1、一、名詞解釋同裂酶(isoschizomer)：有些不同微生物來源的酶，能識別相同的序列，切割方式相同或不同，其中識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶。基因工程（genetic engineering）：是在分子水平上進行的遺傳操作，指將一種或多種生物體（供體）的基因或基因組提取出來，或者人工合成基因，按照人們的愿望，進行嚴密的設計，經過體外加工重組，轉移到另一種生物體（受體）的細胞內，使之能在受體細胞遺傳并獲得遺傳性狀的技術。Transform：轉化（transformation）：把以質粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程叫做轉化。轉染（transfection）：把以噬菌體或病毒

2、為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程叫做轉染。扣除雜交（subtractive hybridization）：又叫扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning）它是通過構建扣除文庫得以實現的。Southern blotting（Southern印跡雜交技術）：根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA經轉膜后與DNA探針雜交以檢測這些被雜交的DNA片段的實驗方法。DNA連接酶（ligase）：能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二脂鍵的酶。多克隆位點（MSC）：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內切酶識別位點。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入

3、方案。載體（vectoe）：是指基因工程中攜帶外源基因進入受體細胞的“運載工具”，他的本質是DNA復制子。同尾酶（isocaudamer）：有一些限制性內切酶，他們來源各異，識別序列也各不相同，但切割后產生相同的粘性末端，特稱之為同尾酶。感受態：受體細胞處于易接受外源DNA轉化時的生理狀態。感受細胞：就是受體細胞處于攝入外源DNA的狀態。DNA文庫（基因文庫）：是通過克隆方法保存在適當宿主中的某種生物、組織、器官或細胞類型的所有DNA片段而構成的克隆集合體。基因組文庫（genomic library）：是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段克隆到某種載體上形成的集合。cDNA

4、文庫（cDNA library）：從一定生長階段或條件的某種細胞分離到的全部mRNA經反轉錄成cDNA后再重組和增殖所產生的天性繁殖系的總和。載體（vectoe）：是指基因工程中攜帶外源基因進入受體細胞的“運載工具”，他的本質是DNA復制子。限制性內切酶（restriction endonuclease）：識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。基因芯片（gene chips）：是指采用原位合成或直接點樣的方法將大量DNA片段或寡核苷酸片段以預先設計的方式排列在硅片、玻璃等介質上形成微矩陣，待檢樣品用熒光分子標記后，與微矩陣雜交，通過熒光掃描及計算機分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表

5、達信息，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。分子標記（molecular marker）：廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白。狹義的分子標記只是指DNA標記，而這個界定現在被廣泛采納。轉化（transformation）：把以質粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程叫做轉化。 轉染（transfection）：把以噬菌體或病毒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程叫做轉染。二、填空題核酸提取的一般步驟包括細胞破碎、除去與核酸結合的蛋白質及多糖脂等雜質、除去其它雜質核酸獲得均一樣品。目前發現的限制性內切酶可以分為 三 類（型、型、型），其中對基因工程操作為之有用

6、的酶是 型酶。基因工程的三大要素是供體、受體、載體。堿性磷酸酶的主要作用是5'末端標記前處理，去除DNA片段的5' ，一般我們需要利用堿性磷酸酶處理線性載體，以達到所需效果。核酸純化的目的是 、 、 。一般連接反應發生的折衷溫度為16（1020）。受體細胞的感受態是指受體細胞處于易接受外源DNA轉化時的生理狀態。DNA片段的體外連接一般包括2種連接方式，其中粘性末端連接是最易的。質粒的空間構型有三種閉合環狀DNA、開環DNA、線性DNA，在凝膠電泳上跑的最快的是閉合環狀DNA，最慢的是開環DNA。PCR擴增需要模板分子、Primer、TqDNA聚合酶、dNTPs、buffer（

7、Mg2+）。理想的質粒克隆載體必須具備的基本條件，如具有復制起點、具有抗菌素抗性基因、具有若干限制性內切酶單一識別位點、具有較小的分子量和較高的拷貝數。三、不定向選擇題在DNA的提取過程中，常用的沉淀DNA的試劑有 （B、D）A三氯甲烷 B乙醇 C異戊醇 D異丙醇 E甲醇DNA連接酶的功能是 （ C ）A恢復3'-OH與5'-P之間的磷酸二脂鍵 B恢復缺口C恢復裂口 D可使平末端與粘性末端連接E任何末端都可連接DNA被某種酶切割后，電泳后得到的電泳帶有些擴散，下列原因中，哪一項不太可能？ （ A ）A酶失活 B有蛋白質污染C酶切條件不適合 D外切核酸酶污染堿裂解法制備質粒DNA

8、的方法出現的溶液、的作用有哪些？（B、C）A裂解細胞 B懸浮菌C使DNA發生變性 D沉淀蛋白質E小分子DNA快速復性而染色體DNA復性較慢下面有關抑制性衰減雜交技術（SSH）的描述正確的是 （ ）A需要制備檢測（tester）DNA和驅動（driver）DNAB只需進行一次雜交反應C檢測DNA要分別接上兩個不同的接頭D要進行兩次PCR反應E檢測結果的假陽性比率較低SDS是分離DNA時常用的一種陰離子除垢劑，它的作用 （A、B）A溶解膜蛋白及脂肪，從而使細胞膜破裂B溶解核膜和核小體，使其裂解，將核釋酸放出來C對RNase、DNase有一定的抑制作用D能夠使蛋白質變性沉淀E能夠去除酚類或多糖物質關

9、于PCR擴增停滯（平臺效應）的原因有很多種，原因包括 （B、C、D、E）A底物（模板）過剩 B dNTPs的大量消耗C產物的聚集 D非特異性產物的競爭性抑制E酶活性的喪失CsClEB密度梯度離心法純化質粒DNA的原理是 （ C ）A氯化銫可以較多的插入到線狀DNA中去B氯化銫可以較多的插入到SC DNA中去C EB可以較多的插入到線狀DNA中去D EB可以較多的插入到SC DNA中去E CsClEB均可出入到線狀DNA分子中去下列哪個不是southern印跡雜交的步驟？ （ B ）A用限制酶消化DNA BDNA與載體的連接C用凝膠電泳分離DNA片段DDNA片段轉移與纖維素膜上E用一個標記的探針

10、與膜雜交下列關于基因的敘述中，正確的是 （A、B）A每一個DNA片段都是一個基因B每一個基因都控制著一定的性狀C有多少基因就控制著多少遺傳性狀D基因控制的性狀都能在后代表現出來E基因的序列全部位于編碼區內基因工程的幾大要素包括 （B、D、E）A工具酶 B供體 C蛋白質 D受體 E載體轉化外源基因常用的方法有 （A、C、E）A基因槍法 B3'RACE C花粉管通道法 DPCR法 E農桿菌介導法DNA凝膠電泳遷移率與下面哪些有關（B、C、D、E）A DNA的量 B電場的強度 C DNA分子的大小D DNA分子的形狀 E介質的粘度載體和外源DNA插入片段的連接結果（A、B、D、E）A載體自身

11、環化連接 B載體之間相互連接 C插入片段互相連接 D一個載體與幾個插入片段重組E幾個載體與一個插入片段重組細菌基因組DNA的制備一般包括 （A、C、D ）A細胞裂解 B細胞分裂 C DNA純化D沉淀DNA E DNA酶消化影響限制性內切酶活性的因素 （A、B、C、E）A DNA的純度B DNA的甲基化程度 C溫度D水E Mg2+（酶的純度、DNA分子構型、溫度與時間、反應緩沖液）感受態細胞制備及轉化中的影響因素 （A、C、E）A細胞的生長狀態和密度 B質粒DNA的質量和濃度C所用的CaCl2 D雜菌和雜DNA污染 E冰浴操作質粒的抗菌素抗性選擇標有 （A、B、C）A氨芐青霉素抗性（Amp r）

12、 B卡那霉素抗性（Kan r）C四環素抗性 （Tet r） D鏈霉素抗性（Str r）E氯霉素抗性（Cml r）影響DNA連接反應的因素 （ B ）A dNTP B反應溫度 C反應時間 D插入片段的大小E插入片段與載體濃度（DNA末端結構、不同DNA末端的濃度、ATP濃度）可用于PCR擴增的酶有 （ C ）A核酸內切酶 BDNA連接酶 C TaqDNA聚合酶D DNA修飾酶 E核酸外切酶四、單項選擇題可一步到達條件最佳化的PCR技術是 （A）A touchdown PCR B 5'-RACE C RT-PCR D reverse PCR目前基因工程中所利用的限制性內切酶，主要為（）型在

13、重組DNA技術中，不常用到的酶是 （D）A限制性核酸內切酶 B DNA聚合酶 C DNA連接酶D DNA解鏈酶下列哪種克隆載體對外源DNA的載容量最大 （C）A質粒 B粘粒 C YAC D 噬菌體最常用的篩選轉化細菌是否含質粒的方法是 （B）A營養互補篩選 B抗藥性篩選 C PCR篩選D分子雜交篩選用于重組DNA的限制性核酸內切酶可以識別核苷酸序列的 （D）A正超螺旋結構 B負超螺旋結構 C螺旋結構D回文結構構建基因組DNA文庫時，首先需分離細胞的 （A）A染色體DNA B線粒體DNA C總mRNA D rRNA同一種質粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時它們的遷移速率是 （B）A、OCDN

14、A>SCDNA>LDNA B、SCDNA>LDNA>OCDNAC、LDNA>OCDNA>SCDNA D、SCDNA>OCDNA>LDNA用堿法分離質粒DNA時，染色體DNA之所以可以被除去，是因為 （D）A染色體DNA斷成了碎片 B染色體DNA分子量大，而不能釋放C染色體變性后來不及復性D染色體未同蛋白質分開而沉淀關于PCR擴增停滯的原因有很多種，但下列項中，（D）不是主要原因A DNA聚合酶的失活 B dNTP的大量消耗 C產生的聚集 D非特異性產物的競爭性抑制五、簡答題列舉3種常見的分子標記類型并簡要說明理由。答：AFLP（擴增片段長度多態性

15、分析）原理：通過限制性內切酶片段的不同長度檢測DNA多態性的一種DNA分子標記技術。但AFLP是通過PCR反應先把酶切片段擴增,然后把擴增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進行電泳,多態性即以擴增片段的長度不同被檢測出來。RFLP(限制性片段長度多態性) 原理：生物在長期進化過程中，種屬、品種間在同源DNA序列上會發生變化，改變了原有酶切位點所在的位置，從而使兩個酶切位點間的片段長度發生變化，這種變化經酶切、雜交及放射自顯影后就會變現出條帶的不同，由此可對生物的多態性進行分析。SNP（單核苷酸多態性）原理：SNP指基因組內DNA中某一特定核苷酸位置上存在轉換、顛換等變化，而且其中最少一種等位基

16、因在群體中的頻率不小于1%。SNP技術是一種基于構相的突變掃描方法，其基本原理是:對于一個經PCR擴增后具有固定長度的DNA片斷，其分子構象是由堿基序列所決定的。因此單個堿基的改變能夠引起DNA分子單鏈或等位基因間形成的錯配異源雙鏈在變性條件下存在微小的構象差別，這些不同的構象體在電泳或高效液相檢測中因移動性的差異而得以區分。什么是基因文庫？簡要說出基因組文庫和cDNA文庫構建流程。答：基因文庫（gene library）：是通過克隆方法保存在適當宿主中的某種生物、組織、器官或細胞類型的所有DNA片段而構成的克隆集合體。基因組文庫構建流程：基因組DNA制備酶切基因組DNA片段克隆到載體轉化到大

17、腸桿菌基因組DNA文庫。cDNA文庫構建流程：分離總mRNA體外反轉錄合成互補cDNA連接到載體上轉到宿主細胞建立cDNA文庫。PCR的基本原理是什么？用PCR擴增某一基因，必須預先得到什么樣的信息？影響PCR結果的一些因素?答：DNA半保留復制原理，在體外進行DNA變性、復性和引物延伸。 該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'

18、-OH末端，并以此為起始點，沿模板5'3'方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。 影響PCR結果的因素為模板分子、Primer、TqDNA聚合酶、dNTPs、buffer（Mg2+）。瓊脂糖凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素有哪些？并做簡單分析。答：DNA分子的大小：DNA分子量遷移率DNA分子構型：supercoil>線狀>開環凝膠濃度：（0.5%0.6%、56g/L）分離DNA 質量范圍，分辨率 （12g/L）才有可能區分開分子構型 25g/L，很難完成，能分離10kb差異外加電場強度V/cm：一般5V/cm電泳緩沖液：T

19、AE、TBE、TPEEB（溴化乙錠）：嵌入量會對核酸U會造成影響， 點樣前DNA要與loading buffer充分混合。簡述堿抽提法提取質粒DNA的一般原理及步驟。答：原理：閉合環狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；但有少量質粒開環成單鏈；染色體線性DNA和有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質SDS (sodium dodecylsulfate, 十二烷基硫酸鈉)復合物結合在一起，在離心時沉淀下去。 步驟：溶菌：使用“溶液”溶解細菌細胞壁Solution I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)、4-

20、5mg/ml溶菌酶、RNase A。（質粒DNA微量制備時,可省去溶菌酶）。用溶液II破膜及蛋白質和DNA變性 Solution II：0.2N NaOH、1.0%SDS.。現用現配。中和用溶液III使DNA復性、并促使蛋白質-SDS復合物和染色體DNA、RNA沉淀。Solution III：3M 醋酸鈉/鉀（用冰醋酸調pH至4.8）。離心除去沉淀 10 000 rpm, 5 min. 上清液中含有閉合環狀質粒NA。純化DNA 上清液過柱或酚-氯仿抽提。(5 000rpm, 2min)。沉淀DNA 上清液加入0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，10 000 rpm，5 min，沉淀溶于TE緩

21、沖液，于4保存。什么是-互補現象？在基因工程中我們如何利用-互補去鑒定重組子？答：這種lacZ基因上缺失近操作基因區段的突變體與帶有完整的近操作基因區段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現互補的現象叫-互補現象。當外源DNA插入到它的lacZ基因上時，可造成-半乳糖苷酶的失活效應，就可以通過大腸桿菌轉化子菌落添加有X-gal-IPTG培養基中的顏色變化鑒別出重組子與非重組子。由-互補產生的Lac+細菌較易識別，它在生色底物X-gal的存在下被IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pUC質粒的多克隆位點上后，則會導致讀碼框架改變，表達蛋白失活，產生的氨基酸片段失去互補

22、能力，因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。由此，根據這種-半乳糖苷酶的顯色反應，可將重組質粒與自身環化的載體DNA分開。簡述抑制性衰減雜交的原理及技術流程。答： 技術流程將試驗樣品的mRNA、供試樣品的mRNA分別轉錄為cDNA將試驗樣品、供試樣品的cDNA分別在Rsa酶切下產生較短的具有平頭末端的片段將經Rsa酶切后的試驗樣品cDNA片段分為兩份，分別接上接頭1（adapter-1）和接頭2（adapter-2）用經Rsa酶切的過量的供試樣品cDNA片段，分別與接上接頭1、接頭2的試驗樣品的cDNA雜交將第一次雜交后餓兩種產物混合，再與過量的供試樣品cDNA

23、雜交，具有差異表達的序列片段形成可以進行PCR擴增的模板在PCR過程中，只有那些片段兩端分別是接頭1和接頭2的具有差異表達的序列片段才能以指數級擴增進一步擴增具有差異表達的序列片段，并減少非特異性擴增利用接頭上的酶切位點插入合適的載體，轉細菌，用探針雜交篩選。舉兩種植物轉基因的方法？簡述其原理。答：基因槍法：基因槍技術的基本原理是利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅動力，將載有外源DNA的金粉（或鎢粉）等金屬微粒加速，射入受體細胞或組織，從而達到將外源DNA分子導入細胞的目的。花粉管通道法：基本原理是授粉后外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期

24、胚胎細胞。六、論述題談談基因工程的基本步驟，說明重要工具酶在各個步驟中的作用。答：獲得目的基因：分離（同源克隆）、測序、差減文庫 構建載體、目的基因插入 轉化（大量） 篩選重組子 擴增目的片段 導入宿主 進行表達（原核表達、真核表達） 驗證（超表達、沉默）你打算擴增下圖所示的兩段序列之間的DNA，請從所列出的引物中選出合適的引物，并簡要說明理由。5'-GACCTGTGGAAGC-CATACGGGATTG-3'3'-CTGGACACCT TCG-GTATGCCCTAAC-5' 引物1 引物25'-GACCTGTGGAAGC 5'-CATACGGGA

25、TTG5'-CTGGACACCT TCG 5'-GTATGCCCTAAC5'-CGAAGGTGTCCAG 5'-GTTAGGGCATACPCR反應中引物設計的原則有哪些？除了在PCR反應中，引物在基因工程中還有哪些方面的用途？答：引物設計的一般原則：引物長度應為1530個核苷酸，Tm 接近72較佳。 引物的Tm可按下列簡單公式計算： Tm=（G+C）×4+（A+T）×2引物中堿基的分布應當是隨機的，避免出現一連串 的單一堿基或產生二級結構。G+C的含量在45%55%左右。 兩個引物在3'端均必須與模板互補，5'端可以不互補。引

26、物自身連續互補堿基小于4個。引物之間連續互補堿基亦應小于4。某一質粒載體具有Tet r和Kan r的表現型，在Kan抗性基因內有一Bg的切點。現用Bg切割該載體進行基因克隆，問：轉化后涂皿時應加什么樣的抗菌素？培養后長出的菌落具有什么樣的抗性基因型？如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體？答：應加Tet r 培養后長出的菌落具有Tet r和Kan s的抗性基因型 在含有Tet和Kan中不能生長的重組子，卻能在僅含有Tet的生長的為理想的重組子。扣除雜交：扣除雜交又叫扣除cDNA克隆，它是通過構建扣除文庫得以實現的。cDNA：與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的存在下，

27、由RNA與DNA進行一定條件下合成的，就是cDNA。transformation（轉化）：外源遺傳物質進入細菌，引起細菌遺傳變化的現象。RAPD：RAPD是建立在PCR基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術。Gene library（基因文庫）：將這些載體導入到受體細菌或細胞中，這樣每個細胞就包含了一個基因組DNA片段與載體重組DNA分子，經過繁殖擴增， 許多細胞一起包含了該生物全部基因組序列，我們將這一個集合體叫做基因文庫。同裂酶：有些不同微生物來源的酶，能識別相同的序列，切割方式相同或不同，其中識別位點與切割位點均相同的不同來源地酶稱為同裂酶。填空題：1 DNA體外

28、重組的策略可分為四種：粘末端連接。 平末端連接T-A克隆人工接頭連接2 核酸雜交探針可分為：同位素標記探針和非同位素探針3轉基因常用的方法：農桿菌介導法;基因槍法;花粉管通道法;聚乙二醇法；電擊法；顯微注射法；浸漬法。4 堿性磷酸酶的主要作用：5末端標記前的處理。去除DNA片段的5磷酸基團，防止自身連接。一般我們需要利用堿性磷酸酶處理線性載體以達到所需效果。5 分離純化核酸的總原則：保證核酸一級結構的完整性排除其它分子的污染6 一般連接反應發生的折衷溫度為：12167 PCR反映特異性的決定因素是由人工合成的兩條引物決定8在基因克隆中用途廣泛限制性內切酶屬型限制性內切酶。簡答題：簡述DNA重組

29、技術的核心技術路線，并簡要寫出其技術要點。DNA重組是依賴于限制性核酸內切酶、DNA'連接酶和其他修飾酶的作用，分別對外源目的基因的片段和表達載體DNA進行切割修飾后，將外源基因片段與表達載體DNA巧妙的連接在一起，再轉入受體細胞，實現目的基因在受體細胞內的正確表達。在這一過程中，一般要考慮下列3個因素：1 實驗步驟簡單易行，連接效率高，易于重組子篩選2 重組DNA分子，應能被一定的限制性核酸內切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段3 外源基因必須在表達載體DNA的啟動子控制之下，并置于正確的閱讀框架之中，以便目的基因的高效表達。提示：引物設計的一般原則：引物長度應為1530個核苷

30、酸，Tm接近72較佳。引物Tm可按下列簡單公式計算： Tm=（C+G）×4+（A+T）×2 引物中堿基的分布應當是隨機的，避免出現一連串的單一堿基或產生二級結構。G+C堿基的含量在45%55%左右兩個引物在3端均必須與模板互補，5端可以不互補引物自身連續互補堿基小于4個引物之間連續互補堿基亦應小于4普通PCR與RAPD的區別？簡述PCR原理：rapd技術源于pcr但又不同于pcr，差別主要體現在隨機擴增引物上。首先隨機擴增引物是單個加入，而不是成對（正反向引物）加入，其次，隨機引物短，一般rapd技術采用的引物含10個堿基，由于隨機引物短，與常規pcr相比，rapd退貨溫度

31、較低，一般為35-45度。pcr原理：該技術是在模板DNA、引物、和四種脫氧核糖核酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3-OH末端，并以此為起點，沿模板5-3方向延伸，合成新的DNA互補鏈。（擴增某一基因時，首先要知道兩引物的DNA序列）簡述在基因克隆工作中獲得目的基因的方法有哪些？1、直接分離DNA。現成的基因儲存在受體菌上你用的時候提取出來就好了。2、構建基因組文庫，篩選目的基因

32、。3、構建cDNA文庫，篩選目的基因 。在真核生物成熟mRNA中已不存在間隔序列（已在拼接過程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA為模板，逆轉錄而成的cDNA可被大腸桿菌表達。因此，在基因工程中，cDNA文庫法是從真核生物細胞中分離目的基因的常用方法。4、PCR擴增目的基因片段。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷。5、人工合成較短的DNA。主要是通過DNA自動合成儀，通過固相亞磷酸酰胺法合成。6、差異顯示法。一個攜帶有氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因質粒

33、被僅在卡那霉素基因中有識別位點的EcoRI消化。消化物與酵母DNA連接后轉化對兩種抗生素都敏感的E.coli菌株，試問：利用那種抗生素抗性選擇接受質粒的細胞？怎樣區分接受了插入酵母DNA的質粒的克隆？利用氨芐青霉素抗生素。用兩種平板，你用接種環，從第一個平板上的菌落點一下，再在第二種平板上原位點一下，培養。 如果同一個菌落，只能在amp上長，而不能在雙抗上長，就可能是重組質粒。 如何利用T4DNA聚合酶進行雙鏈DNA的3末端連接？在沒有d NTP存在時，T4噬菌體DNA聚合酶主要表現為3到5外切酶活性，此時它從3-OH端降解DNA，形成3端凹陷的DNA；當加入d NTP后，其核算外切酶活性被抑

34、制而表現為聚合酶活性，于是催化核苷酸的聚合作用，將DNA末端填平。如果已知某一基因的EST序列，該如何進行該基因全長的克隆。將EST序列在EST庫中比對以延長該序列，然后再去基因庫比對，重復進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復以上過程，直到沒有更多的重疊EST檢出或者說重疊群序列不能繼續延伸，獲得全長的基因編碼序列，最后再根據全長的基因克隆。論述題到目前為止，在高等生物中根據性狀表現分離未知產物基因采用哪些途徑？請說明各種途徑的基本原理并各舉一例？ABDE ABCDE BD ACDE ABC CE ABCDE BE B C 基因工程：在分子水平上進行的遺傳操作，指將一種或多種生物

35、體的基因或基因組提取出來，或者人工合成基因，按照人們的愿望，進行嚴密的設計，經過體外加工重組，轉移到另一種生物體的細胞內，使之能在受體細胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術。基因工程的三大要素：供體（提供遺傳信息）、受體（轉化的宿主）和載體（供體到載體的運載工具）轉化：外源DNA進入宿主。轉染：真核細胞類似于轉化的過程。轉座：獲得新表型的重要手段。 基因工程的研究內容（DNA重組技術）：獲得目的基因：分離、測序、構建文庫構建載體：目的基因與載體的連接轉化篩選重組子擴增目的片段導入宿主表達，驗證功能。限制性內切酶：生物體內能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它可以將外來的DNA切斷的酶，

36、即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)。命名：EcoRI：E屬名、co種類、R株系、I編號。限制性內切酶的種類：型、型、型。（其中型對基因工程最有用。）限制性內切酶的識別序列：限制酶識別序列的長度:限制酶識別序列的長度一般為 4-8 個堿基，最常見的為 6 個堿基。限制酶識別序列的結構:限制酶識別的序列大多數為回文對稱結構，切割位點在 DNA 兩條鏈相對稱的位置。限制酶切割的位置:限制酶對 DNA 的切割位置大多數在內部，但也有在外部的。同裂酶：有些不同微生

37、物來源的酶，能識別相同的序列，切割方式相同或不同，其中識別位點與切割位點均相同的不同來源地酶稱為同裂酶。同尾酶：有一些限制性核酸內切酶，它們來源各異，識別序列也各不相同，但切割后產生相同的黏性末端，特稱之為同尾酶。酶切反映的條件：溫度：大多數酶的最適溫度為37緩沖液：穩定PH值，Mg+提供酶活性中心，維持酶的構象的穩定性反映時間：不低于1h終止反映：EDTA、加熱。影像酶切反映的因素：DNA的純度：解決方案：加大酶用量、擴大反應體系、延長時間星星活性（star activity）：在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。實際上星星活性是限制性內切酶的一

38、般性質，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。引起星星活性的因素有甘油濃度高、酶過量和某系有機溶液的存在。DNA結構：線性、環狀和超螺旋。粘性末端（cohesive end）：識別位點為回文對稱結構的序列經限制酶切割后，產生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端。平末端（Blunt end）：在回文對稱軸上同時切割 DNA 的兩條鏈，則產生平末端。DNA連接酶的連接方法：粘性末端的連接、平末端連接、加人工接頭。DNA連接酶：可催化DNA3-OH基和5-磷酸基間形成磷酸二酯鍵的酶。DNA連接酶的作用條件：3-OH基和5-磷酸基需能DNA連接酶的作用機理：DNA連接酶所連接的是DNA分子上相

39、鄰核苷酸之間的切口，即雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵造成的單鏈斷裂，它們分別具有一個3-OH和一個5-P基團；如果是缺少一個或幾個核苷酸的裂口所形成的單鏈斷裂，DNA連接酶是無法連接的。連接酶的反映條件：DNA末端的濃度反映溫度：折衷溫度：1216反映時間：48hATP濃度：10umol/L1umol/L。其它工具酶：DNA聚合酶、甲基化酶、核酶核酸。離心技術：是蛋白質、酶、核酸及細胞亞組分分離的最常用的方法之一，也是生化實驗室中常用的分離、純化或澄清的方法。離心原理：溶液中的固相顆粒做圓周運動時產生一個向外離心力，其定義為： F = m2r 式中： F 為離心力的

40、強度； m 為沉降顆粒的有效質量； 為離心轉子轉動的角速度，其單位為rad/s； r 為離心半徑(cm)，即轉子中心軸到沉降顆粒之間的距離。 很顯然，離心力隨著轉速和顆粒質量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。離心力通常以相對離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計算公式如下： Fcf = 1.119×105(h)2r×g離心機：分類：工業離心機、實驗離心機（制備型離心機、分析性離心機）轉頭：角式、蕩平式、垂直、區帶。離心管：塑料、不銹鋼制備型離心機的分離方法：差速沉降離心法：沉降系數差異較大。密度梯度區帶離心法：等速度沉降等

41、密度沉降：EB-Cscl密度密度梯度離心：EB（溴化乙錠）是嵌入劑，嵌入到DNA雙螺旋分子內，使DNA雙螺旋松解，導致浮力密度下降。最后用正丁醇將EB萃取出來。DNA結構：線性、環狀、超螺旋。線性DNA浮力密度下降最大。核酸的分離純化的總原則：保證核酸一級結構的完整性排除其它分子的污染核酸分離純化應達到的要求：核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機溶劑，或過高濃度的金屬離子排除其它生物大分子的污染排除其它核酸分子的污染。制備核酸過程中的注意事項：盡量簡化操作步驟，縮短操作時間減少化學因素對核酸的降解減少物理因素對核酸的降解防止核酸的生物降解。核酸的提取步驟：破碎細胞、提取和純化。細胞破碎：微生物

42、：用溶菌酶處理高等植物：液氮研磨，組織搗碎器動物：液氮，勻漿器提取：去垢劑（陰離子）作用：溶解膜蛋白及脂肪。溶解核糖體上的蛋白質。對DNase、RNase有抑制作用。 常用去垢劑：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉。 Tris-HCL：維持PH值。純化：要求：去除可能的污染。 蛋白質變性劑，常用的有：笨酸、氯仿、DEPC（膠碳酸二乙酯）、鹽酸胍。 DNase抑制劑：EDTA、檸檬酸鈉、去垢劑、蛋白質變性劑。 RNase抑制劑：操作時佩戴手套，期間及時更換。器皿處理，干熱18068h。試劑配制，滅菌的DEPC水或蛋白酶K水。RNase抑制劑的使用：DEPC、蛋白酶K核酸樣品的保存：4（15d）

43、、-20（半年）、-70（長期） 保存介質：ddH2O 雙蒸水TE：Tris-EDTA質粒DNA的提取方法：EB-Cscl密度梯度離心、堿裂解法、酸酚法、高濃度Nacl法沉淀DNA：乙醇（小分子）DNA水化膜被破壞。異丙醇（大分子）異丙醇易有殘留。遷移率：單位電場強度下的電泳速度。電泳時影像遷移率的因素：DNA分子大小：DNA分子量大，遷移率小DNA的分子構型：條件一致的情況下，超螺旋>線狀>開環狀凝膠的濃度：5g/L6g/L DNA分子量較大。凝膠濃度低，分離DNA質量范圍大，分辨率低。（分辨率：可分辨的DNA分子的范圍）電場強度：場強大，產熱大，易使DNA產生變形。場強小，精度

44、高，時間長對DNA有影響電泳緩沖液：（T：Tris E：EDTA）TAE：A為醋酸，克隆回收，保存時間長，較穩定。TBE：B為硼酸，緩沖能力比TEA大，但會產生沉淀，濃度不宜過大TPE：P為磷酸，長時間下會產生磷酸沉淀EB：可在電泳前（凝膠中加入會發生污染，利于檢測）或電泳后（對電泳影響小，但對檢測的影響大）加入。作用：提高紫外線吸收能力，對檢測有利，是嵌入劑，使DNA分子雙螺旋松解，對超螺旋的作用最大。 上樣緩沖液：10mmol/L EDTA300g/L Ficoll溴酸藍/二甲苯青DNA分子質量的標定：質粒DNA酶切、噬菌體、直接根據人工改造的分子質量梯度。檢測DNA條帶：紫外燈下進行檢測

45、。530nm（EB染色情況下）橙色熒光SYBRGreen染色，綠色熒光。銀染：自然光下，即可見光。聚丙烯酰胺凝膠特點：透明，對時間變化較穩定，只要acr純度高，則重復性較高，樣品不易擴散，上樣量少，檢測靈敏度高，分辨率高。分子雜交：標記的探針DNA變性后與變性后的靶DNA/RNA通過堿基互補配對結合，形成雜種分子的過程。分子雜交包括：DNA-DNA雜交（southern blotting）、DNA-RNA雜交（northern）、蛋白質雜交（western）。分子雜交的目的：是運用特異的探針鑒定復雜的靶DNA中間源的DNA片段。雙鏈Probe（探針）或DNA解鏈，取決于：鏈的長度：越長，需能量

46、多。堿基成分：GC含量高，較難變性化學環境：單價陽離子穩定雙鏈。探針：指一段目的基因或DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列。可以是整個基因，或是基因的一部分，是DNA，也可是RNA。制備特異性探針所需基本條件：被檢測基因結構清楚有明確的基因產物一直某一基因產物對表型的反映或缺少某一基因對表型的反映具備以上條件之一即可以制備特異性基因探針。特異性探針的來源：基因組探針：從已建立的基因組文庫中篩選和分離所需要的目的基因。CDNA prode：從已構建的CDNA文庫中篩查和分離目的基因探針寡核苷酸探針：根據已知基因序列，人工分成一受互補的DNA片段，一般長約1550個bp。多數探針的制備都通過分子

47、克隆的方法獲得。克隆（clone）：指用無性繁殖的方法獲得同一個體，細胞或分子的大量復制品。探針的標記：將探針標記上一種標識物以便雜交后檢測。常用的標記方法：缺口平移法：反映體系中DNA酶隨即在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA POL5-3外切酶活性，在缺口處按5-3平移隨即引物法：利用E.Coli DNA POL的klenow壓單位，分成含有標記核苷酸的DNA鏈。Klonou具有5-3 POL活性。DNA雜交常用的方法：DNA-DNA雜交（southern blot）：堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA通過電泳液的移動轉移膠中的DNA固定膠中的DNA預雜交、雜交結果檢測斑點雜交：鑒定核酸

48、序列的簡單方法。 步驟：提取T、細胞DNA；點樣品至膜、干燥、固定；探針DNA。 應用：混合樣品DNA鑒定基因缺失檢測基因表達分析膜上印跡雜交：核酸分子探針的標記轉膜預雜交雜交洗膜信號的檢測DNA-RNA分子雜交（northern blot）：應用特異性基因探針分析基因的轉錄水平。 步驟：提取T、細胞總RNA；提純分離mRNA；瓊脂糖凝膠電泳分離RNA；轉移至硝酸纖維素膜；雜交檢測。 應用：檢測m RNA長度分子量大小m RNA的含量，即基因表達高低。蛋白質水平檢測（western blot）：研究基因表達與功能的一種方法。 步驟：提取T、細胞蛋白；聚丙酰胺凝膠電泳分類蛋白；轉移與硝酸纖維素膜

49、上；檢測結果。酶促標記法：切口平移法、隨即引物法、末端標記法、CDNA探針標記探針的純化：凝膠過濾法、乙醇沉淀法。影響雜交溫度的因素：G和C的含量甲酰胺含量錯賠率雜交體類型離子強度探針的復雜性。Polymease Chain Reaction(PCR)：是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法PCR原理：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。PCR反映體系：橫板分子、引物、聚合物、底物、緩沖液。引物設計的一般原則：引物長度應為1530個核苷酸，Tm接近72較佳。引物T

50、m可按下列簡單公式計算： Tm=（C+G）×4+（A+T）×2 引物中堿基的分布應當是隨機的，避免出現一連串的單一堿基或產生二級結構。G+C堿基的含量在45%55%左右兩個引物在3端均必須與模板互補，5端可以不互補引物自身連續互補堿基小于4個引物之間連續互補堿基亦應小于4dNTP：最大的問題：易降解。添加量不易太多。（要小包裝，可避免反復凍融對dNTP造成影像）。PCR反映條件：時間、溫度（溫度過高不利于引物與模板結合，溫度過低可大大增大引物與模板結合，但非特異性結合會增大）、循環次數。幾種PCR技術簡介：巢式PCR（nested PCR） touch down PCR（T

51、DPCR）：主要在優化退火溫度上real-time PCR（實時熒光定置PCR）：通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對結果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。 與普通PCR比較：實時在線監控減低反應得非特異性增加定量的精確性無需跑膠，結果分析更加快捷方便。 熒光標記物質：內摻式染料、序列特異性探針、引物特異性探針。Gienome Walking RACE分子標記技術：RELP：基本原理：五種的基因組DNA在限制性內切酶作用下，產生相當多的大小不等的片段，用放射性同位素標記的DNA做探針，把與被標記DNA相關的片段檢測出來，從而

52、構建出多態性圖譜。 優點：共顯形，非常穩定。 缺點：步驟多，周期長，費時，費錢。RAPD：隨機引物。 與常規PCR不同：引物長度短，退火溫度低。 通用性：實驗步驟少，省工、省力、速度快；不需知道基因組的任何分子信息。所用材料不需有世代性。AFLP：具有RFLP技術可靠性和PCR技術高效性。 原理：對基因組DNA進行酶切，連上雙鏈人工接頭，根據接頭的核苷酸序列和酶切位點設計引物，進行選擇性擴增。 特點：標記數目是無限的，呈典型的孟德爾方式遺傳。 缺點：專利技術，試劑盒價格貴。需具特殊防護措施，配套儀器設備。對DNA純度和內切酶的質量要求高。SSR（satellite DNA）：真核生物基因組酶切

53、、離心后，在玉帶附近會出現（AT）含量很高的簡單高度重復序列。 特點：微衛星DNA廣泛存在；微衛星DNA長度的多態性；微衛星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列。 原理：根據兩端序列的保守性，設計引物；進行PCR電泳分離染色。 應用：構建遺傳連鎖圖；種質支援鑒定；標記輔助育種。SNP：意義：治病SNP；疾病易感性SNP；具有診斷價值的SNP；疾病的SNP譜；人表型相關SNP；藥物作用與不良反應的SNP；藥物劑量SNP。 預計作用領域：j進行簡單和復雜疾病的遺傳連鎖分析及關聯分析。藥物基因組學法醫研究的罪犯身份的鑒別，親子鑒定。mRNA差異顯示技術（mRNA differetial display

54、）：是一種比較兩種或多種組織與組織之間基因表達差異的一種快速又可靠地方法。mRNA差異顯示技術原理：利用幾乎所有真核生物基因m RNA 3端有一個由30300個腺苷酸連成的多聚腺苷酸poly(A)尾巴的特點，合成一段帶有poly（T）的錨定引物，在逆轉錄酶的作用下，逆轉錄合成c DNA的第一鏈，而后加入隨機引物，以第一鏈為模板，進行PCR擴增，得到與m RNA相對應的“標簽”。然后PCR產物，變性的凝膠電泳顯示出所有的條帶。比較不同來源的c DNA帶，即可從中找出差異表達的條帶，將有差異的條帶所含有的基因進一步克隆。扣除雜交技術原理：是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發產生的c DNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。代表性差異分析技術：T減D反映后僅設置了72復性與延伸和95變性這兩個參數，共20個循環，從而使PCR產物的特異性及所得的探針純度均大為提高。三種雜合體：其中