1、第四節第四節 DNA芯片技術的應用芯片技術的應用第二章第二章 基因芯片基因芯片 GenechipDNADNA芯片技術的應用芯片技術的應用DNADNA芯片在基因表達分析中的應用芯片在基因表達分析中的應用1DNADNA芯片在基因突變檢測與多態性分析芯片在基因突變檢測與多態性分析2基因診斷與基因診斷與DNADNA芯片芯片3DNADNA芯片在藥物研究與開發中的應用芯片在藥物研究與開發中的應用4未來趨勢：生物芯片用于臨床未來趨勢：生物芯片用于臨床5vDNA芯片的優點芯片的優點 樣品需要量少樣品需要量少檢測效率高檢測效率高檢測靈敏度高檢測靈敏度高全面、平行的研究基因表達全面、平行的研究基因表達一一 DNA

2、DNA芯片在基因表達分析中的應用芯片在基因表達分析中的應用1 基因差異表達分析v目前差異表達的研究方法：目前差異表達的研究方法： 表達序列標簽（表達序列標簽（EST）測序）測序消減克隆（消減克隆（subtractive clong)差異顯示（差異顯示（differential display)基因表達序列分析（基因表達序列分析（serial analysis of gene expression, SAGE)1.1 應用酵母細胞基因表達譜芯片分析基因的表達差異v 釀酒酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)能將葡萄糖轉化為乙醇。能將葡萄糖轉化為乙醇。事實上通過發酵將葡萄糖轉化為乙醇是釀酒酵母的

3、事實上通過發酵將葡萄糖轉化為乙醇是釀酒酵母的一條首選代謝途徑。當葡萄糖被耗盡時，酵母細胞一條首選代謝途徑。當葡萄糖被耗盡時，酵母細胞才會利用其他能源或碳源，葡萄糖被耗盡后的優先才會利用其他能源或碳源，葡萄糖被耗盡后的優先能源或碳源是乙醇。而此時乙醇通常可達相當高的能源或碳源是乙醇。而此時乙醇通常可達相當高的濃度。從葡萄搪無氧酵解向乙醇有氧呼吸的轉變稱濃度。從葡萄搪無氧酵解向乙醇有氧呼吸的轉變稱為為“二次生長轉變二次生長轉變”vDcRisi et al 等根據釀酒酵母的整個基因等根據釀酒酵母的整個基因組序列制成了包括其全部組序列制成了包括其全部ORF的基因芯片，的基因芯片，接著從接著從“ 二次生

4、長轉變二次生長轉變”前后不同時間點前后不同時間點的酵母細胞中分離出的酵母細胞中分離出mRNA，在反轉錄成，在反轉錄成cDNA第一鏈的過程進行熒光標記，然后與第一鏈的過程進行熒光標記，然后與微陣列中的探針雜交，用所得到的雜交信微陣列中的探針雜交，用所得到的雜交信號對號對“二次生長轉變二次生長轉變”時基因表達的情時基因表達的情況進行了鑒定和分類況進行了鑒定和分類High-Throughput Tissue Microarray Analysis to Evaluate Genes Uncovered by cDNA Microarray Screening in Renal Cell Carcin

5、omav The American Journal of PATHOLOGY.1999 April; 154(4): 981986v Many genes and signaling pathways are involved in renal cell carcinoma (RCC) development. However, genetic tumor markers have not gained use in RCC diagnostics and prognosis prediction. Identification and evaluation of new molecular

6、parameters are of utmost importance in cancer research and cancer treatment. 1.2應用腫瘤細胞基因表達譜芯片研究基因的差異表達vHere we present a novel approach to rapidly identify clinically relevant molecular changes in cancer. To identify genes with relevance to RCC, a cDNA array analysis was first performed on 5184 cDNA

7、 clones on a filter to screen for genes with differential expression between the renal cancer cell line CRL-1933 and normal kidney tissue. cDNA Array Experiment v cDNA was synthesized and radioactive labeled using 50 g total RNA from normal kidney (Invitrogen) and a renal cancer cell line (CRL-1933)

8、 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) according to standardized protocols (Research Genetics, Huntsville, AL). Release I of the human GeneFilters (Research Genetics) was used for differential expression screening. A single membrane contains 5184 spots, each representing 5 ng of cDNA of k

9、nown genes or expressed sequence tags (EST). After separate hybridization the two cDNA array filters (Research Genetics) were exposed to a high resolution screen (Canberra Packard, Zrich, Switzerland) for three days. The gene expression pattern of 5184 genes in normal tissue and the tumor cell line

10、was analyzed and compared on a phosphor imager (Cyclone, Packard). Signals that genes/ESTs were absent or present on one of the two filters were identified visually. ResultsvThe experiment resulted in 89 differentially expressed genes/ESTs. Overexpression in CRL-1933 was found for 38 sequences inclu

11、ding 26 named genes and 12 ESTs, whereas 51 sequences (25 named genes, 26 ESTs) were not expressed in the cell line. The sequence of one of the up-regulated genes in the cell line was identical to that of vimentin. v1 Perou等（等（2000）用代表）用代表8102個人類基個人類基因的因的cDNA微陣列對微陣列對65份乳腺腫瘤樣本進份乳腺腫瘤樣本進行了基因表達差異的研究。結果表

12、明，腫行了基因表達差異的研究。結果表明，腫瘤基因表達譜普遍存在差異，這些表達譜瘤基因表達譜普遍存在差異，這些表達譜顯示了每個腫瘤的獨特分子特征，據此可顯示了每個腫瘤的獨特分子特征，據此可以將其分成不同的亞型。以將其分成不同的亞型。othersv2 Xu等等(2000)用不同熒光素分別標記來自用不同熒光素分別標記來自前列腺癌組織和正常人前列腺組織的前列腺癌組織和正常人前列腺組織的cDNA，混合后與混合后與cDNA微陣列雜交，挑選出有顯著微陣列雜交，挑選出有顯著差別的基因進行測序。對差別的基因進行測序。對3個新發現的前列個新發現的前列腺相關基因進一步用其他方法鑒定，得到腺相關基因進一步用其他方法鑒

13、定，得到其全長其全長cDNA,均編碼膜蛋白，其中一個為均編碼膜蛋白，其中一個為P504S基因在前列腺組織細胞中過量表達，基因在前列腺組織細胞中過量表達，可作為前列腺組織的特異性檢測標志物。可作為前列腺組織的特異性檢測標志物。v3 Chen 等（等（2001）用）用cDNA芯片檢測了芯片檢測了大豆異黃酮金雀異黃素對膀胱癌的生長抑大豆異黃酮金雀異黃素對膀胱癌的生長抑制作用。用制作用。用50mmol/L劑量在不同時間分別劑量在不同時間分別處理膀胱癌細胞，提取處理和未處理膀胱處理膀胱癌細胞，提取處理和未處理膀胱癌細胞癌細胞mRNA制成靶標，與含有制成靶標，與含有884個已知個已知序列的序列的cDNA芯

14、片雜交，發現差異表達的主芯片雜交，發現差異表達的主要是編碼調控區域信號轉導和細胞周期蛋要是編碼調控區域信號轉導和細胞周期蛋白的基因，這些基因可作為研制抗腫瘤藥白的基因，這些基因可作為研制抗腫瘤藥物的靶標物的靶標2 基因鑒定v 尋找和鑒定疾病相關基因是從分子水平上研究疾尋找和鑒定疾病相關基因是從分子水平上研究疾病、揭示發病機制的一項重要基礎性研究工作。病、揭示發病機制的一項重要基礎性研究工作。定量檢測大量基因表達水平在探索疾病原因及機定量檢測大量基因表達水平在探索疾病原因及機理、發現可能的診斷及治療靶標等方面是非常重理、發現可能的診斷及治療靶標等方面是非常重要的要的v目前，大量涌現的人類目前，大

15、量涌現的人類ESTEST給給cDNAcDNA微陣列提供了豐微陣列提供了豐富的序列資源，數據庫中富的序列資源，數據庫中ESTEST代表了人類基因，因代表了人類基因，因此此ESTEST微陣列可在缺乏其他序列信息的條件下用于微陣列可在缺乏其他序列信息的條件下用于基因發現和基因表達檢測，從而加快人類基因組基因發現和基因表達檢測，從而加快人類基因組功能分析的進程。功能分析的進程。v 利用基因芯片進行新基因克隆時，固定在利用基因芯片進行新基因克隆時，固定在芯片上的探計是某些芯片上的探計是某些cDNA文庫內的文庫內的cDNA片段。研究這些片段。研究這些cDNA片段對應基因的差異片段對應基因的差異性表達，就可

16、能篩選到差異表達相關基因性表達，就可能篩選到差異表達相關基因vschcnaschcna等通過雙色差示表達系統，研究人等通過雙色差示表達系統，研究人T T淋巴細胞在熱休克條件下和佛波酯作用下淋巴細胞在熱休克條件下和佛波酯作用下10461046個未知序列的個未知序列的cDNAcDNA基因誘導表達的情基因誘導表達的情況，并對誘導表達的況，并對誘導表達的cDNAcDNA進行測序，再與進行測序，再與已知基因進行比較。已知基因進行比較。方法方法結果結果v熱休克誘導了已知的熱休克蛋白基因的表熱休克誘導了已知的熱休克蛋白基因的表達，其中包括分子伴侶和分子降解的中間達，其中包括分子伴侶和分子降解的中間體。同樣，

17、佛波酯引起了佛波酯調節基因體。同樣，佛波酯引起了佛波酯調節基因的信號傳導途徑特征基因的表達、如激活的信號傳導途徑特征基因的表達、如激活細胞的磷酯酶和細胞因子細胞的磷酯酶和細胞因子xBlxBl等。另外，還等。另外，還發現發現3 3個低表達的已知基因和個低表達的已知基因和4 4個低表達的個低表達的新基因可能與該途徑有關新基因可能與該途徑有關。3 基因功能分析v高通量、低消耗、自動化高通量、低消耗、自動化不同個體不同個體不同細胞分化周期不同細胞分化周期不同病變不同病變不同分化階段不同分化階段腫瘤細胞腫瘤細胞mRNAB73Mo17F1B73Mo17F1Swanson-Wagner, Jia, DeCo

18、ok, Borsuk, Nettleton, Schnable (2006)Proceeding of the National Academy of Science. 103, 6805-6810. Identifying Barley Genes Involved inResistance to a Fungal PathogenBarley GenotypeMla6 Mla13 Mla1Bgh Isolate5874K1IncompatibleIncompatibleIncompatibleIncompatibleCompatibleCompatibleCaldo, Nettleton,

19、 Wise (2004). The Plant Cell. 16, 2514-2528.Gene Expression in Brains of Mice Selected for High Voluntary ExerciseBronikowski, Rhodes, Garland, Prolla, Awad,Gammie (2004) Evolution 58, 2079-2086.Myostatin Knockout Mice vs. Wild Typev 基因突變（gene mutation)：是指一個基因內部可以遺傳：是指一個基因內部可以遺傳的結構改變，是基因分子內部在某種條件作用下

20、所發生的的結構改變，是基因分子內部在某種條件作用下所發生的一個或幾個核苷酸的改變，導致結構蛋白或酶的改變，從一個或幾個核苷酸的改變，導致結構蛋白或酶的改變，從而影響有機體的大小、品質、顏色、結構和生長率等性狀而影響有機體的大小、品質、顏色、結構和生長率等性狀的改變。的改變。v 基因突變一般在染色體結構上是看不到的，所以又稱點突基因突變一般在染色體結構上是看不到的，所以又稱點突變（變（point mutation）。）。v 堿基替換(base substitution)v 堿基插入(base insertion)v 堿基缺失(base deletion)二二 DNADNA芯片在基因突變檢測與多態

21、性分析中的應用芯片在基因突變檢測與多態性分析中的應用胸腺嘧啶胸腺嘧啶 (T)腺嘌呤腺嘌呤(A)胞嘧啶胞嘧啶(C)鳥嘌呤鳥嘌呤(G)轉換轉換顛換顛換v 1 1 核酸分子雜交核酸分子雜交v 2 2 單鏈構象多態性單鏈構象多態性(single-strand conformation (single-strand conformation polymorphism,SSCP)polymorphism,SSCP)v 3 3 異質雙鏈構象多態分析異質雙鏈構象多態分析v 4 4 限制性內切酶譜分析限制性內切酶譜分析v 5 DNA5 DNA限制性片斷長度多態性分析（限制性片斷長度多態性分析（restricti

22、on fragment restriction fragment length polymorphism,RFLP)length polymorphism,RFLP)v 6 DNA6 DNA序列分析序列分析v 7 7 變形梯度凝膠電泳（變形梯度凝膠電泳（denature gradient gelatin denature gradient gelatin electrophoresis)electrophoresis)v 8 8 變性高效液相色譜（變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid denaturing high performance li

23、quid chromatograph,DHPLC)chromatograph,DHPLC)v 9 9 毛細管電泳（毛細管電泳（capillary electrophoresis,CE)capillary electrophoresis,CE)基因突變檢測方法基因突變檢測方法單鏈構象多態性單鏈構象多態性(single-strand conformation polymorphism,SSCP) - primer - 32P-dNTP摻入摻入 PCR擴增擴增 產物產物 變性變性 單鏈單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影自顯影 1為正常為正常 結果分析

24、結果分析 2、4、5為純合患者為純合患者 3為雜合子為雜合子 . Allele II 產生了新的酶切點產生了新的酶切點 Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouthern blot檢測結果檢測結果 費時且成本較高，很難適應快速、經濟、大規模的序列比較和突變分析的需要 根據已知基因的序列信息可以設計出含有根據已知基因的序列信息可以設計出含有成千上萬個不同寡核苷酸探針的成千上萬個不同寡核苷酸探針的DNA芯片。芯片。再用熒光標記待測再用熒光標記待測DNA，如果兩者完全匹配，如果兩者完全匹配，則雜交后結合牢固熒光強度高，如不完全則雜交后結合牢固熒光強度高，如不完全

25、匹配則熒光強度弱或無，由此可以判斷點突匹配則熒光強度弱或無，由此可以判斷點突變的有或無變的有或無原理原理DNA芯片檢測基因突變探針設計探針設計疊瓦式策略一 雜交信號增益法(gain of hybridization signal approach)v 采用疊瓦式探針設計，將與突變位點上各種采用疊瓦式探針設計，將與突變位點上各種可能突變的序列互補的寡核苷酸探針固定在可能突變的序列互補的寡核苷酸探針固定在芯片上，以芯片上，以PCR擴增并標記靶序列，然后與芯擴增并標記靶序列，然后與芯片雜交根據雜交信號的有無片雜交根據雜交信號的有無(即芯片上哪些即芯片上哪些突變探針上產生了強的熒光信號突變探針上產生了

26、強的熒光信號)，可確定突，可確定突變類型變類型 ，這些探針獲得的相對信號增益表明，這些探針獲得的相對信號增益表明某個序列發生了改變，類似于傳統的點雜交某個序列發生了改變，類似于傳統的點雜交分析，其特點是可同時檢測雙鏈分析，其特點是可同時檢測雙鏈DNA(dsDNA)的兩條鏈的兩條鏈,可檢測堿基的替換、可檢測堿基的替換、缺失和插入。缺失和插入。檢測長度為檢測長度為N N的雙鏈靶序列上所有的單核苷酸替換的雙鏈靶序列上所有的單核苷酸替換8N檢測兩條靶分子鏈上一段特定長度上檢測兩條靶分子鏈上一段特定長度上所有所有可能缺失的堿基可能缺失的堿基檢測檢測N個堿基長的兩條靶分子鏈上有個堿基長的兩條靶分子鏈上有x

27、個堿基插入的所有可能情況個堿基插入的所有可能情況2N2(4x)N要檢測長為要檢測長為10kb10kb的靶的靶DNADNA雙鏈上所有的單核苷酸替換雙鏈上所有的單核苷酸替換80000要篩查所有的要篩查所有的15bp的插入的插入27280000二 雜交信號消減法loss-of-signal aproachv 設計與基因突變區完全配對的野生型寡核設計與基因突變區完全配對的野生型寡核苷酸探針苷酸探針( 一般為一般為25nt)并固化在芯片上，并固化在芯片上，擴增待測樣品和野生型參照樣品的靶序列擴增待測樣品和野生型參照樣品的靶序列并以不同的熒光進行標記后混合在一起與并以不同的熒光進行標記后混合在一起與芯片雜

28、交，比較的雜交信號的差異芯片雜交，比較的雜交信號的差異(即分析即分析待測樣品的雜交信號相對于參照樣品信號待測樣品的雜交信號相對于參照樣品信號減少的相對量減少的相對量)，可確定突變發生的大致區，可確定突變發生的大致區段段檢測長度為檢測長度為N N的雙鏈靶序列上所有的可能的突變的雙鏈靶序列上所有的可能的突變2N要檢測長為要檢測長為5.5kb5.5kb的靶的靶DNADNA雙鏈上所有的單核苷酸替換雙鏈上所有的單核苷酸替換11000其特點是可同時檢測其特點是可同時檢測dsDNAdsDNA的兩條鏈任何形式的突變信的兩條鏈任何形式的突變信號都可檢出，不能確定突變類型必須通過對雜交信號號都可檢出，不能確定突變

29、類型必須通過對雜交信號消減區進行雙脫氧測序來鑒定序列變異的類型。其敏感消減區進行雙脫氧測序來鑒定序列變異的類型。其敏感性、特異性優于信號增益法。性、特異性優于信號增益法。三 雜交/延伸法v將未標記的靶序列片段與芯片上寡核苷酸將未標記的靶序列片段與芯片上寡核苷酸探針雜交配對后，以靶序列為模板，以標探針雜交配對后，以靶序列為模板，以標記不同顏色熒光的雙脫氧核苷三磷酸記不同顏色熒光的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)為原料、以寡核苷酸探針作為引為原料、以寡核苷酸探針作為引物在聚合酶作用下進行延伸反應物在聚合酶作用下進行延伸反應(此法又此法又被稱為微測序分析，被稱為微測序分析，minisequencing

30、 analysis)；或者加入帶標記的寡核苷酸片；或者加入帶標記的寡核苷酸片段，以連接酶進行連接反應，通過比較正段，以連接酶進行連接反應，通過比較正常對照樣品和突變樣品靶序列的雜交圖譜，常對照樣品和突變樣品靶序列的雜交圖譜，可確定突變情況可確定突變情況vP53P53基因是一個重要的抑癌基因。研究發現在大約基因是一個重要的抑癌基因。研究發現在大約200200多種不同的人類腫瘤中，多種不同的人類腫瘤中，5050的腫瘤都存在的腫瘤都存在P53P53基因突變，基因突變，P53P53基因的缺失能夠導致早期腫瘤基因的缺失能夠導致早期腫瘤的發生。的發生。vP53P53基因由基因由1111外顯子和外顯子和10

31、10個內含子組成，編碼個內含子組成，編碼393393個氨基酸，點突變是個氨基酸，點突變是P53P53基因突變的主要形式，基因突變的主要形式，9090以上的點突變發生在相對保守的第以上的點突變發生在相對保守的第5 59 9個外顯個外顯子上，突變熱點集中在子上，突變熱點集中在273273、175175、248248、245245、249249、282282等位點上。等位點上。基因芯片檢測基因芯片檢測P53P53基因突變基因突變構建P53突變位點檢測的芯片v芯片上的探針以每五個一組，每組中的探芯片上的探針以每五個一組，每組中的探針除了一個堿基置換位點外，均與參照序針除了一個堿基置換位點外，均與參照序

32、列互補。在置換位點由列互補。在置換位點由4種堿基和單堿基缺種堿基和單堿基缺失失5種不同的狀態。選擇熒光標記的檢測種不同的狀態。選擇熒光標記的檢測DNA與完全匹配探針雜交的條件為其與芯與完全匹配探針雜交的條件為其與芯片雜交的條件。這樣使產生較其他四個探片雜交的條件。這樣使產生較其他四個探針高的雜交熒光強度，從而確認置換位點針高的雜交熒光強度，從而確認置換位點的堿基。的堿基。GCCGTACTTGGACTCCGG5-GGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATC-3GCCGTACTTGGCCTCCGGGCCGTACTTGGGCTCCGGGCCGTACTTGGTCTCCGGGCCGTACTTGG_

33、CTCCGG外顯子外顯子7 7的密碼子的密碼子248248堿基替換位點堿基替換位點vAhrendt et al 采用上述采用上述P53基因芯片和雙基因芯片和雙脫氧核苷測序法對脫氧核苷測序法對100例外科切除的肺癌標例外科切除的肺癌標本進行了突變檢測。基因芯片檢測到第本進行了突變檢測。基因芯片檢測到第211個外顯子內個外顯子內81的突變，檢測的準確率的突變，檢測的準確率達到了達到了98。而且基因芯片檢測。而且基因芯片檢測P53突變突變的時間大大少于直接測序法。的時間大大少于直接測序法。v因此可以說明基因芯片檢測突變臨床提供了快速、準確、高效的檢測方法。v多態性多態性(polymorphism)是

34、指處于隨機婚配是指處于隨機婚配的群體中，同一基因位點可存在兩種以上的群體中，同一基因位點可存在兩種以上的基因型。在人群中個體間基因的核苷酸的基因型。在人群中個體間基因的核苷酸序列存在的差異性稱為序列存在的差異性稱為DNA的多態性。的多態性。vDNA長度多態性（長度多態性（length polymorphism)v位點多態性（位點多態性（site polymorphism)DNA芯片檢測基因多態性v長度多態性（長度多態性（length polymorphism):1變數串聯重復序列變數串聯重復序列(variable number of tandem repeats, VNTR):由于相同的重由于

35、相同的重復序列重復次數不同所致，它決定了小衛復序列重復次數不同所致，它決定了小衛星星DNA長度的多態性長度的多態性2 由于基因的某一片斷的缺失或插入所致。由于基因的某一片斷的缺失或插入所致。v位點多態性位點多態性(site polymorphism)v由于等位基因之間在特定的位點上由于等位基因之間在特定的位點上DNA序序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基列存在差異，也就是基因組中散在的堿基不同，包括點突變（轉換和顛換）、單個不同，包括點突變（轉換和顛換）、單個堿基的缺失和插入堿基的缺失和插入SNP (Single Nucleotide Polymorphism )v不同個體間在基因水平上不同

36、個體間在基因水平上的單核苷酸變的單核苷酸變異，異，平均每平均每10001000對堿基出現一個對堿基出現一個SNP,2SNP,2個無關個體間有個無關個體間有300300萬萬SNPs.SNPs.vSNP研究研究為了解疾病的發病機理，疾病的為了解疾病的發病機理，疾病的診斷及疾病易感性研究提供基礎。診斷及疾病易感性研究提供基礎。v位于外顯子區并改變氨基酸序列的位于外顯子區并改變氨基酸序列的SNPSNP以及以及位于基因表達調控區的位于基因表達調控區的SNPSNP可能具有重要臨可能具有重要臨床意義和功能意義床意義和功能意義v生物信息學可提供生物信息學可提供SNPSNP的數據庫和功能預測的數據庫和功能預測4

37、L疊瓦式陣列1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12165695- T G A C T G T A T C C G A C A T G.A-33- A A T G A C A T A G G C T G3- A C T G A C A T A G G C T G3- A G T G A C A T A G G C T G3- A T T G A C A T A G G C T G3- C A G A C A T A G G C T G T3- C C G A C A T A G G C T G T3- C G G A C A T A G G C T G T3- C T G A C

38、A T A G G C T G TmtDNA探針探針 14探針探針 58探針 .v接收呀接收呀Winzeler對酵母基因組單個堿基錯配進行了分析v根據酵母基因組根據酵母基因組S288c參考序列中的每個參考序列中的每個ORF至少設計至少設計20個長個長25nt的寡核苷酸片段，的寡核苷酸片段，按按ORF在染色體位點上的順序將其排列在在染色體位點上的順序將其排列在芯片上，每個寡核苷酸探針下面再設計一芯片上，每個寡核苷酸探針下面再設計一個錯配寡核苷酸，其區別僅在于中央位點個錯配寡核苷酸，其區別僅在于中央位點有一個錯配堿基，這樣便形成了一個稱作有一個錯配堿基，這樣便形成了一個稱作2L非疊瓦式陣列非疊瓦式

39、陣列。探針設計探針設計v將兩種不同株系將兩種不同株系S96與與YJM789的酵母基因組的酵母基因組DNA標記后混合在一起與芯片進行雜交標記后混合在一起與芯片進行雜交v 基因診斷基因診斷(gene diagnosis)又稱為分子診又稱為分子診斷斷(Molecular diagnosis)，是指利用現代，是指利用現代分子生物學和分子遺傳學方法，通過檢測分子生物學和分子遺傳學方法，通過檢測基因的存在、結構變異或表達功能的異常，基因的存在、結構變異或表達功能的異常，對人體狀態和疾病作出診斷的方法和過程。對人體狀態和疾病作出診斷的方法和過程。基因診斷以基因診斷以DNA和和RNA為診斷材料，所以，為診斷材

40、料，所以，其概念包括其概念包括DNA診斷和診斷和RNA診斷兩個方面診斷兩個方面三三 DNADNA芯片與基因診斷芯片與基因診斷傳統診斷基因診斷以疾病表型的改變為依據直接檢測決定表型的基因，屬病因診斷，針對性強靈敏度高、特異性強。此外基因診斷還具有適用范圍廣的特點，其應用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領域原理v通過檢測致病基因通過檢測致病基因(包括內源基因與外源包括內源基因與外源基因基因)的存在、量的多少，結構變化與否的存在、量的多少，結構變化與否及表達水平是否正常，以確定被檢查者是及表達水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾否存在基

41、因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據病確診的依據臨床意義不僅能對有表型出現的疾病作出明確診斷，而且可實不僅能對有表型出現的疾病作出明確診斷，而且可實現早期快速診斷：如產前診斷遺傳性疾病，檢出感染現早期快速診斷：如產前診斷遺傳性疾病，檢出感染性疾病潛伏期的病原微生物，還可早期發現某些惡性性疾病潛伏期的病原微生物，還可早期發現某些惡性腫瘤。此外還能確定個體對疾病的易感性、進行疾病腫瘤。此外還能確定個體對疾病的易感性、進行疾病的分期分型、療效監測、預后判斷等的分期分型、療效監測、預后判斷等。v是基因診斷及分子生物學領域中最常用的是基因診斷及分子生物學領域中最常用的技術之一通過用已知序列的探針檢測

42、樣技術之一通過用已知序列的探針檢測樣本中是否含有與之互補的同源核酸序列，本中是否含有與之互補的同源核酸序列，具有靈敏度高、特異性強等優點，主要用具有靈敏度高、特異性強等優點，主要用于特異于特異DNA或或RNA的定性、定量檢測的定性、定量檢測核酸分子雜交核酸分子雜交基因診斷的技術概論基因診斷的技術概論（一）（一）DNA印跡技術印跡技術 (Southern blotting) 用于基因組用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體、重組質粒和噬菌體的分析。的分析。（二）（二）RNA印跡技術印跡技術 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白質的印跡分析（

43、三）蛋白質的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質定性定量及相互作用研究。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。 Southern印跡雜交印跡雜交Northern印跡雜交印跡雜交是經典的是經典的DNADNA分析法，將分析法，將DNADNA經限制性酶切凝膠電泳及經限制性酶切凝膠電泳及變性后，轉移至膜上與標記探針進行雜交。主要用于變性后，轉移至膜上與標記探針進行雜交。主要用于基因組基因組DNADNA的分析的分析檢測特異的檢測特異的DNADNA片段并進行定位片段并進行定位和測定相對分子質量，也可用于基因的酶切圖譜分忻和測定相對分子質量，也可用于基因的酶切圖譜分忻、基因突變分析等、基因

44、突變分析等是經典的是經典的RNARNA分析法，將分析法，將RNARNA經變性凝膠電泳轉移至膜經變性凝膠電泳轉移至膜上與標記核酸探針雜交，用于檢測上與標記核酸探針雜交，用于檢測mRNAmRNA的表達水平以的表達水平以及定性和定量分析組織細胞中的總及定性和定量分析組織細胞中的總RNARNA三種印跡技術的比較三種印跡技術的比較分子雜交實驗分子雜交實驗放放射射自自顯顯影影照照片片是將RNA或DNA變性后直接點樣吸附于硝酸纖維素膜上，然后用標記探針與之雜交、用于基因組中特定基因及其表達水平的定性及定量分析方法簡單、快速、靈敏、樣品用量少。其缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質量，特異性不高，有一定比例的假

45、陽性斑點雜交（斑點雜交（dot blot)dot blot)斑點雜交結果：斑點雜交結果： / /S S/S 正常探針正常探針 突變探針突變探針突變突變型遺傳病的型遺傳病的直接直接基因診斷基因診斷v是在組織、細胞和染色體水下直接檢測核是在組織、細胞和染色體水下直接檢測核酸并定位。染色體原位雜交可查明染色體酸并定位。染色體原位雜交可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷及染色體重排起源的研究。原位雜交的斷及染色體重排起源的研究。原位雜交的結果是顯示核酸序列的空間位置狀況。因結果是顯示核酸序列的空間位置狀況。因此可檢出含核酸序列的具體組織或細胞，此可檢出

46、含核酸序列的具體組織或細胞，細胞具體定位、基因拷貝數目及類型，可細胞具體定位、基因拷貝數目及類型，可檢出基因和基因產物的亞細胞定位檢出基因和基因產物的亞細胞定位原位雜交原位雜交（in situ hybridization)熒光原位雜交熒光原位雜交v聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（PCR)v限制性酶切分析限制性酶切分析v單鏈構像多態性（單鏈構像多態性（SSCP)vDNA序列測定序列測定vDNA芯片技術芯片技術點突變的診斷v某位點正常堿基為C 突變為 TAGAGAGAG正常正常 純合純合C/C突變突變 純合純合T/T突變突變 雜合雜合T/C未知突變未知突變vBRCA1基因與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切

47、相關，該基因最常見的突變包括點突變、小范圍的插入與缺失等。這些突變將破壞該基因編碼的蛋白質結構。Hacia等利用在1.28cm x1.28cm大小的區域上固定9.66xl04個長度為20nt的寡核苷酸探針的基因芯片，檢測了BRCAl基因第11外顯子3.45kb長度內所有可能的堿基置換、插人和缺失(1一5bp)突變。針對每一個位點，設計28個獨立的探計，14個針對有義鏈，14個針對反義鏈。14個探針中包括2個野生型、3個堿基置換、4個插入突變、5個堿基缺失的探針：在15例患者樣品中，發現有14例有基因突變，類型包括點突變、插人及缺失等。在20例對照樣品中均未檢出假陽性結果。v藥物篩選是指基于一定

48、的模型，依據一定藥物篩選是指基于一定的模型，依據一定的指標，對可能作為藥用的物質進行初步的指標，對可能作為藥用的物質進行初步的藥理活性的檢測和實驗，以期發現有活的藥理活性的檢測和實驗，以期發現有活性的藥物或藥物前體為發展新藥提供最性的藥物或藥物前體為發展新藥提供最初始的依據和資料初始的依據和資料 藥物篩選藥物篩選四四 DNADNA芯片在藥物研究與開發中的應用芯片在藥物研究與開發中的應用基因芯片技術用于藥物篩選基因芯片技術用于藥物篩選v方法方法1：v利用基因芯片技術先建立臨床療效確切的利用基因芯片技術先建立臨床療效確切的藥物作用細胞后的標準基因表達譜，然后藥物作用細胞后的標準基因表達譜，然后將待

49、篩選藥物作用細胞，對其基因表達譜將待篩選藥物作用細胞，對其基因表達譜與數據庫中的圖譜進行相似性比較，根據與數據庫中的圖譜進行相似性比較，根據待篩選藥物與療效確切的藥物在基因水平待篩選藥物與療效確切的藥物在基因水平上作用的相似性，揭示化合物潛在的藥理上作用的相似性，揭示化合物潛在的藥理活性活性v方法方法2：v分析正常組織細胞與病變組織細胞間基因分析正常組織細胞與病變組織細胞間基因表達的差異，從差異表達的基因中篩選出表達的差異，從差異表達的基因中篩選出與藥物作用相關的靶基因，然后利用這些與藥物作用相關的靶基因，然后利用這些靶基因制備芯片進行藥物篩選。靶基因制備芯片進行藥物篩選。vHan et al

50、 用含有5289個cDNA序列的芯片檢測了胰腺癌細胞與正常胰腺細胞的差異表達基因。結果發現有30個基因表達有明顯差異，其中有25個基因用RT-PCR及Northern印跡進行驗證。表達上調的基因有c-mys、Rad51、硫氧還蛋白還原酶及細胞周期依賴蛋白激酶2（CDK2）的基因等。其中， c-mys和Rad51已用病人標本進行了RT-PCR驗證分析，與芯片結果一致。v 基團芯片技術可以將組織、細胞中基因表基團芯片技術可以將組織、細胞中基因表達水平的相同和差異一目了然地顯現出來，達水平的相同和差異一目了然地顯現出來，因此分析藥物作用前后相應組織、紉胞因此分析藥物作用前后相應組織、紉胞基因表達的改

51、變，就可從分子水平、基因基因表達的改變，就可從分子水平、基因水平來闡明藥物的作用機制有助于對疾水平來闡明藥物的作用機制有助于對疾病發生過程中相應的分子事件進行更深入病發生過程中相應的分子事件進行更深入的研究的研究基因芯片技術用于藥物藥理學基因芯片技術用于藥物藥理學vBoyer et al為了研究為了研究5-FU(5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶 )的作用機制，應用的作用機制，應用DNA芯片對芯片對5-FU治療的治療的MCF-7乳腺癌細胞基因表達譜進行了檢測。乳腺癌細胞基因表達譜進行了檢測。結果發現，在結果發現，在5-FU處理后，處理后，MCF-7細胞的細胞的多種基因表達發生改變，包括精胺己酸轉多種基因表達

52、發生改變，包括精胺己酸轉移酶（移酶（SSAT)基因和膜聯蛋白基因和膜聯蛋白基因。同基因。同時還發現在對時還發現在對5-FU耐藥的細胞中，耐藥的細胞中，SSAT基因和膜聯蛋白基因和膜聯蛋白基因的表達上調。因此基因的表達上調。因此推測推測SAT和膜聯蛋白和膜聯蛋白基因可能與基因可能與5-FU在在腫瘤中的作用有關。腫瘤中的作用有關。傳傳統統基因芯片技術用于藥物毒理學基因芯片技術用于藥物毒理學芯芯片片利用基因芯片技術，以細胞作為體外模型系統，快速利用基因芯片技術，以細胞作為體外模型系統，快速分析待側毒性化合物作用細胞后產生的基因表達譜，分析待側毒性化合物作用細胞后產生的基因表達譜，然后與已知毒性化合物

53、作用組織細胞后產生的標準然后與已知毒性化合物作用組織細胞后產生的標準基因表達譜相比較，就能在藥物研發的早期很方便地基因表達譜相比較，就能在藥物研發的早期很方便地鑒別出毒性化合物，而不必進行后續的動物實驗與鑒別出毒性化合物，而不必進行后續的動物實驗與臨床試驗，從而節省大量人力、物力和時間臨床試驗，從而節省大量人力、物力和時間v Waring JF等分析了等分析了15種具有肝臟毒性的種具有肝臟毒性的化合物作用于大鼠后的基因表達譜，并將化合物作用于大鼠后的基因表達譜，并將它們與組織病理學結果和臨床化學檢測值它們與組織病理學結果和臨床化學檢測值相比較，發現三者之間具有極大的相關性，相比較，發現三者之間

54、具有極大的相關性，充分證明了基因芯片技術在化合物毒性檢充分證明了基因芯片技術在化合物毒性檢測和安全性評價方面的敏感性和準確性測和安全性評價方面的敏感性和準確性v 不同病人對藥物的反應性及毒副反應的發生亦有所不同通過基因水平的研究分析，有助于為病人用藥提供更為確切的客觀標難。另外，對于某類疾病，常常有來自不同廠家的多個藥品，例如抗菌素類藥品、腫瘤化療藥品等等，常常需要多次更換藥物，才能達到最有效的治療。DNA芯片技術可以快速分析病人個體細胞對多種藥物的反應性。即可以通過體外試驗，以最快的速度挑選出最為有效的治療藥物基因芯片技術用于合理用藥與個體化用藥基因芯片技術用于合理用藥與個體化用藥利福平甲乙

55、乙RNA聚合酶基因v細胞色素細胞色素P450是體內重要的藥物代謝酶，是體內重要的藥物代謝酶，大約參與了大約參與了40的藥物代謝過程，但細胞的藥物代謝過程，但細胞色素色素P450代謝酶的多態性使藥物的代謝發代謝酶的多態性使藥物的代謝發生改變，最終在藥物的效應上出現個體差生改變，最終在藥物的效應上出現個體差異。因此在臨床用藥前，先檢測病人的基異。因此在臨床用藥前，先檢測病人的基因有無耐藥性突變，再有針對性的用藥，因有無耐藥性突變，再有針對性的用藥，可以極大的提高治療效果，避免不必要的可以極大的提高治療效果，避免不必要的人力、物力和財力的浪費人力、物力和財力的浪費vMikhailovich et a

56、l 應用含42個寡核苷酸探針的芯片，24h內就辨別出了30個rpoB基因的突變。vKihara C et al 應用基因芯片技術，比較食管癌患者腫瘤組織的基因表達講，根據統計學分析篩選出52個基因，并根據這些基因的差異表達建立丁一種藥物反應打分系統，用于預測食管癌患者手術治療后進行輔助化療的敏感性，從而對正確選擇病例進行輔助化療具有積極的指導作用，避免了對化療不敏感的病人進行化療的痛苦和藥物的無謂浪費v常規只檢測中藥中某幾種有效成分的鑒定常規只檢測中藥中某幾種有效成分的鑒定方法就無法鑒定出真偽優劣，而基因芯片方法就無法鑒定出真偽優劣，而基因芯片技術檢測的是中藥材的基因表達譜，假藥技術檢測的是中

57、藥材的基因表達譜，假藥必定會在基因圖譜前原形畢露必定會在基因圖譜前原形畢露基因芯片技術在中藥研究中的應用基因芯片技術在中藥研究中的應用v應用基因芯片技術，檢測中藥作用前后基應用基因芯片技術，檢測中藥作用前后基因表達的變化以及對人體重要功能基因的因表達的變化以及對人體重要功能基因的影響，就可以從基因水平上闡述中藥的作影響，就可以從基因水平上闡述中藥的作用機理，判斷中藥的毒副作用及毒性大小，用機理，判斷中藥的毒副作用及毒性大小，利于中藥更廣泛地被認同利于中藥更廣泛地被認同1 黃連及其所含的小糱堿會導致新生兒黃疸2 廣防己和漢防己混用會導致馬兜鈴酸致腎衰v利用基因芯片技術，結合功能基因組學，利用基因

58、芯片技術，結合功能基因組學，分析中藥中各個組分的基因表達譜，就能分析中藥中各個組分的基因表達譜，就能輕而易舉地發現中藥中的有效成分。大大輕而易舉地發現中藥中的有效成分。大大加快中藥有效成分單體的發現過程，進一加快中藥有效成分單體的發現過程，進一步分析有效成分的化學結構，進行一定的步分析有效成分的化學結構，進行一定的量效關系分析及基團的修飾、改造，合成量效關系分析及基團的修飾、改造，合成低毒、有效的化學單體低毒、有效的化學單體.發現新的有效成分發現新的有效成分5 未來趨勢：生物芯片用于臨床v隨著人類基因組計劃的完成以及微陣列分隨著人類基因組計劃的完成以及微陣列分析技術的出現，把從微陣列分析所獲得

59、的析技術的出現，把從微陣列分析所獲得的基因和生化數據與全部的臨床診斷工具整基因和生化數據與全部的臨床診斷工具整合在一起，將能準確而深刻地洞察精神和合在一起，將能準確而深刻地洞察精神和生理紊亂的分子基礎。生理紊亂的分子基礎。健康檢查v健康檢查健康檢查( physical examination):用于評用于評價患者的整體健康狀況以及用于初診的一價患者的整體健康狀況以及用于初診的一種臨床實踐。種臨床實踐。但是，目前用于健康檢查的工具和方案達不到分子水平，只能提供少量甚至不能提供有關患者的基因、生化和生理方面的信息。病人的血液（DNA、RNA、蛋白質）外界環境（壓力、飲食、體能等）遺傳（基因序列）基

60、因表達（mRNA,蛋白質）基因型臨床數據醫生健康檢查全面的衛生保健生活方式改變、藥物治療、安慰療法、手術體能狀況v根據美國心臟協會的報告，通過定期鍛煉根據美國心臟協會的報告，通過定期鍛煉所獲得的健康效果是驚人的。所獲得的健康效果是驚人的。定期鍛煉跳舞走路舉重訓練游泳跳躍騎腳踏車可以減輕心血管疾病和糖尿病的危害、降低血液膽固醇含量和血壓、減肥以及提高精神健康，同時可以改變人的心態、提高自信、使人精力充沛適度的身體鍛煉過程中或者鍛煉之后基因表達會出現什么變化？身體健康的個體與已知從鍛煉獲得健康的個體之間存在生理方面的差異嗎？不同形式的體能狀況會產生不同的生理變化嗎？體能狀況怎樣同基因和環境因素一起