1、一、一、昆蟲主要的分子鑒定技術昆蟲主要的分子鑒定技術1、分子鑒定技術的必要性昆蟲已命名100多萬種，占動物界已知種類的2/3。自林奈創立雙名法近250年來，僅有100多萬個昆蟲物種被命名，而昆蟲昆蟲數量巨大（數量巨大（1000-2000萬未鑒定）萬未鑒定），單靠專業的經典分類學家命名，幾乎是不可能完成的任務。以平均一個經典分類學家一生鑒定 1000 個物種的標準來計算，需要1萬多個經典分類學家同時參與完成。一、一、昆蟲主要的分子鑒定技術昆蟲主要的分子鑒定技術1、分子鑒定技術的必要性由于經典分類學方法具有局限性（專業技術要求高，相對專一性專業技術要求高，相對專一性），很難同時有效地對某一個地區某

2、一個項目某一個地區某一個項目或某一次大型考察所得到的全部生物樣或某一次大型考察所得到的全部生物樣本本進行鑒定與記錄。對形態學分類固有的缺陷，如表型可塑性和遺傳可變性，無法鑒定隱存隱存分類單元和不同發育階段不同發育階段的昆蟲。一、一、昆蟲主要的分子鑒定技術昆蟲主要的分子鑒定技術1、分子鑒定技術的必要性現有物種正以每年約1萬種的速度在滅絕滅絕，也亟需一種更加具有效率的生物物種鑒定與記錄體系。以現在人類社會生產力發展的需求來看，亟需一種更加具有效率的昆蟲物種鑒定體系更加具有效率的昆蟲物種鑒定體系，更好地為生產生活服務。分子鑒定技術能夠從不同發育時期的昆蟲標本或殘缺的組織中鑒別出物種。二、二、昆蟲昆蟲

3、DNADNA條形碼條形碼1、DNA分類Tautz于2002年提出DNA分類分類的概念（DNA Taxonomy），以DNA序列為基礎建立物種識別體系，利用DNA序列的差異進行種級階元的分類，并與林奈命名系統一一對應。（可以解決一些形態學上的難題，發掘隱存種）二、二、昆蟲昆蟲DNADNA條形碼條形碼2、DNA條形碼理想的理想的DNA條形碼應符合一些基本標準條形碼應符合一些基本標準: (1)具有足夠的遺傳變異性和一定的分化度，可以區分不同的物種，同時種內變異小，具有保守性。(2) 必須是一段標準的DNA片段來盡可能的鑒別不同的分類群。(3)目標 DNA 區應該包含足夠的系統進化信息，用以定位物種在

4、分類系統中的位置。(4)具有高度保守的引物設計區，便于通用引物的設計。(5)目標 DNA 足夠的短，便于DNA的提取和PCR的擴增。二、二、昆蟲昆蟲DNADNA條形碼條形碼2、DNA條形碼Herbert等于2003年提出DNA條形條形碼碼概念（DNA Barcoding） 。利用線粒體cox1基因（線粒體細胞色素氧化酶亞基I基因，5端648 bp）作為通用序列，建立全球性的物種鑒別系統。從理論上講，15 個堿基位點就有415種編碼方式，這個數目是現存物種的100倍。在蛋白質編碼基因中的第3 位密碼子堿基是可以自由變換的。因此，只需一段45個堿基長度的序列便可編碼近10 億的物種， 所以理論上

5、DNA 條形碼這段648 bp 的序列完全可以鑒定所有物種。cox1相對保守又有足相對保守又有足夠的變異，并且序列夠的變異，并且序列長度適中。長度適中。該基因不存在內含子，是蛋白編碼基因，所以便于比對，且可通過翻譯檢測錯誤，極少出現重組、 插入和缺失。14603014lUEA5/UEA6、UEA7/UEA8和UEA5/UEA8：相對保守高水平（科、屬、種）系統發育研究lUEA3/UEA4 (or UEA4d) 和UEA9/UEA10：較為變異種群遺傳學研究（種內或近緣物種系統發育）2、DNA條形碼預先收錄已知物種的預先收錄已知物種的cox1基因基因-建建立數據庫立數據庫-未知種名物種未知種名物

6、種cox1輸入檢索輸入檢索-據相似度鑒定物種。據相似度鑒定物種。DNA條形碼的操作流程主要有以下幾個步驟：1)標本采集、整理、鑒定、描述；2)基因組DNA提取；3)DNA條形碼標準基因的PCR擴增；4)PCR產物純化及DNA序列測定；5)DNA 序列比對與分析序列比對與分析。DNA 序列比對與分析序列比對與分析序列分析即利用生物信息學軟件統計分析序列差異，主要包括進化進化樹法樹法（tree based methods）、距離法距離法（distance based methods）和特征法特征法（character based methods），前兩者主要包括鄰接法、BLAST搜索或使用軟件分析

7、堿基遺傳距離等，后者主要包括DNA序列中核苷酸的組成、替換與缺失等分析。在分析種以下水平的序列差異時，由于基因距離較小，使用基于特征的分析方法更為可靠。DNA 序列比對與分析序列比對與分析進化樹法進化樹法通過構建系統發育樹，以進化樹上的物種是否為單系性為標準來判定未知物種的種類或發現新種。常用方法有鄰接法（NJ）、最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）。 MP、ML法和BI法是基于特征的方法，通過比較所有序列的每個位點，計算每棵樹的得分。NJ法為基于一定的進化模型，如：K-2-P模型、p-distance等，計算出各序列間的遺傳距離，構建距離矩陣，進而構建系統發育樹。DNA

8、序列比對與分析序列比對與分析距離法距離法距離法是通過計算物種間的遺傳距離來鑒定物種，根據條形碼間隙的概念，即種內遺傳距離和種間遺傳距離之間應存在一個距離間隙，或通過定義一個能區分種內、種間遺傳距離的閾值，將未知物種鑒定為已知物種或定義為新種。TaxonDNA是基于遺傳距離分析條形碼鑒定效率的程序（評價方法：最佳匹配方法（BM）和基于閾值的最佳匹配方法（BCM）。通常基于K-2-P模型進行計算。BM方法的常會導致假陽性的錯誤鑒定；BCM有所改進，該方法先對數據庫中的序列進行統計分析，得出一個相似性的閾值，即與未知序列遺傳距離最小且在閾值范圍內的數據庫中的物種為鑒定成功的物種。DNA 序列比對與分

9、析序列比對與分析特征法特征法特征法是尋找某分類單元內成員共享、并可以將其與其他分類單元區分開的鑒定特征。一個物種中的固定核苷酸位點的固定堿基可以作為鑒定該種的診斷特征，類似于傳統分類學中的形態特征，來鑒定和描繪物種。該方法已被證實為物種鑒定的有效方法。特征法特征法-木蠹象屬昆蟲木蠹象屬昆蟲DNA條形碼檢測技術的研發條形碼檢測技術的研發木蠹象屬昆蟲的鑒定特征（cox1基因片段長度 371 bp） 利用基因條碼分析軟件共檢測到 46 個多態位點，其規律作為木蠹象屬昆蟲的鑒定特征，可以根據特征對該屬物種進行準確鑒定。標記性堿基的確定為木蠹象屬昆蟲的分子快速鑒定提供了實驗依據。榛梢木蠹象Pissode

10、s terminalis在數據庫里的比對結果1榛梢木蠹象Pissodes terminalis在數據庫里的比對結果2/2007年5月，加拿大圭爾夫大學正式籌建生命條形碼數據庫系統(Barcode of Life Data Systems，BOLD)。包括序列信息，也包括完整的物種描述、地理分布信息、標本圖片等。以每年以每年30 萬個樣本的速度在擴充萬個樣本的速度在擴充截至2015年3月，已有DNA條形碼序列3,866,134條，包括157,057種動物、62,025種植物和16,837種真菌及其他生物類群。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼

11、技術在昆蟲學中的應用已經開展的昆蟲 DNA 條形碼計劃DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在昆蟲分類學中的應用鑒定物種鑒定物種：在雙翅目、膜翅目、鞘翅目、蜉蝣目、彈尾目、直翅目、蜻蜓目、纓翅目、襀翅目和毛翅目等中DNA條形碼也被證實可以很好地區分物種。確定蟲態關系：確定蟲態關系：可以對通常形態上無法鑒定的尤其是完全變態的幼蟲、蛹、卵等蟲態進行分類。最基本的用途就是物種間的相互區別和新物種的發現。其他用途均是由這兩個用途衍生出的。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在昆蟲分類學中的應用發現隱存種與合并異名種：發現隱存種與合并異名種：在鱗翅目等類群中，通

12、過DNA條形碼發現了大量隱存種或新種（Hebert等在發現 DNA 條形碼序列差異后結合幼蟲色型、幼蟲取食植物、生態分布、成蟲頭部等特征發現，雙帶藍閃弄蝶其實是個由同域分布的至少10個種組成的復合體。）DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在昆蟲分類學中的應用探討系統發育關系：探討系統發育關系：盡管DNA條形碼的目的不是為了構建系統發育樹， 但是條形碼所使用的 COI 基因本身就包含著一定的系統發育信息， 通常認為可以用來探討一些低級階元的系統發育關系。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在昆蟲分類學中的應用分析區系組成：分析區系組成：如利用DNA條形

13、碼技術對羅馬尼亞的鱗翅目1387個標本的種類進行全面分析，最后得出6 科 180 種的結果。在昆蟲生態學中的應用n確定寄生關系：確定寄生關系：明確生態系統中種間寄生關系（主要是植食性昆蟲與寄主植物間的關系、 寄生昆蟲與寄主的關系等）是生態學研究與昆蟲管理中的重要問題。Smith等檢驗了條形碼用于研究寄生蠅類的可行性，先用形態方法對哥斯達黎加西北部的關納卡斯帝保護區中寄生于鱗翅目幼蟲的寄生蠅類進行鑒定，得出20 個形態種，然后再用 DNA 條形碼的方法重新鑒定， 結果不僅區分出了其中17 個具有高度寄主專一性的形態種， 還揭示出剩余的 3 個表面上雜食性的形態種其實都是由具寄主專一性的物種組成的

14、隱存種。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在昆蟲生態學中的應用n解析食物鏈：解析食物鏈：通常是通過特異的引物檢測植食性昆蟲或捕食者腸道內含物或排泄物中殘存的寄主植物或被捕食者的 DNA 來確定 食 物 鏈 中 的 營 養 關 系。 如Kaartinen等首次應用 DNA 條形碼 COI 和ITS2 序列研究了發生在黑橡Quercus robor Linnaeus上的潛葉鱗翅目和造癭膜翅目組成的食物網中的物種成員以及相互的關系。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在昆蟲生態學中的應用n推斷氣候變化對昆蟲的影響：推斷氣候變化對昆蟲的影響：如通過形態結合

15、 DNA 條形碼的方法調查20 世紀中期及其5070 年后加拿大極地Churchill地區的一些寄生蜂的多樣性，并比較這兩個時期的物種多樣性的改變，結果發現在這5070年間，這些地區的物種組成確實隨著溫度的升高發生了顯著的變化。在應用昆蟲學中的應用u農業昆蟲學：農業昆蟲學：上述 DNA 條形碼技術在昆蟲分類與生態學研究中應用的很多方面均可用于農業昆蟲學研究中。如利用 DNA 條形碼對北美農業生態系統中的天敵昆蟲瓢蟲種類進行了分析，發現3種本地物種和2 種入侵物種。u植物檢疫：植物檢疫：隨著參考序列數據庫的不斷完善， 條形碼可用來作為全球范圍內快速準確鑒定外來入侵物種的通用方法。DNA條形碼技術

16、在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在應用昆蟲學中的應用u城市昆蟲學：城市昆蟲學：關于城市化昆蟲的進化起源及其特點已經開始受到越來越多學者的關注。如通過利用 DNA 條形碼對美國47個地點家酸臭蟻樣品進行生物地理學研究表明，每個城市的城市化種群都是由其周圍自然環境中的螞蟻入侵形成的，而非所有的城市化種群都有一個共同的起源。u法醫昆蟲學：法醫昆蟲學：法醫昆蟲學主要是利用尸體上產生昆蟲的種類、生長發育情況來推斷死亡時間、地點等，對昆蟲進行準確鑒定是開展法醫昆蟲學研究的前提。一般成蟲易飛走而導致通常收集到的都是卵、幼蟲、蛹或者是殘肢碎片，這些因為缺乏形態上的鑒定特征，致使傳統的形態鑒定難以實現

17、，以往主要的解決辦法就是將幼蟲帶回去飼養成成蟲后再鑒定，這種方法不僅會拖延大量的時間，而且經常會因為飼養經驗不足， 環境不適應導致幼蟲死亡，最后直接影響相關案件的偵破。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在應用昆蟲學中的應用u保 護 生 物 學 ：保 護 生 物 學 ： 用DNA條形碼技術對候選保護區進行評估, 能全面反映整個生態系統的物種物種多樣性、遺傳多樣性、系統發育多樣性和進化潛力等, 使保護決策更科學合理（宏條形碼技術）。在一些生物多樣性調查研究中，DNA條形碼鑒定物種的準確率達到了97%該技術將整個混合樣本的DNA片段擴增后再進行高通量測序，目前已用于微生物和動

18、物的相關研究中。DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用條形碼技術在昆蟲學中的應用在應用昆蟲學中的應用u保護生物學：保護生物學：此外，為執法部門的科學執法提供了強有力的保障，如利用DNA條形碼還可以及時地檢查出非法交易中受保護的瀕臨滅絕昆蟲，如由鳥翼鳳蝶 Ornithoptera spp制作的裝飾品和一些珍惜鞘翅目昆蟲標本。u醫學昆蟲學：醫學昆蟲學：為研究關于吸血性昆蟲與其脊椎動物寄主的相互關系提供了一個快速通用的鑒定工具。如選取蚊、庫蠓、錐獵蝽吸食的血液，結果鑒定出將近40種脊椎動物寄主，包括23 種鳥類、16 種哺乳動物以及1 種爬行動物。3、相關爭議問題拋棄傳統分類方法，會造成分類學的倒退，分類

19、學有可能又回歸到依據單一性狀進行分類的類型學類型學。DNA 分類只是部分科學家的一廂情愿，并沒有多少實際意義。僅用DNA 序列作為分類依據，會喪失很多有用信息喪失很多有用信息，特別是顛覆了顛覆了傳統意義上的物種認知傳統意義上的物種認知，使人們對物種的理解變成了抽象的代碼。3.1 DNA條形碼與條形碼與DNA分類的關系分類的關系目的不同目的不同： DNA條形碼基于DNA序列之間的相似度相似度進行物種鑒定，注重實效，而不是構建生命樹或進行系統發育研究。而DNA分類則是要建立一個單單獨依靠獨依靠DNA序列的分類系統序列的分類系統（不依賴形態特征，能排除人為因素，更為客觀，更接近物種的自然屬性；為物種

20、鑒定提供平臺的同時，還需要進一步探討物種的系統發育、高階元分類地位等深層次的內容）。關于DNA條形碼與分類學的關系，應是把條形碼定義為一個有前途的技術工具，其作用應該是服務于分類學而不是取代分類學。3.1 DNA條形碼與條形碼與DNA分類的關系分類的關系所用基因不完全相同所用基因不完全相同： DNA 條形碼強調用統一的基因統一的基因序列進行鑒定（解決一些特殊類群，或處理一些特殊情況如假基因、基因交流等時，需要再加一條候補基因）；在DNA分類中，對于長度僅為658 bp的cox1基因來講，所包含的信息量并不足以很好的解決物種的系統發育等問題。要進行更深層次的分類工作。一般仍需要再加至少一條其它區

21、域的DNA序列（核基因），甚至還需要附加其它的性狀（生態學、行為學等）來進行輔助研究。分析方法不完全相同分析方法不完全相同：雖然 DNA 條形碼主要用系統發育分析常用的樹來做分析，但僅僅是為了驗證物種的單源性和聚類關系，通常要求所用分析方法簡潔、快速（這些樹不能看做系統發育樹）。而 DNA分類為了解決系統發育與高級階元分類關系等問題，針對 DNA 序列的特點，可能要用到多種軟件、多種算法構建系統發育樹，運算耗時較長。3.2 物種概念的定義物種概念的定義“生物學物種概念生物學物種概念”（Mayr）：對于有性生殖生物而言，物種是一個具）：對于有性生殖生物而言，物種是一個具有共同基因庫、與其它類群之

22、間存在生殖隔離的類群。有共同基因庫、與其它類群之間存在生殖隔離的類群。物種形成是一個漸進的過程，何時確定為新物種形成，在分類實踐中難以操作；物種形成是對不同自然環境或性選擇的分化適應，生殖隔離是這種分化適應的副產物，因而沒有必要將生殖隔離作為物種形成的絕對標準。DNA條形碼條形碼：種內種間的線粒體cox1基因差異存在一個閾值（約2-3%）。（但在實際研究中，許多類群存在種內種間線粒體基因序列差異重疊的現象，而且各類群、譜系之間的閾值也不相同）。物種的形成是一個動態的、連續的過程，單用種內種間差異來進行物種定義不能準確將其表達。3.3 DNA條形碼面臨的問題條形碼面臨的問題l進化速率進化速率：不

23、同生物中的進化速率并不一致。太慢，則難以鑒別物種。l假基因干擾假基因干擾：核內的線粒體基因拷貝（ NUMTs）會影響DNA條形碼的準確性。l種間線粒體基因交流種間線粒體基因交流：線粒體基因屬于母系遺傳，所以可能會出現一些導致錯誤鑒定的現象。（種間雜交和內共生體感染，殺雄微生物和細胞質不親和共生菌。沃爾巴克等內共生菌的存在，造成寄主mtDNA多態性降低或提高，從而影響DNA條形碼及系統發育研究。）l取樣的問題取樣的問題：浸泡標本給取樣帶來了困難，個體很小的標本，DNA提取將會完全破壞標本（微型條形碼）；取樣的范圍過小和不均勻，會出現種內種間有差異閾值的現象存在（如果增加地理種和近緣種的干擾，DN

24、A條形碼鑒定的準確率就會下降）。l分析方法分析方法：DNA 條形碼一般采用K-2-P模型（遺傳距離值很小時的最佳模型，生物條形碼聯盟 ( CBOL) 推薦使用的遺傳距離計算模型）計算種內種間距離。所用的系統發育分析方法有 NJ、UPGMA（非加權組平均法）、ML、MP、貝葉斯（BI）等。4、我國DNA條形碼研究進展2008年，中國科學院代表團與 iBOL 簽訂了合作諒解備忘錄，使我國成為 iBOL四個中心節點之一，與加拿大、美國和歐盟具有同等地位。iBOL中國委員會，設立了南方和北方兩個分中心。優先啟動農林害蟲、藥用昆蟲、媒介昆蟲、傳粉昆蟲、外來入侵物種、重要保護動物等具有重要經濟及理論價值的

25、類群。總之，DNA條形碼將在其基本功能(如儲備數據、鑒別物種)、延伸功能(如構建系統發育關系、服務特定行業、編制新一代生物圖志)以及潛在功能(如物種整合)等三類發揮作用。根據其研究尺度, 可劃分出類群(主要是專科專屬類研究)、群落(以自然保護區和大型固定樣地構成的生物群落)和區域(生物多樣性熱點地區)等三個水平。三、三、基于基于ITSITS的昆蟲分子鑒定的昆蟲分子鑒定核糖體RNA (rRNA)是構成核糖體的主要成分，是最多的一類RNA，也是3類RNA（tRNA, mRNA, rRNA)中相對分子質量最大的一類RNA，它與蛋白質結合而形成核糖體，實現蛋白質的合成。rRNA基因在真核生物基因組中以

26、串聯重復方式存在，其中18S、5.8S和28SrRNA 基因組成一個轉錄元件轉錄元件。核糖體內轉錄間隔區（ITS）通常包括ITSl和ITS2，轉錄時，ITS1和ITS2就會被剪切掉，不參加核糖體的形成，因此受到的選擇壓力小，進化速度快，選擇壓力小，進化速度快，可用來研究種群分化、種或屬間的系統發育。三、三、基于基于ITSITS的昆蟲分子鑒定的昆蟲分子鑒定5.8SUF1LDRLERLBRLPRLYRLTR基于ITS2特異引物進行書虱物種鑒定多重PCR技術四、四、限制性片段長度多態性限制性片段長度多態性RFLP（restriction fragment length polymorphism）利用

27、限制性內切酶消化不同個體的基因組DNA或某一基因某一基因，從而產生大小不同或數目各異的DNA片段。酶切片段可通過電泳（Southern印跡轉移到支持膜上，利用同位素或非同位素標記的探針）來檢測。這種差異是酶識別序列內的點突變或是部分DNA片段的插入、缺失、異位或倒位等原因造成的。書虱 PCR-RFLP快速識別借助1對引物16Sar/16Sbr 和1種限制性內切酶Dra I，通過 PCR-RFLP 技術可將我國常見倉儲書虱即嗜蟲書虱、嗜卷書虱、無色書虱和小眼書虱進行識別。五、五、隨機擴增片段長度多態性隨機擴增片段長度多態性RAPD（randomly amplified polymorphic D

28、NA）是以PCR技術為基礎的DNA分子標記技術，采用單一的人工合成的10 bp左右的隨機引物，對總基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳分離，經染色后來檢驗擴增產物DNA片段的多態性。而基于隨機擴增多態性RAPD基礎上轉化出來的序列特異性擴區(sequence characterized amplified region， 簡稱 SCAR) 標記具有操作簡便、 靈敏度高、成本低、 可用于樣品大規模檢測等優點， 在昆蟲鑒定中得到廣泛應用。六、六、實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR技術技術酶切熔解曲線分析法，即利用DNA片段GC含量不同，熔解曲線具有差異的特性，通過實時熒光定量PCR儀對目標產物進行快速擴增，結合快速內切酶酶切，產物進行熔解曲線分析，從而實現不需要進行凝膠電泳檢測即可對任意SNP位點進行分型的目的。一種新的一種新的SNP分型方法分型方法酶切位點篩選及引物設計DNA 提取、PCR 擴增 限制性內切酶酶切熔解曲線分析37 酶切 10 min60 下 15 min 滅活95 變性性15 s60 溫育1 min6090 連續升溫（升溫幅度 0.02 s1）引物設計完成后在正向引物5 端加上一段長7或14 bp的GC-clamp六、六、實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR技術技術當PCR產物可被限制性內切酶切開，產生的兩條酶切產物的GC含量會