1、分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景 班級(jí):2013級(jí)科碩6班 專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)姓名：姜世濤學(xué)號(hào)：2評(píng)分：導(dǎo)師簽名：分子生物學(xué)就是一門正在蓬勃發(fā)展的學(xué)科，新技術(shù)與應(yīng)用條件的不斷出現(xiàn)，為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了嶄新的時(shí)代并提供新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。分子生物學(xué)就是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為研究對(duì)象的學(xué)科，分子生物學(xué)技術(shù)即建立在核酸生 化基礎(chǔ)上的一類研究手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，同時(shí)也逐漸滲入數(shù)理科 學(xué)、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)與環(huán)境基因組學(xué)，研究?jī)?nèi)容也從DNA鑒定、擴(kuò)展到核酸及表達(dá)產(chǎn)物分析，技術(shù)不斷進(jìn)步為微生物檢驗(yàn)、月中瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、兔疫系統(tǒng)

2、疾病診斷提供重要依據(jù)與創(chuàng)新思路。在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基 因組學(xué)與環(huán)境基因組學(xué)蓬勃發(fā)展形勢(shì)下，分子診斷學(xué)技術(shù)將會(huì)取得突破性進(jìn)展。一.利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)樣品中核酸水平PCR1技術(shù)就是目前應(yīng)用較廣泛與成熟的臨床檢測(cè)方法，在法醫(yī)學(xué)、常見傳染 病、性病、寄生蟲與優(yōu)生優(yōu)育等領(lǐng)域有很高的應(yīng)用價(jià)值，尤其對(duì)肝炎病毒的早期診斷。1 .核酸分子雜交技術(shù)與基因芯片技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)也稱為基因探針技術(shù)，利用核酸的變性、復(fù)性與堿基互補(bǔ) 配對(duì)的原理，用已知的探針序列檢測(cè)樣本中就是否含有與之配對(duì)的核甘酸序列的分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景技術(shù)，就是印跡雜交、基因芯片等技術(shù)的基礎(chǔ)。目前基因芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用在月中

3、瘤基因表達(dá)譜差異研究、基因突變、基因測(cè)序、基因多態(tài)性分析、微生物篩選 鑒定、遺傳病產(chǎn)前診斷等方面。另外，現(xiàn)已獲得一些微生物的全基因序列，包括百 余種病毒，多種細(xì)菌（流感嗜血桿菌、產(chǎn)甲烷球菌及實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌等）與一 些酵母等。因此，將一種或多種病原微生物的全部或部分特異的保守序列集成在 一塊基因芯片上，可快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)出病原體，判斷侵入機(jī)體引起感染性疾病的 病原微生物（病毒、細(xì)菌或寄生蟲等）,從而對(duì)疾病作出診斷及鑒別診斷。2 .單核甘酸多態(tài)性分析（SNP）技術(shù)在人群中，個(gè)體基因的核甘酸序列存在差異性，稱為基因多態(tài)性。基因多態(tài)性 位點(diǎn)普遍存在于人的基因組中。如果在某個(gè)家庭中，某一致病基因與

4、特定的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可以用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標(biāo)記”來判斷家庭成 員或胎兒就是否攜帶有致病基因。目前認(rèn)為基因多態(tài)性就是個(gè)體的“身份證” ， 因此，基因多態(tài)性分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究、疾病連鎖分析與關(guān) 聯(lián)分析、疾病遺傳機(jī)制研究、月中瘤易感性研究、個(gè)性化用藥等諸多方面。單核昔 酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP） 分析技術(shù)為臨床檢測(cè)提供了 依據(jù)。SNP就是一種最常見的遺傳變異，在人類DNA多態(tài)性中,SNP約占90 %。 SNP就是指在基因組內(nèi)特定核甘酸位置上存在兩種不同的堿基。SNP與RFLP與STR等DNA標(biāo)記的主要不同在于

5、：它不再以“長度”的差異作為檢測(cè)手段，而 就是直接以序列的差異作為標(biāo)記。由于SNP就是二態(tài)的，易于自動(dòng)化批量檢測(cè)，易于計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，因此SNP檢測(cè)已廣泛地應(yīng)用于疾病的連鎖分析及關(guān)聯(lián)分 析、月中瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機(jī)制研究、個(gè)性化用藥研究等諸多領(lǐng)域。盡管SNP檢測(cè)在搜尋疾病基因方面有潛在的價(jià)值，但實(shí)際應(yīng)用中卻比人們想象的分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景要難得多，它需要花費(fèi)大量的時(shí)間進(jìn)行篩查，才能建立可靠的SNP分析圖譜。3 .microRNA 就是潛在的臨床診斷工具microRNAs(miRNAs)就是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs,其功能就是負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。在正常組織

6、中，miRNA轉(zhuǎn)錄，加工，結(jié)合到靶mRNA的 互補(bǔ)位點(diǎn)，通過抑制蛋白翻譯或就是改變 mRNA的穩(wěn)定性來抑制基因表達(dá)，維持 細(xì)胞生長、增殖、分化與死亡的正常進(jìn)行。不同 miRNA的分布有組織特異性， 因此在生理與病理?xiàng)l件下,miRNA的表達(dá)水平存在差異。成熟miRNA水平下降 可能就是由于miRNA生物合成的任何步驟的缺陷造成的，而這最終將導(dǎo)致不適 當(dāng)?shù)膍iRNA的靶蛋白的表達(dá)。最后的結(jié)果可能導(dǎo)致過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或者去分化，引起月中瘤的形成。最近的證據(jù)表明,miRNA突變或 者異位表達(dá)與多種人類癌癥相關(guān),miRNAs可以起到月中瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miR

7、NA中，大約50 %在基因組上定位于與月中瘤相關(guān)的脆性位 點(diǎn),這說明miRNAs在月中瘤發(fā)生過程中起了至關(guān)重要的作用。例如，mir-125b 1,線蟲lin - 4的同源基因，在染色體的1lq24脆性位點(diǎn)，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌病人中有缺失。若能確定多種月中瘤的miRNA表達(dá)譜特征庫，可以幫助診斷與治療月中瘤。由于 miRNAs可以從福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品 中分離出來，這使得miRNA表達(dá)譜特征庫建立成為可能。在此基礎(chǔ)上，用特定的 miRNAs表達(dá)差異圖譜，還可以用于預(yù)測(cè)病人的預(yù)后。另外從治療的角度,miRNA 表達(dá)譜可能為臨床上確定一個(gè)治療方案提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。二、蛋白

8、組學(xué)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用隨著生物體全基因組序列的解析，特別就是人類基因組序列草圖的完成，基因組學(xué)研究重點(diǎn)不可避免地從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，因此在上世紀(jì)90年分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景代中期，蛋白質(zhì)組學(xué)正研究成為基礎(chǔ)研究的重要支柱。蛋白組學(xué)就是在基因組學(xué) 之后又一組學(xué)，其發(fā)展之迅速，就是由于其能夠較為全面的考察蛋白層面的表達(dá)情 況，有利于獲得各種蛋白、多肽因子等信息 從而對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的就是在不同時(shí)間與空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示與說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律。與基因組相比蛋白質(zhì)組具有多樣性與可變性，雖然可以通過PCR、基因芯片等方法顯示生

9、物體的基因水平，但mRNA水平（包括 mRNA的種類與含量）并不能完全反映出蛋白質(zhì)的表達(dá)。由此可見，對(duì)一個(gè)機(jī)體而 言，基因的數(shù)目就是恒定的，而蛋白質(zhì)的種類與數(shù)目在生理與病理等不同條件下 ， 其表達(dá)也不同。若能獲得與某種疾病相關(guān)的蛋白水平的差異表達(dá)信息，將為臨床診斷、治療與預(yù)后提供有力依據(jù)。1 .蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)就是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一 種新的方法，它類似于基因芯片，就是將蛋白質(zhì)點(diǎn)到固相物質(zhì)上，然后與要檢測(cè)的 組織或細(xì)胞等進(jìn)行“雜交”，再通過自動(dòng)化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的”雜 交”就是指蛋白與蛋白之間如（抗體與抗原）在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別。 例如免疫芯片，就是一

10、種特殊的蛋白質(zhì)芯片，它在臨床分子診斷學(xué)有著明顯的發(fā)展 潛力，如月中瘤標(biāo)志的檢測(cè)、不同激素的測(cè)定，自身免疫性疾病中多種自身抗體或抗 原的檢測(cè)與超敏反應(yīng)中多種過敏原的篩查等。2 .液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用根據(jù)探針標(biāo)記與色譜分 析的原理，液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜主要由兩部分組成：磁珠部分即液體芯片部分 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀部分，用于獲取磁珠捕獲的蛋白質(zhì)質(zhì)量與含量 根據(jù)不同質(zhì)荷比的 蛋白質(zhì)在長度一定的真空管中飛行所需時(shí)間不同，被測(cè)定的蛋白質(zhì)以一系列波鋒的形式出現(xiàn)，并由此繪制出待測(cè)蛋白的質(zhì)譜圖，可發(fā)現(xiàn)各樣本間的蛋白質(zhì)表達(dá)與含分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景量的異同。液體芯片一飛行時(shí)間質(zhì)譜技

11、術(shù)利用磁珠俘獲月中瘤患者與健康對(duì)照體液中低 豐度特異蛋白或多肽，經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定與軟件分析，建立由兩者差異表達(dá)蛋白 或多肽組成的質(zhì)譜圖模型，用于預(yù)測(cè)未知樣品的歸屬。液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技 術(shù)主要用于從復(fù)雜體液如血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液、組織裂解液、細(xì)胞 培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。一方面，該技術(shù)能夠在生物液體中檢測(cè)指 示特異疾病的生物標(biāo)志物模式或生物標(biāo)志物譜，另一方面，該技術(shù)還可以鑒定單個(gè) 的生物標(biāo)志物候選物。在哈佛大學(xué)女子醫(yī)院、紐約斯隆 -凱特琳癌癥研究所、麻 省總醫(yī)院、貝勒醫(yī)學(xué)院等世界一流醫(yī)院與醫(yī)學(xué)研究所中，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸鱗癌、膀胱

12、癌等的早期診斷研究中。應(yīng)用該技術(shù)可協(xié)助診斷多種遺傳性代謝紊亂疾病，如各種氨基酸代謝失常 血癥，包括胱氨酸尿癥、瓜氨酸血癥、酪氨酸血癥、超苯丙氨酸血癥、精氨酸缺 乏癥、精氨琥珀酸尿癥與各種超甲硫氨酸血癥；短鏈核長鏈酰基輔酶 A脫氫酶缺 乏癥、異戊酸血癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、戊二酸血癥與其她各種有機(jī)酸 代謝失常疾病等。由于液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、快速、高通量、 靈敏度高、重復(fù)性好、分辨率高、檢測(cè)費(fèi)用低等特點(diǎn)，就是極具潛力的臨床月中瘤早期診斷工具。三.分子生物芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的完成，蛋白質(zhì)組計(jì)劃也已經(jīng)啟動(dòng)，基因序列數(shù) 據(jù)、蛋白序列與功能數(shù)據(jù)以

13、驚人的速度增長，而傳統(tǒng)的生物技術(shù)已經(jīng)不能滿足數(shù) 據(jù)倍增的要求，生命科學(xué)需要更快捷、更準(zhǔn)確的自動(dòng)化的生物技術(shù) ，而生物芯片在 這種情況下應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片(biochip)的概念雖源于計(jì)算機(jī)芯片但不同于計(jì)分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景算機(jī)芯片。狹義的生物芯片即微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核昔酸微 陣列、蛋白質(zhì)微陣列與小分子化合物微陣列。分析的基本單位就是在一定尺寸的 基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以點(diǎn)陣方式固定的一系列可尋找的識(shí)別分子 點(diǎn)陣中每一個(gè)點(diǎn)都可視為一個(gè)傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件 下與被檢測(cè)物進(jìn)行反應(yīng)，其結(jié)果利用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法、同位素法或電化學(xué)法

14、 顯示，再用掃描儀等儀器記錄，最后通過專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析。而廣義的生 物芯片就是指能對(duì)生物成分或生物分子進(jìn)行快速并行處理與分析的厘米見方的 固體薄型器件。生物芯片技術(shù)就是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī) 科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化 前景。經(jīng)過十多年發(fā)展，生物芯片技術(shù)已日臻完善，其應(yīng)用前景非常廣闊，因其具有 技術(shù)操作簡(jiǎn)易、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)目的分子數(shù)量多、高通量等特點(diǎn)，為“基因組計(jì)劃”時(shí)期基因功能的研究及科學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。 在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面，生物芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于病毒、細(xì)茵的檢測(cè)自身兔疫性 疾病的兔疫標(biāo)志物的

15、檢測(cè)。遺傳性疾病的檢測(cè)及月中瘤免疫標(biāo)志物的單一檢測(cè)及其 聯(lián)檢等方面。甘志遠(yuǎn)等3通過呼吸道斑點(diǎn)試驗(yàn)芯片法檢測(cè)呼吸道病毒抗體具有簡(jiǎn) 便快速、靈敏度與特異度高等優(yōu)點(diǎn)，就是臨床呼吸道病毒感染輔助診斷的有效方 法。值得推廣使用生物芯片具有操作簡(jiǎn)單、信息量大、節(jié)約試劑、減少誤差、診 斷快速的特點(diǎn)。在臨床診斷、科學(xué)研究與流行病學(xué)篩選中具有廣泛的應(yīng)用前景 它的的誕生也為人們提供了一種高通量、高效率的月中瘤學(xué)研究手段4-6。五.分子生物納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用1、納米科學(xué)技術(shù)就是20世紀(jì)末期剛剛誕生并正在崛起的新科技。通過直 接操縱與安排原子、分子創(chuàng)制新物質(zhì)，納米技術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合，促進(jìn)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研分子生物學(xué)在

16、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景究技術(shù)的完善、臨床診斷技術(shù)的革新及治療水平的提高70通過應(yīng)用納米技術(shù),在DNA檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。美國NASA Ames Center for Nanote Chnology 與中南大學(xué)衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作，將碳納米 管用于基因芯片 樣本需要量低于1000個(gè)NDA分子（傳統(tǒng)DNA檢測(cè)的樣本需要 量超過106個(gè)DNA分子）；需要的樣品量更少，可免去傳統(tǒng)的PcR擴(kuò)增步驟;結(jié)果 可靠、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)檢測(cè)自動(dòng)化 網(wǎng)。免疫分析加上磁性修飾已成 功地用于各種生物活性物質(zhì)與異生質(zhì)，如藥物、致癌物等的檢測(cè)。將特異性抗體 或抗原固定到納米磁球表

17、面，并以酶、放射性同位素 熒光染料或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為 基礎(chǔ)所產(chǎn)生的檢測(cè)與傳統(tǒng)微量滴定板技術(shù)相比具有簡(jiǎn)單、快速與靈敏的特點(diǎn)。霍美俊等9利用抗體偶聯(lián)的靶向磁性納米顆粒，同時(shí)具有可在病毒感染的細(xì)胞周圍 特異性富集與磁顆粒可在交變磁場(chǎng)下感應(yīng)升溫的雙重功能，將其作為磁感應(yīng)熱療的靶向介質(zhì)，有望研制出病毒感染性疾病磁感應(yīng)熱療的靶向介質(zhì)。為尋求一條快 速診斷EV71病毒感染白新方法，納米細(xì)胞分離技術(shù)的出現(xiàn)有助于解決生物醫(yī)學(xué) 中快速獲取細(xì)胞標(biāo)本的難題。應(yīng)用納米免疫磁珠檢測(cè)早期肺癌患者循環(huán)血液中的 月中瘤細(xì)胞，可監(jiān)測(cè)肺癌的轉(zhuǎn)移情況。2、6 .分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的問題疾病的發(fā)生就是由于人體受內(nèi)外因素的影響

18、，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞、組織或器官功 能紊亂，歸根到底就是核酸、蛋白等分子水平表達(dá)異常，由此可見，利用分子生物學(xué) 技術(shù)進(jìn)行臨床檢測(cè)就是協(xié)助臨床診斷與治療的必不可少的工具。但由于分子生物學(xué)技術(shù)不僅對(duì)臨床樣品的處理有較高要求，而且對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)水平也有要求， 這就涉及到從標(biāo)本收集、處理、檢測(cè)與分析等多個(gè)環(huán)節(jié)的系統(tǒng)化與規(guī)范化，為此,分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景我國已制定了臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南。利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)，在某些情況下可能存在一定困難，例如與 核酸相比，蛋白與多肽作為生物標(biāo)志的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是它們能夠很容易的在血液、 尿液與其她生物體液中找到。這些類型的樣品很容易獲得，并代表了含有豐富的 具有潛在信息的生物學(xué)信息分子。但從研究手段方面來說，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比核酸技術(shù)相對(duì)要復(fù)雜與困難，不僅氨基酸殘基數(shù)量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質(zhì)組 研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴(kuò)增目的片段，這樣對(duì)于豐度低