1、生物大分子的生物大分子的識別、分離和檢測識別、分離和檢測生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子: : 指分子量大于10,000，有復雜空間結構，具有生物活性的物質；如多肽、蛋白質、酶等。特性：特性： 具有特定的生化結構（組成，序列和構象） 分子量大，分子極性強 對溫度、pH值、剪切力、有機溶劑等非常敏感生物大分子的識別生物大分子的識別 “看清看清”生物大分子生物大分子“是誰是誰”； “看清看清”生物大分子生物大分子“是什么樣子是什么樣子”。 質譜測定分析質譜測定分析 一種識別生物大分子的方法一種識別生物大分子的方法 質譜測定分析法是通過測定樣品中物質的質量來識別物質譜測定分析法是通過測定樣品

2、中物質的質量來識別物質的類別。質的類別。 傳統的質譜分析方法是：傳統的質譜分析方法是： 首先將成團的蛋白質分子拆分成各自獨立的單個分子，首先將成團的蛋白質分子拆分成各自獨立的單個分子，將其電離并使之懸浮在真空中，然后讓它們在電場作用下運將其電離并使之懸浮在真空中，然后讓它們在電場作用下運動。動。 這種方法的缺點在于生物大分子比較脆弱，在拆分和電這種方法的缺點在于生物大分子比較脆弱，在拆分和電離成團的生物大分子過程中它們的結構和成分很容易被破壞。離成團的生物大分子過程中它們的結構和成分很容易被破壞。美國科學家約翰美國科學家約翰芬恩，獲芬恩，獲20022002年年諾貝爾化學獎諾貝爾化學獎日本科學家

3、田中日本科學家田中耕一，獲耕一，獲20022002年年諾貝爾化學獎諾貝爾化學獎對成團的生物大對成團的生物大分子施加強電場分子施加強電場用軟激光轟擊成用軟激光轟擊成團的生物大分子團的生物大分子使生物大分子相互完整地分離，同時也被電離使生物大分子相互完整地分離，同時也被電離。芬恩的電噴霧質譜技術（芬恩的電噴霧質譜技術（ESIESI）原理圖）原理圖田中耕一的軟激光解吸附質譜技術田中耕一的軟激光解吸附質譜技術（RLD）原理圖）原理圖質譜測定方法解決了質譜測定方法解決了“看清看清”生物大分子生物大分子“是誰是誰”的問題的問題電噴霧電噴霧質譜質譜法法electron spray mass spectrom

4、etry ESMSelectron spray mass spectrometry ESMS 樣品溶液經很細的進樣管進入電噴霧室，在強電場的樣品溶液經很細的進樣管進入電噴霧室，在強電場的作用下，樣品溶液在出口處因電荷的分離和靜電引力而破作用下，樣品溶液在出口處因電荷的分離和靜電引力而破碎成許多細小的帶有電荷的液滴，當液滴蒸發到某一程度，碎成許多細小的帶有電荷的液滴，當液滴蒸發到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產生的小帶電液滴繼續液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產生的小帶電液滴繼續此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發，就可獲得自由徘徊此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發，就可獲得自由徘徊的質子化和

5、去質子化的蛋白分子。的質子化和去質子化的蛋白分子。 電噴霧液相色譜質譜聯用儀電噴霧液相色譜質譜聯用儀 樣品的分子離子和裂片離子經一系列分離器和靜電透樣品的分子離子和裂片離子經一系列分離器和靜電透鏡進入質量分析器進行質譜分析。鏡進入質量分析器進行質譜分析。 這種電噴霧質譜法具有很高靈敏度，且電離的分子可這種電噴霧質譜法具有很高靈敏度，且電離的分子可以帶有多電荷，這種多電荷離子的產生大大擴展了普通質以帶有多電荷，這種多電荷離子的產生大大擴展了普通質譜儀能分析的質量范圍，使質譜儀可以分析分子量為幾十譜儀能分析的質量范圍，使質譜儀可以分析分子量為幾十萬質量單位的蛋白質分子。精確度達到萬質量單位的蛋白質

6、分子。精確度達到99.99%99.99%。 激光解吸附電離飛行時間質譜激光解吸附電離飛行時間質譜 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS ） MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS的原理是：當用一定強度的激光照射樣品的原理是：當用一定強度的激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量，樣品解與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質吸附，基質- -樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，電離樣品之間發生電荷轉移使得樣

7、品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質量電荷之比（飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質量電荷之比（M/ZM/Z）與離子的飛行時間成正比來檢測離子。與離子的飛行時間成正比來檢測離子。 MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS的中心技術就是依據樣品的質荷比（的中心技術就是依據樣品的質荷比（m/zm/z）的不同來進行檢測，并測得樣品分子的分子量。的不同來進行檢測，并測得樣品分子的分子量。 MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS具有靈敏度高、具有靈敏度高、準確度高、分

8、辨率高、圖譜簡明、準確度高、分辨率高、圖譜簡明、質量范圍廣及速度快等特點，在操質量范圍廣及速度快等特點，在操作上制樣簡便、可微量化、大規模、作上制樣簡便、可微量化、大規模、并行化和高度自動化處理待檢生物并行化和高度自動化處理待檢生物樣品，而且在測定生物大分子和合樣品，而且在測定生物大分子和合成高聚物應用方面有特殊的優越性。成高聚物應用方面有特殊的優越性。近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質、多糖、核苷酸、糖蛋白、高白質、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強有力聚物以及多種合成聚合物的強有力工具。工具。 激光解吸附電離質譜儀激光解吸附電離質譜儀 在核磁共

9、振技術出現以前，在核磁共振技術出現以前，X X射線晶體分析技術是惟一射線晶體分析技術是惟一可以研究蛋白質三維結構的方法。該法是根據蛋白質結晶對可以研究蛋白質三維結構的方法。該法是根據蛋白質結晶對X X射線的衍射作用實現的。但該法不能對溶液進行分析。射線的衍射作用實現的。但該法不能對溶液進行分析。 核磁共振技術彌補了核磁共振技術彌補了X X射線晶體分析技術的不足，能夠射線晶體分析技術的不足，能夠對溶液中的蛋白質進行分析，即在蛋白質最自然的生存環境對溶液中的蛋白質進行分析，即在蛋白質最自然的生存環境下對它們進行研究，進而得到下對它們進行研究，進而得到“活活”蛋白質的結構。蛋白質的結構。核磁共振 一

10、種揭示生物大分子真面目的方法 在結晶狀態下蛋白質分子是緊緊地積壓在一起的，而在在結晶狀態下蛋白質分子是緊緊地積壓在一起的，而在溶液中它們則處在最自然的生理狀態下。溶液中它們則處在最自然的生理狀態下。 朊病毒蛋白質分子朊病毒蛋白質分子中肽鏈有一半（中肽鏈有一半（23-12023-120）在水溶液中是呈現無規在水溶液中是呈現無規則的、松散的、靈活多則的、松散的、靈活多變的狀態。變的狀態。應用核磁共振技術測定的應用核磁共振技術測定的朊病毒蛋白質分子結構圖朊病毒蛋白質分子結構圖 核磁共振法獨到之處是測定溶液中的蛋白質，是在最接近分子自然核磁共振法獨到之處是測定溶液中的蛋白質，是在最接近分子自然生理狀態

11、的條件下進行測定。生理狀態的條件下進行測定。 維特里希設計了一套將核磁共振信號與生物大分子維特里希設計了一套將核磁共振信號與生物大分子中的質子相對應的系統分析方法。中的質子相對應的系統分析方法。他他進一步說明這些質進一步說明這些質子間的距離如何確定，再結合距離幾何學的數學方法就子間的距離如何確定，再結合距離幾何學的數學方法就可獲得大分子清晰的三維結構圖。可獲得大分子清晰的三維結構圖。 瑞士科學家瑞士科學家庫爾特庫爾特維特里維特里希，獲希，獲2002年諾年諾貝爾化學獎貝爾化學獎 如果確定了一座建筑物的所有工程數據，就可以快速而如果確定了一座建筑物的所有工程數據，就可以快速而準確地繪出該建筑物的三

12、維結構圖。準確地繪出該建筑物的三維結構圖。 核磁共振技術方法解決了核磁共振技術方法解決了“看清看清”生物大分子生物大分子“是什是什么樣子么樣子”的問題。的問題。生物大分子的分離與檢測生物大分子的分離與檢測 生物大分子通常來自天然產物或發酵液中，并以混生物大分子通常來自天然產物或發酵液中，并以混合物、低濃度的狀態存在。合物、低濃度的狀態存在。 除了分子量大，還具有結構復雜（具三級或四級結除了分子量大，還具有結構復雜（具三級或四級結構），具有生物活性，一旦條件不適合就喪失活性，因構），具有生物活性，一旦條件不適合就喪失活性，因此在分離技術上與一般的小分子有機物的分離有差別。此在分離技術上與一般的小

13、分子有機物的分離有差別。質譜質譜色譜色譜色譜法色譜法 由液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳等所組成的色譜學由液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳等所組成的色譜學是現代分離、分析的主要組成部分。是現代分離、分析的主要組成部分。 液相色譜與毛細管電泳技術是目前已知的兩種最有效的分液相色譜與毛細管電泳技術是目前已知的兩種最有效的分離生物大分子的方法。離生物大分子的方法。 毛細管電泳處理量小，在分離過程中會破壞生物大分子的毛細管電泳處理量小，在分離過程中會破壞生物大分子的構象、降低其生物活性。構象、降低其生物活性。 液相色譜一般在室溫下進行，所用流動相為液體，固定相液相色譜一般在室溫下進行，所用流動相為液體，固

14、定相的表面經過各種化學修飾，能為生物大分子的分離提供的表面經過各種化學修飾，能為生物大分子的分離提供“軟接軟接觸觸”的溫和相互作用，因此成為分離生物大分子強有力的手段。的溫和相互作用，因此成為分離生物大分子強有力的手段。膜色譜技術膜色譜技術 膜色譜技術是液相色譜與膜分離相結合的一種新技術，融膜色譜技術是液相色譜與膜分離相結合的一種新技術，融合了二者之長，具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點，合了二者之長，具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點，能滿足生物大分子高效分離與純化的需要。能滿足生物大分子高效分離與純化的需要。 膜色譜采用具有一定孔徑的膜作為介質膜色譜采用具有一定孔徑的膜作為介質

15、, ,連接配基連接配基, ,利用膜利用膜配基與生物大分子之間的相互作用進行分離純化。配基與生物大分子之間的相互作用進行分離純化。 當料液以一定流速流過膜的時，目標分子與膜介質表面或當料液以一定流速流過膜的時，目標分子與膜介質表面或膜孔內基團特異性結合，而雜質則透過膜孔流出，待處理結束膜孔內基團特異性結合，而雜質則透過膜孔流出，待處理結束后再通過洗脫液將目標分子洗脫下來，其純化倍數可達數百乃后再通過洗脫液將目標分子洗脫下來，其純化倍數可達數百乃至上千倍。至上千倍。膜色譜特點為膜色譜特點為: :優點：優點： (1)(1)生物大分子在膜介質中以對流傳質為主，分離速度生物大分子在膜介質中以對流傳質為主，分離速度快，特別適用于生物大分子的快速分離快，特別適用于生物大分子的快速分離 (2)(2)柱壓低柱壓低 (3)(3)易于放大，只要簡單的增加柱長就可以達到目標易于放大，只要簡單的增加柱長就可以達到目標 (4)(4)可直接處理復雜的生物樣品，幾乎不需要與處理可直接處理復雜的生物樣品，幾乎不需要與處理 (5)(5)膜基質生物兼容性好膜基質生物兼容性好缺點：缺點： (1)(1)柱效低柱效低 (2)(2)耐壓性差耐壓性差現代分離制備技術課程論文備選題現代分離制備技術課程論文備選題1 1. .物