1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)目錄實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的培養(yǎng)2實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的提取3實(shí)驗(yàn)三紫外吸收法測(cè)定核酸濃度與純度4實(shí)驗(yàn)四水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA5實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定7實(shí)驗(yàn)六植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析8實(shí)驗(yàn)七聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA9實(shí)驗(yàn)八 RNA提取與純化11實(shí)驗(yàn)九 RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA13實(shí)驗(yàn)十質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)15實(shí)驗(yàn)十一感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化16實(shí)驗(yàn)十二克隆的篩選和快速鑒定18實(shí)驗(yàn)十三 DNA分析Southern雜交19一 基本操作實(shí)驗(yàn)一、細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)三、紫外吸收法測(cè)定核酸濃度與純度實(shí)驗(yàn)四、水平式瓊脂

2、糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)五、質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定實(shí)驗(yàn)六、植物基因組DNA提取、定量、酶切及電泳分析實(shí)驗(yàn)八、植物RNA提取及純化二、目的基因獲取實(shí)驗(yàn)七、聚合酶鏈 式反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA實(shí)驗(yàn)九、RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)十、質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十一、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)十二、克隆的篩選和快速鑒定實(shí)驗(yàn)十三、DNA分析Southern雜交實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的培養(yǎng)一、目的學(xué)習(xí)細(xì)菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。二、原理在基因工程實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌是不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。質(zhì)粒的保存、增殖和轉(zhuǎn)化；基因文庫(kù)的建立等都離不開細(xì)

3、菌。特別是常用的大腸桿菌。大腸桿菌是含有長(zhǎng)約3000kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)。當(dāng)大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其開始裂殖前，先進(jìn)入一個(gè)滯后期。然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以2030min復(fù)制一代的速度增殖。最后，當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長(zhǎng)的濃度時(shí)，菌體密度就達(dá)到一個(gè)比較恒定的值，這一時(shí)期叫做細(xì)菌生長(zhǎng)的飽和期。此時(shí)菌體密度可達(dá)到1×1092×109/mL。培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)室中最常用的是LB培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器（一） 實(shí)驗(yàn)材

4、料大腸桿菌（二） 試劑1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化鈉4、1mol/L NaOH5、瓊脂粉6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）（三）儀器1、培養(yǎng)皿2、帶帽試管3、涂布器4、滅菌鍋5、無菌操作臺(tái)（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）6、恒溫?fù)u床四、操作步驟（一）LB培養(yǎng)基的配制配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5gNaCl 10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH位至7.0。加入去離子水至總體積為1L，在15 lbfin2 (1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基。LB固體培

5、養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加瓊脂粉15g/L。（二）細(xì)菌的培養(yǎng)（）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、過夜培養(yǎng)取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個(gè)單菌落，接種于培養(yǎng)液中。蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37過夜培養(yǎng)。、大體積培養(yǎng)按1：100的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。于37，約300r/min劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)。（）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落采用無菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開始劃線。重新消毒接種環(huán)，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直

6、至覆蓋整個(gè)平板。于37培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單菌落。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取目的學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理原理質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，具有雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。它具有自主復(fù)制能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。目前，質(zhì)粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運(yùn)載工具載體。質(zhì)粒DNA的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)，從而將質(zhì)粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離。現(xiàn)在常用的方法有：堿裂解法、密度梯度離心法、煮沸裂解法等。實(shí)驗(yàn)室普遍采用的堿裂解法具有操作簡(jiǎn)便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。其主要原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒D

7、NA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔眩p螺旋也有部分解開，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)pH=4.8的乙酸鈉將其pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。試劑與器材一、 試劑1、LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至7.5。高壓滅菌20min。2、LB平板培養(yǎng)基：在

8、每1000mL LB液體培養(yǎng)基中中加入15g瓊脂，高壓滅菌20min。3、溶液：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。4、溶液：0.2mol/L NaOH，1% SDS。（必須現(xiàn)配）5、溶液：pH4.8的醋酸鉀溶液（5mo1/L乙酸鉀 60 mL，冰乙酸11.5 mL，水 28.5mL）。6、TE緩沖液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl，1mmol/ L EDTA。7、無水乙醇和70%乙醇。二、 器材1、 Eppendorf管、離心管架2、 10，100，1000ul微量加樣器3、 臺(tái)式高速離心機(jī)4、 搖床、

9、高壓滅菌鍋5、 大腸桿菌DH5（含質(zhì)粒）操作步驟一、 培養(yǎng)細(xì)菌將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB平板培養(yǎng)基上，37×24h，然后從平板上挑取單菌落，接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37×12h。二、 提取步驟1、將菌液移入1.5ml 離心管，8 000rpm×1min，倒置于濾紙上，徹底除去殘液。2、加入100 ul預(yù)冷的溶液，用渦旋震蕩器充分懸浮菌體。3、加入4 ul RNase ，室溫×2 min。4、加入200 ul溶液，快速顛倒，溫和混勻，冰浴5min。此時(shí)溶液應(yīng)非常粘稠。5、加入150 ul預(yù)冷的溶液，溫和混勻（此時(shí)應(yīng)有可見沉淀），冰浴5 min。6、1

10、2 000rpm×5min。轉(zhuǎn)移上清液至另一1.5ml離心管中。7、上清液加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，-20×20min。8、12 000rpm×5min，徹底除去殘液。9、加入500ul 70% 乙醇洗DNA沉淀。3 000rpm×1min，徹底揮發(fā)除去乙醇。10、加入40ul ddH2O溶解DNA，待用。（或用TE溶解，-20保存）。實(shí)驗(yàn)三 紫外吸收法測(cè)定核酸濃度與純度一、目的學(xué)習(xí)測(cè)定DNA或RNA的濃度與純度。二、原理核酸分子中的堿基集團(tuán)含有共軛雙鍵，它們對(duì)紫外光有強(qiáng)烈的吸收。核酸的最大吸收波長(zhǎng)在260 nm，吸收低峰在230 nm。可以利用

11、核酸的這一特性對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定。在波長(zhǎng)260 nm下，A260=1時(shí)，雙鏈DNA的含量為50 µg/ml，單鏈DNA為 33 µg/ml ，RNA為 40 µg/ml，寡聚核苷酸為 2030 µg/ml。測(cè)出核酸溶液在A260的值，即可得出濃度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，純得DNA A260/A280=1.8,純的 RNA A260/A280=2.0.若樣品中含有蛋白或其它雜質(zhì)會(huì)使其比值下降。三、試劑與儀器（一）試劑 TE緩沖溶液（二）儀器 紫外分光光度計(jì)四、操作步驟1、 開機(jī)，選擇波長(zhǎng)開機(jī)前應(yīng)先檢查光路中有無障礙物。然后開啟電源開關(guān)預(yù)熱20左右。并調(diào)節(jié)波長(zhǎng)在260

12、 nm下。2、選擇A檔，調(diào)零面表上有4個(gè)可供選擇的模式，本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定A值，因此選擇A模式。待測(cè)核酸為水或TE溶液，選擇水或TE做空白對(duì)照進(jìn)行調(diào)零。3、測(cè)定樣品將待測(cè)樣品做適當(dāng)稀釋，用儀器配套的石英比色杯，以水或TE為對(duì)照的條件下測(cè)定，讀取并記錄樣品A260的值。4、 計(jì)算樣品的濃度雙鏈DNA濃度=50µg/ml×A260×稀釋倍數(shù)單鏈DNA濃度=33µg/ml×A260×稀釋倍數(shù)單鏈RAN濃度=40µg/ml×A260×稀釋倍數(shù)核酸總量=樣品濃度×樣品體積（ml）實(shí)驗(yàn)四 水平式瓊脂糖凝膠電泳法

13、檢測(cè)DNA目的學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA的純度，DNA的構(gòu)型，含量以及分子量的大小。原理水平式瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，它簡(jiǎn)單易行，只需少量的DNA就能檢測(cè)，其分辨效果比分光光度計(jì)法與溴化乙啶-標(biāo)準(zhǔn)濃度DNA比較法更高，更直接，檢測(cè)DNA范圍更廣，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物；使得DAN發(fā)射的熒光，增強(qiáng)幾十倍。而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對(duì)照，就可比較出待測(cè)樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測(cè)，則可精確地測(cè)得樣品的濃度。電泳

14、后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照，只需510ng DNA ，就可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測(cè)到0.010.1ng的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比。質(zhì)粒DNA樣品用單一切點(diǎn)的酶酶切后與已知分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對(duì)照，觀察其遷移距離，就可以該樣品的分子量大小。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可鑒別分子量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。在抽提質(zhì)粒的過程中，由于各種因素的影響，使得超螺旋共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA（SC）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)（OS）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成線形分子（L）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情

15、況下，超螺旋遷移速度最快，其次為線形分子，最慢的為開環(huán)分子。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA，在瓊脂糖電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可以分析樣品的純度。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷。在電場(chǎng)中向著正極移動(dòng)，在用電泳法檢測(cè)DNA分子時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時(shí)適當(dāng)降低電泳時(shí)的電壓，也可以使分子篩效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)而提高分辨率。試劑與器材一、

16、 試劑1、 DNA樣品2、 TBE緩沖液（5×）：用時(shí)需稀釋10倍3、 點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。5、 瓊脂糖二、 器材1、 電泳儀系統(tǒng)2、 紫外燈3、 恒溫水浴箱操作步驟1 選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢測(cè)穩(wěn)壓電源與正負(fù)極的線路。2 選擇孔徑大小適宜的點(diǎn)樣梳，垂直架在電泳槽負(fù)極的一端，使得點(diǎn)樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為0.51.0mm。3 制備瓊脂糖凝膠：按照被分離的DAN分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一

17、般情況下可參考下表：瓊脂糖的含量（%）g/ml分離線狀DNA分子的有限范圍(kb)0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約40ml 凝膠液，置微波爐中或水浴加熱，至瓊脂糖融化均勻。4 將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至60左右時(shí)，在凝膠溶液中加EB（EB最終濃度為0.5µg/ml），搖勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入TBE緩沖液），然后小心地拔掉梳子保持點(diǎn)樣孔完整。注意：電極緩沖液要高出凝膠

18、面2-5。5 待測(cè)的DNA樣品中，加入1/5體積的點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心的進(jìn)行點(diǎn)樣，記錄樣品點(diǎn)樣順序和點(diǎn)樣量。6 開啟電源開關(guān)，最高電壓不超過5V/cm。7 電泳時(shí)間看實(shí)驗(yàn)的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各條區(qū)帶分開后電泳結(jié)束。一般20min3 h，取電泳凝膠塊直接拍照。實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定原理限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別雙鏈DNA特定位點(diǎn)，并產(chǎn)生特異的切割，形成粘性末端或平末端，這樣有利于DNA片段再連接。限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切點(diǎn)，酶切后就能產(chǎn)生多少個(gè)片段。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切點(diǎn)的數(shù)目；從片段遷移率的大小可以判斷

19、酶切片段大小的差別。用已知相對(duì)分子量DNA為對(duì)照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測(cè)出分子形狀相同的未知DNA的相對(duì)分子質(zhì)量。質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)有三種構(gòu)象：共價(jià)閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成開環(huán)DNA；線狀DNA，雙鏈DNA斷開成線狀。電泳時(shí)，三種構(gòu)象中，共價(jià)閉環(huán)DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環(huán)DNA。因此在本實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒在電泳中呈現(xiàn)23條區(qū)帶。試劑與器材一、試劑1、EcoR酶2、DNA3、TBE緩沖液（5×）：用時(shí)需稀釋10倍4、 點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%

20、溴酚藍(lán)，40%甘油5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。6、 瓊脂糖二、器材1、電泳儀系統(tǒng)2、紫外燈3、恒溫水浴箱操作步驟一、 質(zhì)粒DNA酶切管號(hào)質(zhì)粒DNA101010EcoR/ ul11酶切Buffer（10×）/ ul222ddH2O/ ul876RNA酶11、 按下表將各種試劑分別加入每個(gè)Eppendorf管中，要注意管號(hào)。2、 加樣后混勻，置于37水浴中，保溫2 h。然后每個(gè)管中迅速加入2 ul EDTA終止反應(yīng)。二、 瓊脂糖凝膠電泳1、 瓊脂糖凝膠的制備（1）稱0.4g瓊脂糖加40ml 0.5 X TBE緩沖液,加熱熔解。冷

21、卻至60加2ul EB，混勻。2、 膠板制備將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，然后倒入熔好的瓊脂糖，并在一端插好梳子。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽，垂直拔掉梳子。注意：電極緩沖液要高出凝膠面2-5。3、 加樣每個(gè)樣品中加入1/10體積Loading buffer（10×），混勻后小心地加入樣品槽中，要避免相互污染。4、 電泳觀察接通電源，電壓為80V×1h左右，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)下沿1-2處時(shí)，停止電泳。5、 觀察及照相將膠板拿出，用自來水小心地沖洗一下。在紫外燈下觀察結(jié)果，如果有條件也可用凝膠成像系統(tǒng)照相。實(shí)驗(yàn)六 植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析目的掌

22、握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項(xiàng)。大分子量DNA分子的酶切分析。原理十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)時(shí),從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。試劑與器材一、 試劑1 、DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g tris PH8.2 (一般不調(diào))2

23、、Nuclei lysis buffer: 500ml100ml 1M Tris PH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH203、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽) 500ml用時(shí)，將上述三種溶液按1：1：0.4 比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/l）,65預(yù)熱，既為抽提液。二、 器材操作步驟一、基因組DNA提取1、取0.15g左右小麥葉片，在液氮中迅速研磨后放入1.5ml離心管中，加入700ul抽體液（65預(yù)熱）混勻，65水浴裂解40-60 min，期間溫和混勻幾次，加4 ul RNase 室溫靜置2min。2裂解

24、好的DNA ，加入500ul 氯仿：異戊醇（24：1），緩慢混勻，4×11000rpm×10min。3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預(yù)冷異丙醇，緩慢混勻后再猛烈混勻，使DNA成團(tuán)，-20靜置30 min。4、將析出的DNA 離心，4×11 000rpm×10 min。5、去掉上清，將沉淀用500ul 70% 乙醇清洗一次，6、3000 rpm×1 min,徹底揮發(fā)除去乙醇，溶于40ul ddH2O。二、酶切及電泳分析管號(hào)基因組DNA/g11植物基因組DNA10101010EcoR/ ul1222EcoRBuffer（10&

25、#215;）2555Hind III / ul1222Hind IIIBuffer（10×）2555ddH2O/ ul2626131365RNA酶137反應(yīng)4h，迅速加入2 ul EDTA 中止反應(yīng)。0.8%瓊脂糖凝膠電泳（樣品全部點(diǎn)樣）。實(shí)驗(yàn)七 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA目的1、學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2、了解引物設(shè)計(jì)的一般要求。原理聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是體外酶促合成DNA片段的一種技術(shù)。利用PCR技術(shù)可在數(shù)小時(shí)之內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR進(jìn)行的基本條件：DNA模板（在R

26、T-PCR中模板是RNA）；引物；dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）Taq DNA聚合酶PCR循環(huán)由三個(gè)步驟組成：變性 使模板DNA解離成單鏈；退火 使引物與模板DNA所需擴(kuò)增序列結(jié)合；延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成與模板堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，通過30個(gè)左右循環(huán)后，目的片段的擴(kuò)增可達(dá)106倍。引物設(shè)計(jì)：要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確，特異，有效的對(duì)引物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下原則：引物長(zhǎng)度：1525個(gè)核苷酸；CG含量為40%60%；Tm值為55（Tm=4（C+G）+2（A+T）計(jì)算；引物與非特異配對(duì)位點(diǎn)的配對(duì)率小于70%；引物

27、自身配對(duì)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)小于3，兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)。由于影響引物的設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常常利用計(jì)算機(jī)來輔助設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大量得到目的DNA片段。試劑與器材一、 試劑1、 Taq DNA聚合酶2、 10×反應(yīng)緩沖液（含25mmol MgCl2）3、 dNTP4、 引物（P1、P2）5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。6、 點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油。二、 器材1、 PCR擴(kuò)增儀2、 電泳儀3、 臺(tái)式離心

28、機(jī)4、 紫外分析儀5、 恒溫水浴6、 凝膠成像系統(tǒng)操作步驟一、 PCR擴(kuò)增1、按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒DNA。試劑體積（ 50ul）ddH2O35ul10 x buffer5ul10×dNTP5ulPrimer P11ulPrimer P21ul模板2ulTaq 酶（2.5U） 1.0ul2、設(shè)置PCR程序：94 180s 94 45s 35 cycles: 55 45s72 60s 72 600s3、運(yùn)行PCR程序二、 PCR產(chǎn)物鑒定反應(yīng)結(jié)束后，取20ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。實(shí)驗(yàn)八 RNA提取與純化一、目的掌握RNA提取的基本技術(shù)，了

29、解RNA提取過程中的各種注意事項(xiàng)。二、原理RNA提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中難度較大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。RNA提取和DNA提取有類似的地方，因?yàn)樗鼈兌际呛怂幔季哂休^好的水溶性。提取RNA首先破碎細(xì)胞，然后用提取液將RNA溶出，反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，加入乙醇沉淀RNA，將RNA沉淀溶解備用。那么如何區(qū)分DNA和RNA分開？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進(jìn)行區(qū)分。另外，RNA的分子量一般比較小，而DNA分子很大且和蛋白結(jié)合成復(fù)合體，所以DNA更容易隨蛋白沉淀，而RNA具有較好的溶解性。RNA提取的

30、另一個(gè)關(guān)鍵問題就是如何抑制或去除環(huán)境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在180×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1的DEPC水37過夜浸泡，然后濕熱滅菌80烘干備用。配制溶液所需的水也要用DEPC處理過的水，而配置Tris相關(guān)的緩沖液時(shí)Tris會(huì)與DEPC發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)避免用DEPC處理。另外操作過程中應(yīng)戴手套。判斷RNA 的質(zhì)量主要有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，一是純度，二是完整性（是否被降解）。RNA的純度可以通過分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定的A260A280值來判斷。RNA的完整性主要通過電泳分析來闡明，未降解的總RNA電泳時(shí)在凝膠中會(huì)出現(xiàn)18S和28SrRNA對(duì)應(yīng)的條帶（如果有DNA污染則在RNA后會(huì)發(fā)

31、現(xiàn)基因組DNA對(duì)應(yīng)的條帶）。RNA電泳系統(tǒng)也要嚴(yán)格對(duì)RNA酶進(jìn)行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，則用盡量減少電泳時(shí)間。三、試劑與器材（一）試劑1、暗培養(yǎng)7天的小麥苗，用前光照誘導(dǎo)3 h2、DEPC3、DEPC處理的ddH2O4、RNA提取液：（每1000毫升中含有） Tris 6.06 克 (最終濃度為50 mM ) LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O 9.06克) (最終濃度為150 mM ) EDTA（0.5 M） 10 毫升 (最終濃度為5 mM ) SDS 50 克 (最終濃度為5 % )5、8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC處理的ddH2

32、O6、 水飽和酚7、 氯仿8、 0.5M NaCl9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。10、點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油。三、 器材1、 分光光度計(jì)2、 電泳儀3、 臺(tái)式離心機(jī)4、 手提式紫外監(jiān)測(cè)儀5、 恒溫水浴6、 凝膠成像系統(tǒng)四、操作步驟1、取植物葉片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分裝，小量提取試劑量可減至110)2、液氮揮發(fā)完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的離心管中，迅速反復(fù)倒置混勻，直至看不見任何團(tuán)狀物為止。3、立即加入10毫升的等體積（酸性）酚/氯仿

33、，劇烈（！）反復(fù)倒置混勻5至10min（如在震蕩器上震蕩，要確保混勻而不能僅僅是振動(dòng)！）。4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。5、重復(fù)步驟3和4，三次左右（注意觀察界面上白色物質(zhì)）。6、取上清，加入等體積的氯仿，反復(fù)倒置混勻2-5min。7、13000g×5min。8、取上清，加入1/3體積8 M 的 LiCl （即8 M LiCl應(yīng)占最后體積的25%）， 沉淀RNA，4過夜。9、離心13000g× 10 min。10、棄上清,保留沉淀（此時(shí)應(yīng)把RNA沉淀轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%無水乙醇+30% 0.5

34、 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗滌沉淀數(shù)分鐘（和緩地反復(fù)倒置混勻），離心 （13000g× 2 min）。重復(fù)洗滌沉淀數(shù)次。11、用70%乙醇再洗滌2次沉淀，去掉鹽離子。12、用槍頭吸去殘留的液體，真空干燥2min。13、加入200ulDEPC 處理過的水溶解RNA。14、取用5ul電泳檢測(cè)RNA完整性, 用TEB 緩沖液, 200V×20-30min。15、取5 ul稀釋40倍測(cè)定RNA純度和濃度，A260 nm /A280 nm應(yīng)在 2.0 左右。16、將RNA 分裝,放在-70長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?輔助方案：試劑盒提取法（Trizol）（一）試劑： 1.Ttizol R

35、eagent 2.氯仿3.異丙醇4.70%無水乙醇5.DEPC（二）器材：1、 研缽2、 離心機(jī)（三）實(shí)驗(yàn)步驟1、 稱取小麥葉片50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。2、 加入1 ml Trizol Reagent，1530×5min。 3、 加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，1530×3min。4、 冷凍離心12000 rpm×15min。5、 將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，加0.5ml預(yù)冷異丙醇,混勻 ，-20放置20min。6、 冷凍離心12000 rpm×10min。7、 加入0.5ml 70% 乙醇洗

36、RNA沉淀，懸浮，7500rpm×2min，除去乙醇。8、 加入30 ul DEPC 處理過的ddH2O溶解RNA。實(shí)驗(yàn)九 RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA目的學(xué)習(xí)從細(xì)胞或組織的RNA中用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增目的基因的技術(shù)及操作。原理普通PCR方法可以以DNA為模板擴(kuò)增基因，但真核生物的基因組中通常分為可轉(zhuǎn)為mRNA的外顯子和不轉(zhuǎn)錄的成mRNA的內(nèi)含子，所以從染色體DNA用PCR方法擴(kuò)增出的基因是內(nèi)含子和外顯子相間排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表達(dá)。如果用人工的方法把內(nèi)含子去除，是極其煩瑣費(fèi)力的事。逆轉(zhuǎn)錄PCR利用逆轉(zhuǎn)錄病毒依賴于RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄合成酶，在反義引物或olig

37、o（d T）的引導(dǎo)下合成mRNA互補(bǔ)的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的可編碼完整蛋白的基因。這一DNA的5，和3，端經(jīng)改造可直接用于基因工程的表達(dá)，因此逆轉(zhuǎn)錄PCR成為了目前獲取目的基因的一條重要途徑。試劑與器材一、 試劑1、 RNA模板2、 cDNA引物3、 反轉(zhuǎn)錄緩沖液4、 dNTP5、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶6、 RNA抑制劑（RNasin）7、 Taq酶8、 10×PCR緩沖溶液9、 引物（P1、P2）二、器材1、PCR擴(kuò)增儀2、電泳儀3、臺(tái)式離心機(jī)4、恒溫水浴5、紫外分析儀6、微量移液器操作步驟一、RN

38、A的反轉(zhuǎn)錄1、在小管中依次加入5 ul RNA 6 ul DEPC H2O 混合后,65×5 min(破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)). 2、 置于冰浴5 min.3、在管中依次加入: (反應(yīng)體系為20 ul) RT buffer ( 5×) 4 ul RNasin 0.5 ul dNTP ( 10mM) 2 ulOligo T17A（GC） （50-100 uM） 1 ulAMV反轉(zhuǎn)錄酶1 ul 置于 42× 1 h。4、70× 5 min（使酶失活，可省略）。5、加入100ul ddH2O(從總RNA開始制備)或1000 ulddH2O（從mRNA開始制備）。6、置于

39、-20保存?zhèn)溆?二、 PCR擴(kuò)增DNA在滅菌的0.5ml PCR管中，依次加入20l cDNA10l 10×PCR buffer5l dNTP2lRT引物I2l RT引物II1l Taq DNA聚合酶加ddH2O 補(bǔ)足50l ，混勻。PCR程序：94 3 min 9530s 35 cycles: 55 60s72 90s 72 10 min三、PCR產(chǎn)物的鑒定取20ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。實(shí)驗(yàn)十 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)一、目的掌握DNA體外連接的基本技能，了解連接反應(yīng)的注意事項(xiàng)。二、原理DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實(shí)現(xiàn)的。DNA連接酶催化具

40、有平末端或互補(bǔ)粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3,5磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應(yīng)，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對(duì)粘性末端的連接效率要遠(yuǎn)高于對(duì)平末端的連接效率。在基因基因工程實(shí)驗(yàn)中，最常用的來源于T4噬菌體的T4DNA連接酶。對(duì)于平末端或互補(bǔ)的粘性末端可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。一個(gè)片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個(gè)片段都是粘性末端但不配對(duì)，則需要通過各種方式使其可一匹配或通過平末端進(jìn)行連接。通常采用末端補(bǔ)平、加同聚物尾、加接頭等方式是目的片段之間能夠匹配。進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，為了減少片段的自連，通常要進(jìn)行去磷酸化，去磷酸化可通過堿性磷酸酶完成。比如將目的片段和載體進(jìn)行時(shí)通常要將載

41、體去磷酸化，以減少載體的自連。同要進(jìn)行連接反應(yīng)也經(jīng)常對(duì)目的片段進(jìn)行磷酸化以增強(qiáng)目的片段的連接，在相鄰堿基間如果沒有磷酸在連接效率大幅下將，如果載體進(jìn)行了去磷酸化，目的片段可進(jìn)行磷酸化，以增強(qiáng)目的片段和載體的連接。在連接反應(yīng)中，目的DNA片段和載體的比例是一個(gè)關(guān)鍵問題，對(duì)于長(zhǎng)度為1kb的片段和3kb的載體而言，通常目的片段和載體的比例設(shè)為2：1或3：1，如果目的片段越長(zhǎng)該比例應(yīng)再升高，因?yàn)橹饕紤]的是載體和目的片段之間的分子數(shù)的比例。反應(yīng)體系中核酸的濃度也是一個(gè)重要問題，通常反應(yīng)體系中反應(yīng)物濃度應(yīng)保持在25-100 ng / l。連接反應(yīng)和其它酶不同，需要在較低的溫度下進(jìn)行，通常在1216過夜，

42、也可在4過夜連接，如果是平末端連接，可適當(dāng)提高連接溫度。除上述因素外，DNA樣品的純度、鹽濃度等會(huì)影響連接效率。三、試劑與器材（一）試劑1、目標(biāo)DNA片段（實(shí)驗(yàn)九RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）2、載體（pGEMT-easy）3、2 × ligation 緩沖液4、T4 DNA連接酶5、ddH2O（二）器材1、臺(tái)式離心機(jī)2、恒溫水浴3、微量移液器四、操作步驟1、取一個(gè)1.5ml離心管依次加入下列試劑:2 × buffer： 5lpGEMT-easy： 0.5l目的片段： 2.5lT4連接酶： 1lddH2O 1l2、 2000 rpm 離心30S，使反應(yīng)體系充分混合。3、4過夜連接。

43、實(shí)驗(yàn)十一 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化目的掌握感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化的基本方法。原理受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法, 化學(xué)試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。試劑與器材一、 試劑1、0.1mol/L CaCl2取20ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。2、LB液體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）3、LB固體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）4、氨芐青霉素（100mg/mL）二、 器材1、 冷凍離心機(jī)2、 平衡天平3、 無菌操作臺(tái)4、 微量移液器操作步驟一. 感受態(tài)細(xì)胞的制備(0.1M CaCl2方法)1、 從LB固體平板挑單克隆于

44、5ml LB液體培養(yǎng)基中(不加抗生素)，37×200rpm×12-16h，可過夜培養(yǎng)。2、 將活化菌體按15接種到LB中，擴(kuò)大培養(yǎng)37×200rpm×2h，至OD600約為0.4。3、 取培養(yǎng)好的菌液1.5 ml于一離心管中，4 離心8 000rpm×1 min。 4、 棄上清，加500 ul0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)洗菌體，4冷凍離心8000rpm×1 min。5、 徹底除去殘液, 加200 ul0.1M CaCl2(滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體。6、 冰浴靜置 30 min ，4冷凍離心8000rpm×1 min。7、

45、棄上清，加100 ul0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態(tài)細(xì)胞。附注：、 整個(gè)過程注意無菌操作和保持低溫。、 培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵。、 如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡(jiǎn)單深凍保存的感受態(tài)細(xì)胞。、 LB液體培養(yǎng)基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養(yǎng)基，檢查菌體是否污染。、 D600值指細(xì)胞密度，用于判斷培養(yǎng)物是否處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。OD600值在0.4 - 0.5時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)在20min內(nèi)加倍。二、質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化1、將連接產(chǎn)物加入100 ul制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30min。2、42熱激90S。3、迅速冰浴3min

46、。4、加入300 ul LB液體培養(yǎng)基，37輕搖培養(yǎng)45min。5、加入30 ul X-gal和6 ul IPTG,混勻。6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基中。7、37倒置，避光培養(yǎng)16-20h。8、藍(lán)白斑篩選，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。實(shí)驗(yàn)十二克隆的篩選和快速鑒定目的掌握快速細(xì)胞破碎法測(cè)定大小不等的眾多的質(zhì)粒DNA；和菌落PCR快速鑒定克隆。原理在這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法中，只需配制一種細(xì)胞緩沖液（它可以在室溫下保存，長(zhǎng)期使用）。利用破碎細(xì)胞緩沖液中的陰離子去污劑-SDS在37溶解膜蛋白，使細(xì)胞破裂，并解聚核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使得蛋白質(zhì)沉淀。利用E

47、DTA螯合金屬離子，防止破碎細(xì)胞的脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解。然后高速離心，去除細(xì)胞碎片核大部分的染色體DNA和RNA蛋白，將含有質(zhì)粒DNA的上清夜直接進(jìn)行點(diǎn)樣電泳和分離。在瓊脂糖凝膠上分離開的個(gè)組分中，有染色體DNA，不同大小的質(zhì)粒DNA和RNA，它們都可以經(jīng)肉眼觀察或拍照顯示。或者用設(shè)計(jì)好的引物，做菌落PCR快速鑒定克隆。試劑與器材一、 試劑1、 破碎細(xì)胞緩沖液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)1% SDS2mmol/L EDTA400mmol/L蔗糖0.01%溴酚藍(lán)配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10毫升 20% SDS 10毫升 250mmo

48、l/L EDTA 1.6毫升 蔗糖 27.2克 1.2%溴酚藍(lán) 1.67毫升 加ddH2O至200毫升2、 10mg/ml 溴乙啶3、 TBE電泳緩沖液（5×）4、 Taq DNA聚合酶5、 10×反應(yīng)緩沖液（含25mmol MgCl2）6、 dNTP7、 點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油。二、 器材1、 電泳儀2、 1.5ml 離心管3、 Tip 4、 培養(yǎng)皿5、PCR擴(kuò)增儀7、 臺(tái)式離心機(jī)8、 紫外分析儀9、 恒溫水浴操作步驟一、快速細(xì)胞破碎法測(cè)定1、 取1.5ml離心管編號(hào)碼，每管加入50ul破碎細(xì)胞緩沖液。2、

49、 取一培養(yǎng)皿在底部標(biāo)記如圖所示1 2 34 5 67 8 910 11 123、 待轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落長(zhǎng)到2mm時(shí)4、 用牙簽挑取單克隆將菌落點(diǎn)在作好標(biāo)記的方格內(nèi)，然后將牙簽加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)管中（培養(yǎng)管中含5ml LB液體培養(yǎng)基）。5、 培養(yǎng)皿37×6 h后4保存。培養(yǎng)管37×12 h左右。6、 用培養(yǎng)管中的菌液提取質(zhì)粒。7、 酶切電泳檢查質(zhì)粒。二、菌落PCR快速鑒定法1、直接用牙簽或接種針挑取少許菌體加入25ul或50ul PCR反應(yīng)體系中。2、用通用引物或特異引物進(jìn)行PCR，根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無和大小來判斷插入片段的有無、大小及方向（反應(yīng)體系參照前面實(shí)驗(yàn)）。試劑體積（ 50ul

50、）ddH2O37ul10 x buffer5ul10×dNTP5ulPrimer P11ulPrimer P21ul模板1個(gè)菌落Taq 酶1ul實(shí)驗(yàn)十三 DNA分析Southern雜交目的學(xué)習(xí)Southern雜交的原理及操作方法。原理（一）所謂DNA探針，實(shí)際上是一段已知序列的基因片段，應(yīng)用這一基因片段即可與待測(cè)樣品雜交。如果靶基因和探針的核苷酸序列互補(bǔ)，就可按堿基配對(duì)原則進(jìn)行核酸分子雜交，從而達(dá)到檢測(cè)樣品基因的目的。在隨機(jī)引物法標(biāo)記的反應(yīng)液中，有隨機(jī)合成的六聚核苷酸作為引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作為合成底物，以單鏈DNA作為模板，在Klen

51、ow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA鏈。以地高辛標(biāo)記的探針與靶基因DNA鏈雜交后，再通過免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。通過酶標(biāo)記地高辛抗體檢測(cè)，可以肯定雜交反應(yīng)存在。免疫檢驗(yàn)一般用堿性磷酸酶系統(tǒng)，BClP/NBT顯色。敏感性很高。可用于膜上雜交和原位雜交。（二）核酸探針膜上雜交原理1、雜交總原則脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵縮合成長(zhǎng)鏈構(gòu)成DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)。兩條堿基互補(bǔ)的多核苷酸鏈按堿基配對(duì)原則形成雙螺旋，構(gòu)成DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。某些條件（如酸堿,有機(jī)溶劑，加熱）可使輕鍵斷裂，DNA雙鏈打開成單鏈重新結(jié)合。所謂雜交，是具有一定互補(bǔ)序列的核酸單鏈，DNA單鏈仍然可與序列同源的單鏈按堿基互補(bǔ)的原則結(jié)合成異源性雙鏈的過程

52、。2、雜交膜的選擇雜交膜可以選擇硝酸纖維素和尼龍膜。硝酸纖維素膜的優(yōu)點(diǎn)在于本底較低，但只能用于顯色性檢測(cè)，且不能用于重復(fù)雜交。尼龍膜分為帶正電的膜和不帶電的膜兩種。帶正電的膜對(duì)核酸結(jié)合力強(qiáng)，敏感性也高。不帶電的結(jié)合力低。敏感性差。尼龍膜的優(yōu)點(diǎn)在于雜交用過的膜，用洗脫液（0.1xSSC,0.1%SDS）煮沸5-10min后去探針，可用于新的探針雜交。如果對(duì)雜交結(jié)果不滿意，如背景太高或顯色不強(qiáng)，也可洗去探針之后重新雜交。3、預(yù)雜交和雜交液預(yù)雜交和雜交都使用相同緩沖液，不同的僅是預(yù)雜交液中不含探針。下面是幾種基本的雜交液配方：（1）Standard buffer: 5Xssc,0.1%(w/v) N

53、-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%Blocking Reagent.（2）Standard buffer+50% formamide:50% formamide(deionized),5Xssc,0.1%(W/V)N-lauroylsarcosine.0.02% (w/v)SDS,2%Blocking Reagent.（3）High SDS buffer(church buffer): 7%SDS,50% formamide(deionized),5Xssc, 2% Blocking Reagent,50MmSodium phosphate,0.1% N-La

54、uroylsarcosine.4、Southern BlottingDNA片段經(jīng)電泳分離后按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。1975年Southern發(fā)明了利用濃鹽溶液的推動(dòng)作用將變性的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的方法，解決了原位轉(zhuǎn)移的問題。雖然其原理和操縱均很簡(jiǎn)單，卻是基因分析中必不可少的手段，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。Southern印跡雜交包括兩個(gè)步驟：（1）把電泳分級(jí)的DNA轉(zhuǎn)移到固定支持膜上。(2) 與標(biāo)記的DNA探針雜交。操作步驟一、探針的標(biāo)記1、用滅菌去離子蒸餾水稀釋1gDNA至總體積16l.。2、DNA熱變性：把DNA置于沸水中水浴10min。然后迅速插入碎冰中3min以上。3、加4l DIG Random Labeling Mix(高效)，混勻后再離心2000rmp×5min。4、置于37反應(yīng)至少2 h 。時(shí)間越長(zhǎng),標(biāo)記探針的產(chǎn)量越高。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至20 h可明