1、Electrophoresis Theory ,Methods and Aplications第十八第十八 電泳技術電泳技術電泳的概念電泳的概念 電泳是指荷電的膠體顆電泳是指荷電的膠體顆粒在電場中的移動。粒在電場中的移動。 電泳技術的高度特異性，電泳技術的高度特異性，使混合物可以進行電泳使混合物可以進行電泳分析。甚至結晶純化的分析。甚至結晶純化的樣品也可在電泳分析中樣品也可在電泳分析中分出兩條帶或更多的電分出兩條帶或更多的電泳帶。泳帶。 電泳方法的溫和性，對電泳方法的溫和性，對不穩定的生物大分子的不穩定的生物大分子的分離純化有時比其它分分離純化有時比其它分離技術如沉淀法、離心、離技術如沉淀法、

2、離心、層析等更為方便，可靠，層析等更為方便，可靠，甚至可作為具有一定規甚至可作為具有一定規模的制備方法模的制備方法.第一節 基本原理 生物大分子如蛋白質、核酸、生物大分子如蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介中，它們的凈電荷取決于介質的質的 H H濃度或與其它大分濃度或與其它大分子的相互作用。在電場中，子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于它們帶電遷移的方向取決于它們帶電的符號，這種遷移現象即稱的符號，這種遷移現象即稱為電泳。為電泳。影響電泳速度的相關因素FE q V=1.1. 帶電顆粒在電

3、場中泳動的速度和帶電顆粒帶電顆粒在電場中泳動的速度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，與顆粒的半徑和介質的凈電荷量成正比，與顆粒的半徑和介質粘度成反比。粘度成反比。2.2. 電場強度電場強度 E E 愈高，帶電顆粒的泳動速度愈高，帶電顆粒的泳動速度愈快，反之亦然。愈快，反之亦然。3.3. 溶液的溶液的 PH PH 偏離分子的等電點愈遠，觧離偏離分子的等電點愈遠，觧離度愈大，凈電荷愈多，泳動速度越快。離度愈大，凈電荷愈多，泳動速度越快。離子強度加大，電流加大，泳動速度加快。子強度加大，電流加大，泳動速度加快。f E q -SO4-SO4-SO4-SO4COO-Na+Na+吸附的反離子吸附的反離子固定基團

4、5.焦耳熱：電場強度或電極緩沖液離子強度增高，電流強度也增加，焦耳熱：電場強度或電極緩沖液離子強度增高，電流強度也增加，不僅降低分辨率，即電泳譜帶的展寬和組分的熱混和；嚴重時甚至不僅降低分辨率，即電泳譜帶的展寬和組分的熱混和；嚴重時甚至燒斷或熔化支持介質。燒斷或熔化支持介質。6.6.篩孔：人為控制電泳介質的有效篩孔。根據要求調節、控制、基篩孔：人為控制電泳介質的有效篩孔。根據要求調節、控制、基質中交聯劑的濃度或篩孔的大小，影響顆粒移動的速度。質中交聯劑的濃度或篩孔的大小，影響顆粒移動的速度。4.電滲：支持物周圍的離子層在電場作用下移動。是支電滲：支持物周圍的離子層在電場作用下移動。是支持物本身

5、所帶的電荷吸附溶液中性質相反的離子，在持物本身所帶的電荷吸附溶液中性質相反的離子，在電場中移動的結果。其帶電愈高，電滲力愈大。電場中移動的結果。其帶電愈高，電滲力愈大。生物大分子遷移的方式生物大分子遷移的方式1. 分子的尺寸大小和形狀；分子的尺寸大小和形狀；2. 分子帶電荷的性質與量；分子帶電荷的性質與量；3. 分子的生物學與化學特性。分子的生物學與化學特性。電泳的基本分類電泳的基本分類1.移動界面電泳移動界面電泳 moving boundary electro.2.區帶電泳區帶電泳 zone electrophoresis3.穩態電泳穩態電泳 steady state electrophor

6、esis 界面移動電泳界面移動電泳: : 在界面移動在界面移動電泳儀的中間漏斗裝上待測電泳儀的中間漏斗裝上待測溶膠，溶膠，U U型管上端裝電極，底型管上端裝電極，底部兩個活塞的內徑與管徑相部兩個活塞的內徑與管徑相同。同。 實驗開始時，打開活塞，實驗開始時，打開活塞，使溶膠進入使溶膠進入U U型管，使兩壁液型管，使兩壁液面等高。接通電源，小心打面等高。接通電源，小心打開活塞，觀察液面開活塞，觀察液面 的變化。的變化。根據通電時間和液面升高或根據通電時間和液面升高或下降的刻度，計算電泳速度。下降的刻度，計算電泳速度。若是無色溶膠，用紫外吸收若是無色溶膠，用紫外吸收或其它光學方法讀出液面的或其它光學

7、方法讀出液面的變化，變化， 區帶電泳區帶電泳: : 區帶電泳是將惰性的固區帶電泳是將惰性的固體或凝膠作支持物，在其上面進行體或凝膠作支持物，在其上面進行電泳，而將電泳速度不同的各組成電泳，而將電泳速度不同的各組成分離。區帶電泳實驗簡便易行，分分離。區帶電泳實驗簡便易行，分離效率高，樣品用量少，是分析和離效率高，樣品用量少，是分析和分離蛋白質的基本方法。分離蛋白質的基本方法。 用濾紙用濾紙作為載體的稱為紙上電泳作為載體的稱為紙上電泳, ,聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳, ,瓊脂糖凝膠電泳等瓊脂糖凝膠電泳等. .各組分即以不同速度沿載體運動，各組分即以不同速度沿載體運動，經一經一 段時間后，

8、形成距起點不同段時間后，形成距起點不同距離的區帶，區帶等于樣品中的組距離的區帶，區帶等于樣品中的組分數。再用適當方法，進行分析。分數。再用適當方法，進行分析。 第二節第二節 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)一一. .原理原理 以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法。 由于其分辨率高，不僅能分離含有各種大分子混由于其分辨率高，不僅能分離含有各種大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如電荷、合物，而且可以研究生物大分子的特性；如電荷、分子量、等電點及分子構型。分子量、等電點及分

9、子構型。 聚丙烯酰胺凝膠電泳的三個優點；聚丙烯酰胺凝膠電泳的三個優點；A A：可以在天然狀態分離生物大分子；：可以在天然狀態分離生物大分子；B:B:可以分析蛋白質與別的生物分子的混合物；可以分析蛋白質與別的生物分子的混合物；C:C:電泳分離后仍然保持生物活性。電泳分離后仍然保持生物活性。+蛋白質分子在常規聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素蛋白質分子在常規聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素蛋白質的電荷量起主要作用蛋白質的電荷量起主要作用蛋白質的分子大小起主要作用蛋白質的分子大小起主要作用蛋白質分子的構形起主要作用蛋白質分子的構形起主要作用1.聚丙烯酰胺凝膠的合成聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺丙稀酰胺N,N

10、-N,N-甲基雙丙稀甲基雙丙稀酰胺酰胺聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠催化劑催化劑聚合反應聚合反應聚丙烯酰胺凝膠的三維網狀結構聚丙烯酰胺凝膠的三維網狀結構烯溶液烯溶液濃溶液濃溶液 交聯劑交聯劑 凝膠凝膠 結點結點T= X100%a+bmC= x100ba+bC=6.5-0.3T2.2.聚丙烯酰胺的聚合及影響因素聚丙烯酰胺的聚合及影響因素 化學聚合：以過硫酸銨化學聚合：以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲級乙二胺為催化劑，以四甲級乙二胺（TEMED）為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發生為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發生連鎖反應形成網狀的聚合物。連鎖反應形成網狀的聚合物。 丙稀酰胺由過硫酸銨丙

11、稀酰胺由過硫酸銨（AP）在堿性條件下產生游離氧自由在堿性條件下產生游離氧自由基引發單體丙稀酰胺成為自由基狀態而成的。在堿性基引發單體丙稀酰胺成為自由基狀態而成的。在堿性 PH 時，時，反應速率迅速；而在酸性條件時，同樣濃度溶液，聚合速率反應速率迅速；而在酸性條件時，同樣濃度溶液，聚合速率減慢。減慢。 在低溫時聚合，凝膠會變得脆而渾濁，且重復性差，在在低溫時聚合，凝膠會變得脆而渾濁，且重復性差，在25 聚合的凝膠則較透明和有彈性。聚合的凝膠則較透明和有彈性。 分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合，分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合，O2使過硫酸銨使過硫酸銨（AP）分解。故在做膠后常要用水進行封閉；分解

12、。故在做膠后常要用水進行封閉； 金屬離子也干擾凝膠的化學聚合。金屬離子也干擾凝膠的化學聚合。光聚合：以核黃素為催化劑在少量的氧存在下光聚合：以核黃素為催化劑在少量的氧存在下, ,分解成無分解成無色的還原型，在少量的色的還原型，在少量的O2條件下，還原型的核黃素氧化條件下，還原型的核黃素氧化成有游離基的黃素環，聚合反應發生。成有游離基的黃素環，聚合反應發生。 用量少，不會對樣品有任何不良的干擾現象；故常用于用量少，不會對樣品有任何不良的干擾現象；故常用于樣品膠的聚合；樣品膠的聚合； 聚合的時間可以自由控制聚合的時間可以自由控制 缺點：光照的量不容易掌握，重現性不太好；缺點：光照的量不容易掌握，重

13、現性不太好； 光聚合適合大孔徑凝膠的聚合，化學聚合適合各種凝膠光聚合適合大孔徑凝膠的聚合，化學聚合適合各種凝膠的聚合。的聚合。核黃素B1 還原型 游離基 聚合反應光照光照O23.聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑和分子篩效應聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑和分子篩效應 凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質，能起到防止對流，凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質，能起到防止對流，把擴散減到最小，而且能影響大分子顆粒的移動過程。把擴散減到最小，而且能影響大分子顆粒的移動過程。 大分子在凝膠中的分離是受其電荷、尺寸、和形狀因素的影響大分子在凝膠中的分離是受其電荷、尺寸、和形狀因素的影響 凝膠的這種用于分離不同尺寸分

14、子的特性是由于它的尺寸篩分能凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力力（Size sieving capacity），故將此現象稱為分子篩效應，故將此現象稱為分子篩效應（Molecular sieving effect）. 有效孔徑取決于凝膠的總濃度有效孔徑取決于凝膠的總濃度 T，孔徑隨著孔徑隨著 T% 的增加而減的增加而減小小。 甲基雙丙稀酰胺的濃度為甲基雙丙稀酰胺的濃度為5%5%時，有效孔徑最小；時，有效孔徑最小；T= 5%時，甲時，甲基雙丙稀酰胺的濃度為基雙丙稀酰胺的濃度為5%時，孔徑為時，孔徑為20nm。 T T是凝膠溶質的總百分濃度，是凝膠溶質的總百分濃度，C C是

15、與總濃度相關的交聯百分濃度。是與總濃度相關的交聯百分濃度。故故T T是決定是決定C C，分離物的分子量的大小又決定了，分離物的分子量的大小又決定了T T的濃度。的濃度。 5 7 9 11 13 15 T%A B凝膠濃度凝膠濃度T對樣品遷移率的影響對樣品遷移率的影響例：混合蛋白質例：混合蛋白質A,BA,B，A A分子量較小，分子量較小，B B分子帶電荷較多，分子帶電荷較多，T T5 5時，電泳行為主要以電荷起作用，時，電泳行為主要以電荷起作用，B B 遷移速度快。當遷移速度快。當 T T 增加，分子篩效應增加，增加，分子篩效應增加，B B的遷移速度減慢；的遷移速度減慢；T T 9 9 時，時，A

16、 A，B B的遷移率相同，不能分開，的遷移率相同，不能分開，T T 再增加，凝膠孔徑更小，再增加，凝膠孔徑更小，A A分子比分子比B B分子小，表現較高的遷移率。并且說明電泳只獲分子小，表現較高的遷移率。并且說明電泳只獲得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。遷移率遷移率異常樣本異常樣本:快快Hb(HbH,HbJ) 慢慢Hb (HbG,HbI,HbE二二.儀器的進展儀器的進展 電泳槽是凝膠電泳的核心電泳槽是凝膠電泳的核心部分，所以變化主要是電部分，所以變化主要是電泳槽的變革。泳槽的變革。水平板狀水平板狀垂直的濾紙條垂直的濾紙條濾紙連接的濾紙連接的水平

17、凝膠水平凝膠園盤電泳槽園盤電泳槽垂直夾心板狀垂直夾心板狀三三. .不連續凝膠電泳（不連續凝膠電泳（discdisc）的分離原理）的分離原理(一一).原理原理不連續凝膠電泳系統具有與一般電泳的不連續凝膠電泳系統具有與一般電泳的 電荷效應電荷效應，還具有，還具有濃縮效應濃縮效應與與分子篩效應分子篩效應，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質與密度相近的但，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質一樣、電荷性質與密分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質一樣、電荷性質與密度有差別的分子可以分離；或電荷性質、分子量大小相近，但構型不同時度有差

18、別的分子可以分離；或電荷性質、分子量大小相近，但構型不同時亦可分離。亦可分離。 堿性不連續分離酸性樣品堿性不連續分離酸性樣品不連續凝膠電泳系統不連續凝膠電泳系統 酸性不連續分離堿性樣品酸性不連續分離堿性樣品 大多數蛋白質分子呈酸性或中性，適合用堿性系統進行電泳分離。大多數蛋白質分子呈酸性或中性，適合用堿性系統進行電泳分離。. .濃縮效應濃縮效應 1.凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑（烯）（烯） T T5 5，分離膠一般為小，分離膠一般為小孔徑（濃）孔徑（濃）T T7.57.5。樣品在較烯。樣品在較烯的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，便形成一道柵

19、欄，所有的樣品分子便形成一道柵欄，所有的樣品分子在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得到到濃縮濃縮，然后，再，然后，再依依據分子量的大據分子量的大小進行小進行篩分篩分電泳分離。電泳分離。 2.2.緩沖液的組成緩沖液的組成: :圖示。圖示。PHPH系統的系統的不連續，各種分子的不連續，各種分子的電荷電荷之間的差之間的差異進行分離。異進行分離。 3.3.緩沖體系的不連續，其中各組成緩沖體系的不連續，其中各組成的離子、反離子遷移快慢的差別是的離子、反離子遷移快慢的差別是影響樣品濃縮效應的重要因素。影響樣品濃縮效應的重要因素。 4.4.離子的遷移速率及濃度的不連續離子的遷移速率及

20、濃度的不連續又造成電場強度與電導率的變化。又造成電場強度與電導率的變化。分子篩效應分子篩效應 移動界面到達濃縮膠和分離移動界面到達濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的膠界面時，凝膠的PHPH變化明變化明顯，緩沖液中甘氨酸的觧離顯，緩沖液中甘氨酸的觧離迅速增加，直至迅速增加，直至50%50%觧離成觧離成 Gly-,-,其分子量小，遷移超其分子量小，遷移超過蛋白質分子。而喪失夾擊過蛋白質分子。而喪失夾擊的作用；同時，凝膠的孔徑的作用；同時，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質的遷移變小，降低了蛋白質的遷移率。故蛋白質分子在均一的率。故蛋白質分子在均一的電壓梯度和電壓梯度和PH PH 值中泳動，值中泳動，依其分子量

21、的大小而分開。依其分子量的大小而分開。電荷效應電荷效應 蛋白質所帶的凈電的蛋白質所帶的凈電的性質和電荷量與分子性質和電荷量與分子的遷移率的關系，在的遷移率的關系，在同一電場強度中，在同一電場強度中，在單位時間內各分子遷單位時間內各分子遷移的距離的差別而到移的距離的差別而到達分離。達分離。（二）（二）. .操作操作1.垂直柱狀，板狀的垂直柱狀，板狀的不連續凝膠電泳系不連續凝膠電泳系統的組成和配制；統的組成和配制；2.均一凝膠與梯度凝均一凝膠與梯度凝膠配制；膠配制；3.電極緩沖液系統；電極緩沖液系統；4.樣品的準備；樣品的準備；5.加樣要求加樣要求6.電泳電泳7.檢測檢測PH 8.3PH 6.7P

22、H 8.9PH 8.3 垂直柱狀，板狀的垂直柱狀，板狀的不連續凝膠電泳系不連續凝膠電泳系統的組成和配制統的組成和配制均一凝膠與梯度凝膠配制均一凝膠與梯度凝膠配制連續均一凝膠電泳效果連續均一凝膠電泳效果不連續均一凝膠電泳效果不連續均一凝膠電泳效果不連續梯度凝膠電泳效果不連續梯度凝膠電泳效果均一凝膠是指整塊凝膠為同一均一凝膠是指整塊凝膠為同一濃度或者分離膠為均一濃度的濃度或者分離膠為均一濃度的凝膠。凝膠。梯度膠是指分離膠由一定的濃梯度膠是指分離膠由一定的濃度組成，一般是線性梯度，通度組成，一般是線性梯度，通常從陰極至陽間，梯度濃度逐常從陰極至陽間，梯度濃度逐漸加大，孔徑變小，利用分子漸加大，孔徑變

23、小，利用分子篩作用提高分辨率，適合復雜篩作用提高分辨率，適合復雜樣品的分離。樣品的分離。緩沖液系統緩沖液系統 濃縮凝膠緩沖液濃縮凝膠緩沖液0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分離凝膠緩沖液分離凝膠緩沖液1.5mol/L Tris-HCl,PH8.9 電極緩沖液系統電極緩沖液系統 0.025mol/L Tris（三羥甲基氨基甲烷）（三羥甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨甘氨酸酸) PH8.3 樣品緩沖液樣品緩沖液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、甘油、0.05mg/ml溴酚藍溴酚藍 樣品緩沖液的要求：樣品緩沖液的要求： 選擇合適的選擇合適的P

24、H與離子強度，以保證樣品的溶解性、穩定性、與離子強度，以保證樣品的溶解性、穩定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。PH 8.3PH 6.7PH 8.9PH 8.3不連續電泳濃縮膠和分離膠的配方不連續電泳濃縮膠和分離膠的配方 貯存液貯存液 凝膠終濃度凝膠終濃度T 4% 7.5% 10% 15% 20% 單體貯液（單體貯液（14.55:0.55） 0.65 3.8 5.0 7.5 10濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液(ml) 0.1 0 0 0 0分離膠緩沖液分離膠緩沖液(ml) 0 0.3 0.3 0.3 0.3dd H2O(ml) 4.25 10.9

25、 9.7 7.2 4.7真空抽氣真空抽氣10%AP(過硫酸銨過硫酸銨) (ul) 5 15 15 15 15TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺(ul) 2.5 7 7 7 7總體積總體積 5ml 15ml標準蛋白質樣品標準蛋白質樣品標準蛋白質樣品：是一組（標準蛋白質樣品：是一組（5 57 7種）已知的合適的分子量范圍的、種）已知的合適的分子量范圍的、構形相近的一套蛋白質，溶解在構形相近的一套蛋白質，溶解在樣品緩沖液中備用。樣品緩沖液中備用。樣品的濃度樣品的濃度分析目的、檢測方法和樣品的組分析目的、檢測方法和樣品的組成是關鍵；成是關鍵；未知樣品濃度：未知樣品濃度： 0.10.120mg/ml20

26、mg/ml考瑪斯亮籃染色：考瑪斯亮籃染色： 1 12mg/ml2mg/ml銀銀 染染 色色 : 0.02: 0.020.2mg/ml0.2mg/ml 高純度樣品：高純度樣品： 0.50.52mg/ml2mg/ml加樣加樣電泳電泳 光吸收光吸收檢測檢測 考瑪斯亮籃染色考瑪斯亮籃染色 染色染色 銀銀 染染 色色 第三節第三節 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，主十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，主要用于測定要用于測定蛋白質亞基的分子量蛋白質亞基的分子量。強還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇能使半光氨酸強還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇能使半光氨酸

27、殘基之間的二硫鍵斷裂。殘基之間的二硫鍵斷裂。 是目前用于測定蛋白質亞基的分子量的一種最好是目前用于測定蛋白質亞基的分子量的一種最好的方法。的方法。 在蛋白質樣品和凝膠中加入在蛋白質樣品和凝膠中加入SDSSDS和還原劑后分子被解聚成多肽鏈，它們與和還原劑后分子被解聚成多肽鏈，它們與SDSSDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質充分結合形成帶負電荷的蛋白質SDSSDS復合物膠束，所帶的電荷大大超復合物膠束，所帶的電荷大大超過了蛋白質原有的電荷量，消除了不同分子原有的電荷差異。電泳的遷移率不過了蛋白質原有的電荷量，消除了不同分子原有的電荷差異。電泳的遷移率不再受電荷的影響，而只與蛋白質或亞基的分子量大小有

28、關。再受電荷的影響，而只與蛋白質或亞基的分子量大小有關。SDS-PAGESDS-PAGE的幾種方式的幾種方式影響影響SDS-SDS-蛋白質蛋白質結合的因素結合的因素1.溶液中溶液中SDSSDS單單體的濃度體的濃度2.樣品緩沖液的樣品緩沖液的離子強度離子強度3.二硫鍵是否二硫鍵是否完全被還原完全被還原操操 作作SDSSDS凝膠電泳掃描與染色圖譜凝膠電泳掃描與染色圖譜 蛋白質分子的電泳遷蛋白質分子的電泳遷移率與分子量的計算移率與分子量的計算蛋白質分子量的計算蛋白質分子量的計算1.1.要求一組標準蛋白質，其分子要求一組標準蛋白質，其分子量應包含欲測分子的大小；量應包含欲測分子的大小；2.2.欲測分子

29、的性質欲構形與標準欲測分子的性質欲構形與標準分子類似；分子類似；3.3.標準蛋白與被測分子在同一塊標準蛋白與被測分子在同一塊凝膠上電泳。并繪制標準曲線。凝膠上電泳。并繪制標準曲線。電泳過程中不正常現象電泳過程中不正常現象 紋理現象紋理現象 拖尾現象拖尾現象 蛋白帶歪斜現象蛋白帶歪斜現象 微笑與皺眉現象微笑與皺眉現象 蛋白帶過寬，鄰近泳道蛋白帶過寬，鄰近泳道 相連的現象。相連的現象。微笑與皺眉微笑與皺眉第四節第四節 等電點聚焦等電點聚焦-在在PH梯度中的電泳梯度中的電泳 利用蛋白質分子和其它兩性分子的等電點不同，利用蛋白質分子和其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的、線性的在一個穩定的、

30、連續的、線性的PH梯度中進行蛋梯度中進行蛋白質的分離和分析。白質的分離和分析。 等電點聚焦技術分析的對象只限于蛋白質和兩性等電點聚焦技術分析的對象只限于蛋白質和兩性分子。分子。 利用載體兩性電解質在通電的條件下，能夠形成利用載體兩性電解質在通電的條件下，能夠形成連續的、線性的連續的、線性的PH梯度，但拆除電源后梯度，但拆除電源后PHPH梯度消梯度消失，因此在聚丙烯酰胺凝膠中加入載體兩性電解失，因此在聚丙烯酰胺凝膠中加入載體兩性電解質變可形成穩定的質變可形成穩定的PHPH梯度，通過電泳進行蛋白質梯度，通過電泳進行蛋白質的分離和分析。的分離和分析。-+兩性電解兩性電解質載體質載體樣品的加入樣品的加

31、入接通電源，接通電源，開始聚焦開始聚焦聚焦完成聚焦完成蛋白質的等電點蛋白質的等電點等電點的聚焦效應等電點的聚焦效應等電點聚焦的分辨率等電點聚焦的分辨率載體兩性電解質和載體兩性電解質和PHPH梯度范圍的選擇梯度范圍的選擇載體兩性電解質的特點載體兩性電解質的特點1.1.分子量小；分子量小；2.2.可溶性好；可溶性好；3.3.緩沖能力強；緩沖能力強；4.4.電導性均勻；電導性均勻；5.5.紫外吸收低，不發熒光；紫外吸收低，不發熒光；6.6.容易從聚焦的蛋白帶中除去；容易從聚焦的蛋白帶中除去；7.7.無毒、無生物學效應。無毒、無生物學效應。操 作1. .凝膠制備系統用凝膠制備系統用H H2 2O O配

32、制（不含緩沖系統配制（不含緩沖系統）；并含載體兩并含載體兩性電解質性電解質；2.樣品不含鹽；樣品可以加在凝膠的任何部位，或與凝膠樣品不含鹽；樣品可以加在凝膠的任何部位，或與凝膠一起聚合；一起聚合；3.3.電極溶液是單一的酸和堿分別為陽極與陰極；電極溶液是單一的酸和堿分別為陽極與陰極；4 4. .聚焦時，電泳為穩壓，聚焦時間在聚焦時，電泳為穩壓，聚焦時間在4 4小時以上，隨著時間小時以上，隨著時間的延長，聚焦效果愈好；聚焦完成時，電流趨近于的延長，聚焦效果愈好；聚焦完成時，電流趨近于0 0。而。而一般的電泳是隨著時間的延長，電泳帶有擴散效應。一般的電泳是隨著時間的延長，電泳帶有擴散效應。5 5.

33、PH .PH 梯度的測定及繪制梯度的測定及繪制PHPH曲線；曲線；6 6. .固定染色，對樣品等電點的測定。固定染色，對樣品等電點的測定。PH梯度對凝膠長度梯度對凝膠長度( (cm)的關系的關系序號序號123456789101112131415cm0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5PH4.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.8電泳方法的比較電泳方法的比較電泳方法 PAGEDISCSDS-PAGEIEF特征以電荷為主；以電荷為主；以分子量為主；以分子量為主；樣品的結構特樣品的結構特征。征。不連

34、續的凝膠濃不連續的凝膠濃度；不連續的緩度；不連續的緩沖系統；不連續沖系統；不連續的的PH；不同的；不同的離子強度離子強度陰離子去污陰離子去污劑還原劑劑還原劑使蛋白質聚使蛋白質聚集體解開集體解開兩性電解兩性電解質載體質載體濃縮效應濃縮效應電荷效應電荷效應分子篩效應分子篩效應結果分析的蛋白分析的蛋白質有活性質有活性分析的蛋白分析的蛋白質有活性質有活性測定蛋白質測定蛋白質亞基的分子亞基的分子量（變性）量（變性）測定蛋白質測定蛋白質的等電點的等電點第五節第五節.雙向電泳雙向電泳 生物體中蛋白質的數量與其功能的復雜性密生物體中蛋白質的數量與其功能的復雜性密切相關，在大腸桿菌中有切相關，在大腸桿菌中有54

35、54種不同的蛋白質，而種不同的蛋白質，而在典型的人類細胞中，可表達的基因約在典型的人類細胞中，可表達的基因約50005000個個; ;同同時各種蛋白質的含量存在巨大的差異，從時各種蛋白質的含量存在巨大的差異，從1010 0.0010.001 總蛋白量，因此對純化、鑒定的要求總蛋白量，因此對純化、鑒定的要求必須是必須是高分辨，高效率高分辨，高效率及及速度快速度快。 以前介紹的方法技術中唯一能到達上述要求以前介紹的方法技術中唯一能到達上述要求的是高效液相色譜，但由于儀器的昂貴以及需要的是高效液相色譜，但由于儀器的昂貴以及需要標準品，技術操作員的專業知識等受到限制。因標準品，技術操作員的專業知識等受

36、到限制。因此此雙向電泳技術可以有效的克服這些問題。雙向電泳技術可以有效的克服這些問題。基基 本本 原原 理理 傳統的單向電泳方法最多只能分析傳統的單向電泳方法最多只能分析100 100 余種蛋白質樣品，余種蛋白質樣品，故不適合分析細胞和亞細胞中蛋白質的混合物。當采用兩種故不適合分析細胞和亞細胞中蛋白質的混合物。當采用兩種不同原理的電泳程序，就能使分辨率提高幾個數量級。不同原理的電泳程序，就能使分辨率提高幾個數量級。 利用利用SDS-PAGE及及等電點聚焦等電點聚焦相結合的電泳技術，將組分復相結合的電泳技術，將組分復雜的蛋白質樣品在一塊凝膠上進行互為垂直的兩次電泳，使雜的蛋白質樣品在一塊凝膠上進

37、行互為垂直的兩次電泳，使各組分依其分子量及等電點的差異，以點的形式分步，再配各組分依其分子量及等電點的差異，以點的形式分步，再配以高靈敏度的（銀染色或標記法）檢測技術，使一塊以高靈敏度的（銀染色或標記法）檢測技術，使一塊30X40cm的凝膠是可分辨的凝膠是可分辨10000個蛋白質點及個蛋白質點及110ng的量。的量。 雙向電泳圖解雙向電泳圖解操操 作作 雙向電泳一般是指第一向為等電點聚焦雙向電泳一般是指第一向為等電點聚焦, ,第二向為第二向為梯度梯度SDSSDS電泳電泳. .樣品通過電荷和質量的兩次分離后樣品通過電荷和質量的兩次分離后, ,可以得到分子的等電點、分子量等信息可以得到分子的等電點

38、、分子量等信息. .分離的結分離的結果不是帶果不是帶, ,而是點而是點. .根據坐標系統作圖根據坐標系統作圖, ,從左到右是從左到右是等電點等電點PIPI的變化的變化( (增加或降低增加或降低),),從上到下是分子量從上到下是分子量的增加的增加. . 這是目前所有電泳技術中分辨率最高這是目前所有電泳技術中分辨率最高, ,信息最信息最多的技術多的技術. .聚丙烯酰胺凝膠電泳在測序方面應用聚丙烯酰胺凝膠電泳在測序方面應用第六節第六節 蛋白質印跡蛋白質印跡（Protein blotting） 蛋白質印跡法是把電泳和層析分離的蛋白質蛋白質印跡法是把電泳和層析分離的蛋白質轉移到固定膜上的過程；雖然在轉移

39、到固定膜上的過程；雖然在PAGE對蛋對蛋白質有很好的分離效果及良好的分辨率而廣白質有很好的分離效果及良好的分辨率而廣泛應用，但進一步的分析受到限制。即探針泛應用，但進一步的分析受到限制。即探針分子很難通過凝膠的網孔而達到與嵌和在凝分子很難通過凝膠的網孔而達到與嵌和在凝膠中的目標蛋白質進行特異性結合或檢測。膠中的目標蛋白質進行特異性結合或檢測。通過轉移后，二者的結合變得容易，并且可通過轉移后，二者的結合變得容易，并且可以進行多種分析，因此在免疫檢測中是非常以進行多種分析，因此在免疫檢測中是非常重要的手段。重要的手段。操作步驟操作步驟1.SDS電泳的蛋白質；電泳的蛋白質；2.蛋白質樣品直接點樣蛋白

40、質樣品直接點樣 轉轉 膜膜（PVDF聚偏氟聚偏氟乙烯膜）乙烯膜）封閉硝酸纖維素膜，防止封閉硝酸纖維素膜，防止蛋白質的非特異性結合蛋白質的非特異性結合 封封 阻（淬滅）阻（淬滅）抗原、抗體的抗原、抗體的特異性反應特異性反應 反反 應應 標記的抗體與低物標記的抗體與低物的顯色反應的顯色反應 顯顯 色色定量、定性分析定量、定性分析 檢測分析檢測分析基基 本本 慨慨 念念1.探針：用化學方法將有識別能探針：用化學方法將有識別能力的物質（抗原，激素，核酸力的物質（抗原，激素，核酸等）和酶或同位素或熒光物質等）和酶或同位素或熒光物質結合成的復合物的通稱。結合成的復合物的通稱。2.固相載體：硝酸纖維素膜，尼

41、固相載體：硝酸纖維素膜，尼龍膜等。龍膜等。3.淬滅（封阻）：與印跡的成份淬滅（封阻）：與印跡的成份親緣關系很遠的，不與待測物親緣關系很遠的，不與待測物起反應的，將印跡區域以外全起反應的，將印跡區域以外全部吸附的物質。使探針除了與部吸附的物質。使探針除了與印跡物結合，再無其他結合的印跡物結合，再無其他結合的地方。背景干凈，反應清晰。地方。背景干凈，反應清晰。4.印跡：凝膠電泳后的組分，通過印跡：凝膠電泳后的組分，通過吸附或電轉移，也可直接點樣吸附或電轉移，也可直接點樣品到固相膜上。品到固相膜上。 抗原抗體的特異性反應抗原抗體的特異性反應2.二抗體二抗體上結合酶上結合酶二抗體二抗體上結合膠上結合膠

42、體金顆粒體金顆粒3.生物素標生物素標記二抗體記二抗體1.抗體上抗體上結合酶結合酶抗生物素朊抗生物素朊生物素應用例應用例3. 豚鼠血清豚鼠血清 兔兔 血清血清 兔抗豚鼠抗體（二抗體）兔抗豚鼠抗體（二抗體） 標記二抗體標記二抗體 病毒病毒 豚鼠豚鼠 血清血清 抗體（一抗體）抗體（一抗體）2.病毒病毒 SDS-PAGE 轉膜（抗原）轉膜（抗原） 封閉封閉顯色反應：染色、放射自顯影顯色反應：染色、放射自顯影點印跡的暴光點印跡的暴光點的顏色深淺顯示樣品的定量結果點的顏色深淺顯示樣品的定量結果應用方面應用方面 定性研究：確定病毒的哪定性研究：確定病毒的哪些結構蛋白起到抗原的作些結構蛋白起到抗原的作用；用；

43、 定量分析：測定抗體的效定量分析：測定抗體的效價。價。第七節第七節 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳適用小分子聚丙烯酰胺凝膠電泳適用小分子DNADNA（5 5500 bp500 bp）的分）的分離，瓊脂糖凝膠適用離，瓊脂糖凝膠適用20020050 Kb DNA50 Kb DNA片段的分離。片段的分離。 瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物, ,為白色的小顆為白色的小顆粒或粉末狀粒或粉末狀, ,在水中加熱在水中加熱90-100 3-590-100 3-5分鐘融化成清亮的分鐘融化成清亮的液態液態. .其凝固點約其凝固點約 45 .45 .并且可以根據

44、需要配制一定的并且可以根據需要配制一定的濃度濃度. .原理原理: :1.1.線狀雙鏈線狀雙鏈 DNADNA在一定濃度瓊脂糖凝膠中的泳動距離與分在一定濃度瓊脂糖凝膠中的泳動距離與分子量的對數成反比子量的對數成反比; ;2.2.不同的凝膠濃度分離不同的凝膠濃度分離DNADNA片段有不同的有效范圍片段有不同的有效范圍; ;3.3.具有相同分子量具有相同分子量, ,不同構型的不同構型的DNADNA以不同的速率通過凝膠以不同的速率通過凝膠: :閉環閉環(型型)開環開環(型型)線型線型(型型););4.4.在低電壓時在低電壓時, ,線狀線狀DNADNA片段的遷移率與所用的電壓呈正比片段的遷移率與所用的電壓

45、呈正比關系關系; ;5.5.在變性條件電泳時在變性條件電泳時, ,核酸的二級結構打開核酸的二級結構打開, ,不論不論DNADNA或或RNARNA分子均以單鏈形式遷移分子均以單鏈形式遷移, ,其遷移率與分子量直接相關其遷移率與分子量直接相關. .瓊脂糖的種類瓊脂糖的種類1.1. 高純度或超純瓊脂糖高純度或超純瓊脂糖: :應用回收的應用回收的DNADNA進行進行克隆克隆, ,酶切酶切, ,標記等標記等; ;2.2. 低熔點瓊脂糖低熔點瓊脂糖(65)(65):保持回收凝膠中的保持回收凝膠中的樣品的穩定性與活性樣品的穩定性與活性; ;3.3. 高強度瓊脂糖高強度瓊脂糖: :進行大分子的分離或低于進行大

46、分子的分離或低于0.5%0.5%時采用時采用; ;4.4. 高篩分瓊脂糖高篩分瓊脂糖: :主要分離主要分離100-1200bp100-1200bp的小的小片段片段DNA,DNA,對相差對相差4 4個堿基的個堿基的DNADNA可以分辨可以分辨. .不同濃度瓊脂糖的不同濃度瓊脂糖的凝膠的濃度凝膠的濃度(%wv)dsDNA片段的分離范圍片段的分離范圍(kb) 0.35-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2緩沖液系統緩沖液系統1.電極緩沖液電極緩沖液:TAE 0.04molL Tris-乙酸乙酸,0.001mol

47、L EDTA,PH8.0TBE 0.045molL Tris-硼酸硼酸,0.001mol L EDTA,PH8.0 TPE 0.09molL Tris-磷酸磷酸,0.002mol L EDTA,PH8.02.加樣緩沖液加樣緩沖液: (6x)0.25%溴酚藍溴酚藍+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+40%(w v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液;0.25%溴酚藍溴酚藍+40%(w v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液;0.25%溴酚藍溴酚藍+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液;0.25%溴酚藍溴酚藍+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+0.4%啞叮橙啞叮橙+30%甘油水甘油水溶液溶液;(不宜用于

48、不宜用于TBE系統系統) (二甲苯青二甲苯青)-天藍天藍-4kb (溴酚藍溴酚藍)-蘭色蘭色-300bp (啞叮橙啞叮橙)-黃色黃色-50bp核酸的染色核酸的染色 凝膠中的核酸經染色后再進行觀察與牌照記錄凝膠中的核酸經染色后再進行觀察與牌照記錄. .溴乙錠溴乙錠(EB)(EB)能能嵌入嵌入DNADNA堿基堿基, ,在紫外光激發呈現橙紅色熒光在紫外光激發呈現橙紅色熒光. .靈敏度達靈敏度達1-1-10ngDNA.10ngDNA.用非污染性的染料也可進行用非污染性的染料也可進行.(.(Goldview) )染色方法染色方法: :1.1.凝膠在凝膠在1-5ug EB1-5ug EBmlml的水溶液中

49、浸泡的水溶液中浸泡3030分鐘分鐘; ;2.2.在在0.1%0.1%焦寧的焦寧的0.5%0.5%乙酸乙酸,1mmol,1mmol檸檬酸溶液中浸泡檸檬酸溶液中浸泡; ;3.3.在在0.2%0.2%甲烯藍的甲烯藍的0.2mmolNaAc(PH7.4)0.2mmolNaAc(PH7.4)過夜過夜; ;4.4.固定后固定后,0.2%AgNO,0.2%AgNO3 3浸泡浸泡1212分鐘分鐘, ,漂洗漂洗,1.5%NaOH,1.5%NaOH和和0.4%0.4%甲醛顯甲醛顯色色,0.75%Na,0.75%Na2 2COCO3 3終止終止. .應應 用用1. 核酸分子片段大小鑒定核酸分子片段大小鑒定;2. 核酸樣品濃度的測定核酸樣品濃度的測定;毛細管電泳技術簡介毛細管電泳技術簡介概概 述述 毛細管電泳是一系列以內徑毛細管電泳是一系列以內徑10-200um10-200um的毛細管為分離的毛細管為分離通道，在高電場強度作用下對小分子和大分子的質量、通道，在高電場強度作用下對小分子和大分子的質量、電荷、淌度（電泳遷移率）進行分離的技術的統稱電荷、淌度（電泳遷移率）進