 vs. 11.78 ± 1.2, p < 0.05）。在兩組患者中，NBT得分表明發生跛行后30和60分鐘時出現正常化趨勢。直線回歸分析表明TxB2和NTB得分之間呈正相關性（r = 0.6, p < 0.01）（圖4），而NTB和中性粒細胞過濾性之間呈負相關性（r = -0.65, p < 0.01）（圖5）。ACR在安慰劑組和吲哚布芬組之間，基線平均ACR值沒有顯著差異。在靜息值相比

16、，這兩組在運動后，平均ACR值顯著增加（安慰劑組：7.1 ± 1.1 vs. 4.3 ± 1.3 mg/mmol, p < 0.05；吲哚布芬：6 ± 1.1 vs. 3.9 ± 1.1 mg/mmol, p < 0.05）。Wilcoxon秩和檢驗表明，組間平均ACR值在運動后沒有顯著差異。討論越來越多的數據支持這一假設，即中性粒細胞在外周動脈閉塞性疾病的發病機制中具有關鍵作用。在間歇性跛行患者中，一系列研究表明，活動導致的肌肉缺血和中性粒細胞變形（為中性粒細胞活化證據）以及血清溶菌酶和過氧化脂質含量增加（3,10）有關。這個假設特別從缺血

17、腿中的靜脈回血得到清楚證實（5）。納什及其同事證明，導致截肢的重要下肢缺血，與中性粒細胞活化和變形損失相關聯（4）。截肢和治療后，這種情況得到改善。多形核白細胞（PMN）活化機制仍不清楚。缺氧條件下細胞延期包封或補體（14）激活或缺血組織血栓素釋放后，中性粒細胞可能被激活或在（15,16）。雖然缺血損傷的局部和全身影響中，環氧化酶和脂氧合酶衍生物可能發揮作用，但肢體缺血后再灌注損傷時血栓素-PMN相互作用才至關重要（17-19）。因此，再灌注時血栓素水平增加，它的合成抑制或其受體阻斷將防止軀干下部缺血損傷。Anner及其同事（20）清楚地證實，缺血引起的中性粒細胞氧化爆發呈血栓素依賴性，報告說

18、，肺微血管中PMN包封是血栓素產生的結果，而血栓素的產生是內皮細胞上LTB4和C5a刺激而導致。此外，已有報道說，跛行患者運動后的血清TxA2（21）和尿血栓素代謝產物將增加（22）。雖然血小板可產生豐富的TxA2，但許多研究表明，血小板沒有被缺血激活而合成TxA2（23,24）。首先，它們在再灌注期間沒有積累于缺血組織（通過骨骼肌（25）活體顯微鏡和使用作為跟蹤物的111In標記型血小板進行證明）。這和再灌注組織上中性粒細胞穩定存在的情況相反。第二，盡管刺激血小板是血栓素重要來源，但中性粒細胞更容易在缺血再灌注時產生血栓素，因為循環的中性粒細胞預先幾乎完全耗盡，可以抑制血栓素的增加，而不影響

19、血小板計數（25）。目前的數據表明，在缺血情況下，PMN可直接或間接產生大部分血栓素TxB2（26）。由于激活白細胞能夠合成TxA2（15），并可調節已增加的血管通透性（27），所以它們可能和再灌注損傷有關。這些因素不排除血小板可能具有的間接作用，其中，它們的血栓素和其他成分分泌可能使中性粒細胞激活。越來越清楚的是，血小板-白細胞的相互作用可能比血小板活化本身更為重要。血小板-中性粒細胞相互作用的存在，已通過對血小板-中性粒細胞懸浮液中的血栓素合成酶抑制劑的研究得到證實。中性粒細胞的研究表明，血栓素合成酶抑制劑可減少化學發光，這是自由基生成的方法。在血小板和中性粒細胞均存在時，化學發光下降非常

20、顯著（28）。在患者嚴重外周血管病和體內血小板活化的關系上，增強型血栓素合成已進行了說明（29）。吲哚布芬通過劑量依賴性血小板環氧合酶的抑制來抑制花生四烯酸代謝（30,31）。在我們研究中，在患者接受吲哚布芬治療后，觀察到的前列腺素血清值降低之結果和這樣的機制一致。此外，在本研究中，我們證明了在缺血再灌注臨床條件下，吲哚布芬可以減少激活的中性粒細胞數目。由于注意到TxB2血漿水平和NBT得分之間的顯著相關性，人們可以很容易推測，吲哚布芬作用與血小板環氧合酶抑制相關，可減少中性粒細胞。反過來，這會導致從活化中性粒細胞中血栓素合成的減少。吲哚布芬在我們研究中使用劑量情況下，也可能直接抑制TxA2從

21、激活性粒細胞中的產生。最后，應考慮和環氧合酶抑制無關的機制Grasselli及其同事（32）證實，服用吲哚布芬（200毫克，每日兩次，4周）可顯著改善14名阻塞性血管疾病患者的紅細胞（RBC）變形。然而，當給6名血管阻塞性疾病患者服用14天（400毫克劑量，每日三次）時，乙酰水楊酸（和吲哚布芬作用一樣，即可以阻斷環氧合酶）不影響紅細胞過濾性。此發現不符合吲哚布芬TxA2介導血液流變學效應假說，表明代謝產物負責藥物的作用，或是與紅細胞過濾性有關的其他變量在治療過程中被修改。已觀察到間歇性跛行與白蛋白在血管和腎中通透性的增加有關，這和缺血性或中性粒細胞活化程度（10）呈比例關系。我們的研究證實了這

22、些發現，但未能證明在白蛋白腎臟通透性顯著性降低中吲哚布芬的治療效果，盡管在活化中性粒細胞出現顯著減少。跛行時血管損傷的確切發病機制仍然不夠清楚。中性粒細胞活化以外的因素可能對腎損傷的發病機制有影響。這種傷傷的主要機制被認為在血管擴張藥和血管收縮藥之間出現不平衡（33）。服用環氧合酶抑制劑（如布洛芬或阿司匹林）后可能出現腎臟損害，這在臨床上證實腎臟需要前列腺素（具有血管擴張作用），盡管這些藥物抑制血栓素合成（34）。因此，在我們研究中，通過減少活化中性粒細胞來產生保護腎功能的潛在效應，可能被血栓素和前列腺素合成之間出現的不平衡所抵消。可以預見，我們的研究未能證明治療1周后兩組在跛行時間上存在顯著

23、差異。事實上，正和許多臨床試驗所證實的一樣，需要至少6個月的吲哚布芬治療（200毫克劑量，每日兩次），才能顯著改善跛行時間（11,35）。我們的研究結果表明，在外周血管閉塞性疾病患者中，口服吲哚布芬能夠降低中性粒細胞活化，其機制可能與環氧合酶抑制有關。這種積極性療效及其所確認的血小板抑制性能，可應用于缺血性血管疾病患者的治療。參考文獻1.Dormandy JA, Hoare E, Khattab AH, Arrowsmith DE, Dormandy TL. 間歇性跛行患者流變和生化研究結果的預后意義。Br Med J 1973;4;581-32. Dormandy JA, Hoare E,

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