1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與凍存實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與凍存細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉l1. 1.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么細(xì)胞培養(yǎng)中為什么NaHCONaHCO3 3？l2.2.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？l3.3.消化液胰酶的濃度是多少？消化液胰酶的濃度是多少？細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理（一）傳代培養(yǎng)（一）傳代培養(yǎng) 1. 1.傳代培養(yǎng)的概念傳代培養(yǎng)的概念 當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或已成為細(xì)胞系的細(xì)當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或已成為細(xì)胞系的細(xì)胞，增殖達(dá)到一定密度后，將培養(yǎng)的細(xì)胞胞，增殖達(dá)到一定密度后，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾從一個(gè)容器以適當(dāng)比

2、率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)或繼代個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉2. 2. 細(xì)胞傳代的意義與目的細(xì)胞傳代的意義與目的 防止細(xì)胞增殖過(guò)度、營(yíng)養(yǎng)枯竭、酸中毒防止細(xì)胞增殖過(guò)度、營(yíng)養(yǎng)枯竭、酸中毒 維持細(xì)胞種的維持細(xì)胞種的延續(xù)延續(xù)。 利用培養(yǎng)細(xì)胞利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉n傳代中的傳代中的 “代代”與細(xì)胞世代中的與細(xì)胞世代中的 “代代”不同不同n傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。 3. 3. 需要注意的兩個(gè)問(wèn)題需要

3、注意的兩個(gè)問(wèn)題細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉（二）培養(yǎng)細(xì)胞的種類二）培養(yǎng)細(xì)胞的種類貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞：附著在一個(gè)固相支持物表面才附著在一個(gè)固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。如大部分的上皮來(lái)源的細(xì)能生長(zhǎng)的細(xì)胞。如大部分的上皮來(lái)源的細(xì)胞。單層細(xì)胞，接觸抑制。胞。單層細(xì)胞，接觸抑制。半貼壁細(xì)胞半貼壁細(xì)胞：呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但不牢。呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但不牢。懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞：不需附著在固相支持物表面，不需附著在固相支持物表面，懸浮即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。如血細(xì)胞等。懸浮即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。如血細(xì)胞等。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 懸浮型細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張

4、 偉 半貼壁細(xì)胞半貼壁細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 （三）細(xì)胞貼壁過(guò)程（三）細(xì)胞貼壁過(guò)程細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉（四）細(xì)胞傳代后的四個(gè)生長(zhǎng)階段四）細(xì)胞傳代后的四個(gè)生長(zhǎng)階段n潛伏期：細(xì)胞無(wú)分裂，6-24小時(shí)。n指數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，分裂相細(xì)胞的比例（分裂指數(shù)）。n停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和，細(xì)胞停止增殖，但仍有代謝活動(dòng)。平臺(tái)期。n衰退期：自然衰退和耗竭衰退。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉（五）（五） 何時(shí)傳代與如何傳代？何時(shí)傳代與如何傳代？1. 肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度培養(yǎng)物顏色及混濁度細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉2. 2. 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)倒置顯微鏡

5、觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代n棄掉培養(yǎng)液，加0.51mL的胰酶涮洗一下培養(yǎng)瓶，去殘留的舊培養(yǎng)液，解除血清對(duì)胰酶的抑制作用。 n每瓶細(xì)胞加入1mL胰酶, 蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起收回變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶去掉。注意勿使細(xì)胞提早脫壁落入消化液中。n加入5ml的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)然后分裝到新培養(yǎng)瓶中(1x105/ml ，5mL/小瓶） 。蓋上瓶蓋, 適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 細(xì)胞消化的最佳程度細(xì)胞消化的最佳程度

6、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉懸浮細(xì)胞傳代步驟n可將細(xì)胞培養(yǎng)懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)液上清，加入新鮮培養(yǎng)液，然后分裝到各瓶中。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉( (六六) )細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉 冷凍保護(hù)劑的種類及作用機(jī)制冷凍保護(hù)劑的種類及作用機(jī)制n常用滲透性冷凍保護(hù)劑主要包括常用滲透性冷凍保護(hù)劑主要包括甘油、甘油、DMSODMSO、乙、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。等。nDMSODMSO：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度好，能：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透迅速透入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，延緩凍結(jié)過(guò)程，

7、能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)之前透性，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)之前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，提高細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，提高細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞凍傷。濃度，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞凍傷。常用濃度為常用濃度為5%-10%5%-10%，細(xì)胞在液氮中凍存，細(xì)胞在液氮中凍存1-21-2年，存年，存活率可達(dá)活率可達(dá)80%-90%80%-90%。DMSODMSO液需預(yù)先用培養(yǎng)液配液需預(yù)先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握無(wú)菌操作技術(shù)。 掌握傳代細(xì)胞的培養(yǎng)的方法與步驟

8、。 掌握培養(yǎng)細(xì)胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 1. 1. 細(xì)胞細(xì)胞 人宮頸癌人宮頸癌HeLa HeLa 細(xì)胞細(xì)胞 人胃癌人胃癌BGC-823BGC-823細(xì)胞細(xì)胞 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHOCHO細(xì)胞細(xì)胞2. 2. 試劑試劑 DMEMDMEM培養(yǎng)基、胰酶、血清、培養(yǎng)基、胰酶、血清、DMSODMSO、抗生素、抗生素 3. 3. 儀器儀器 超凈工作臺(tái)、超凈工作臺(tái)、COCO2 2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.4.其它用品：其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，培養(yǎng)瓶，

9、試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，7575酒精棉球，酒精燈酒精棉球，酒精燈 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1. .準(zhǔn)備準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)紫外線處理：超凈工作臺(tái)紫外線處理3030分鐘分鐘, , 用肥皂洗手用肥皂洗手, , 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 2. 倒置顯微鏡下倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置將培養(yǎng)用液置3737C C預(yù)預(yù)熱。熱。3 3關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈, , 打開可見光燈開關(guān)打開可見光燈開關(guān), ,打開抽風(fēng)打開

10、抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。用機(jī)清潔空氣，除去臭氧。用75%75%酒精擦雙手消毒酒精擦雙手消毒 。 4.4.正確擺放超凈臺(tái)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品正確擺放超凈臺(tái)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品：酒精燈、酒精棉：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸等。點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)試筒（頭）、廢液缸等。點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)試劑：劑：DMEMDMEM培養(yǎng)基（其中血清含量培養(yǎng)基（其中血清含量10%10%）、）、 血清、血清、胰酶等。胰酶等。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉5.點(diǎn)燃酒精燈；取出無(wú)菌試管，巴士德吸管和刻度吸點(diǎn)燃酒精燈；取出無(wú)菌試管，巴

11、士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌試管；安上橡皮頭；過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌試管內(nèi)。管內(nèi)。6.6.將培養(yǎng)液瓶（將培養(yǎng)液瓶（90mL) 90mL) 過(guò)酒精燈火焰后斜置于酒精燈過(guò)酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。旁的架子上。7. 7. 打開血清打開血清瓶（瓶（10.5mL) 10.5mL) ，瓶口，瓶口過(guò)酒精燈火焰后斜置過(guò)酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。于酒精燈旁的架子上。8. 8. 無(wú)菌吸取無(wú)菌吸取10mL10mL血清血清加入加入到到培養(yǎng)液（培養(yǎng)液（90mL)90mL)中，用中，用微量移液器加入雙抗微量移液器加入雙抗200200L L輕輕混勻，配置完全輕輕混勻，配

12、置完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。9. 9. 在在血清中血清中（剩余（剩余0.5mL0.5mL) ) 加入加入4mL4mL完全培養(yǎng)基輕輕完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入混勻，加入0.5mL0.5mL DMSO DMSO（凍存保護(hù)劑），輕輕混（凍存保護(hù)劑），輕輕混勻即為凍存液勻即為凍存液 。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉10.細(xì)胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消細(xì)胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法傾倒方法, ,對(duì)于培養(yǎng)皿對(duì)于培養(yǎng)皿, ,必須用吸管吸出）必須用吸管吸出）11.11.加一滴管胰酶輕輕

13、漂洗一下細(xì)胞加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細(xì)胞，棄胰酶，再，棄胰酶，再加加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細(xì)胞量為準(zhǔn)入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細(xì)胞量為準(zhǔn)) )，轉(zhuǎn)動(dòng)，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤(rùn)整個(gè)細(xì)胞層，蓋好瓶蓋。培養(yǎng)瓶，使其濕潤(rùn)整個(gè)細(xì)胞層，蓋好瓶蓋。12.12.顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化狀態(tài)，顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化狀態(tài)，待細(xì)胞大部分收待細(xì)胞大部分收縮、突起、變圓，細(xì)胞邊界清晰時(shí)，即可立起或翻縮、突起、變圓，細(xì)胞邊界清晰時(shí)，即可立起或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺(tái)內(nèi)靠近火焰處棄胰酶，在超凈臺(tái)內(nèi)靠近火焰處棄胰酶. .細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉13. 加兩滴管（約加兩滴管（約1.8-2mL1.8-2mL）

14、凍存液既凍存液既全面吹打細(xì)胞全面吹打細(xì)胞瓶瓶壁壁, ,吹打均勻，細(xì)胞濃度宜大，吹打均勻，細(xì)胞濃度宜大，3 310106 6個(gè)個(gè)/mL/mL左右。左右。14.14.將細(xì)胞懸液吸至凍存管中將細(xì)胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并，擰好蓋，封好膠布，并標(biāo)記好細(xì)胞種類，凍存時(shí)間標(biāo)記好細(xì)胞種類，凍存時(shí)間，保存條件以及凍存者，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細(xì)胞凍存將細(xì)胞離心后再加凍存液）姓名等（懸浮細(xì)胞凍存將細(xì)胞離心后再加凍存液）15.15.在培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)瓶( (殘余少量細(xì)胞）中加入殘余少量細(xì)胞）中加入5mL5mL完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基及，及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置蓋好瓶蓋（擰緊后

15、并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，放入相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，放入CO2CO2培養(yǎng)箱培培養(yǎng)箱培養(yǎng)。養(yǎng)。16.16.凍存管在凍存管在4 4度存放度存放30min30min，轉(zhuǎn)放到，轉(zhuǎn)放到2020度度 1.51.52h2h，再轉(zhuǎn)到再轉(zhuǎn)到7070度度4 412h12h后即可轉(zhuǎn)移到后即可轉(zhuǎn)移到液氮液氮內(nèi)，注意做內(nèi)，注意做好凍存記錄好凍存記錄。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 張 偉把握好傳代時(shí)機(jī)，80-90%匯合度階段最好，過(guò)早細(xì)胞產(chǎn)量少，過(guò)晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳消化時(shí)間要適度，過(guò)短細(xì)胞不易脫落，過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過(guò)濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。不同細(xì)胞對(duì)消化反應(yīng)