1、2021/6/161磁珠純化的原理磁珠純化的原理2021/6/162膠回收膠回收玻璃奶法玻璃奶法玻璃奶的制作1.石英砂磨成325目的玻璃粉（研磨2小時(shí)左右）;粉末顆粒的大小，指的是粉末可以通過(guò)325目的篩網(wǎng)2. 50克玻璃粉懸于加有200mL蒸餾水的燒杯中,攪拌混勻后,靜置90min;3.將上清轉(zhuǎn)移至離心管中6000g離心10min;4.倒掉上清,將玻璃粉重懸于1.5mL 25%的硝酸中,室溫放置過(guò)夜; （新購(gòu)置的玻璃器皿含有較多的游離堿，需要在酸中浸泡數(shù)小時(shí)，浸泡后再?zèng)_洗干凈）5. 6000g離心10min,沉淀玻璃粉;6.倒掉上清,將玻璃粉用無(wú)菌雙蒸水洗滌4-6次,直至pH值中性;7. 用

2、無(wú)菌雙蒸水重懸玻璃粉,配成50%勻漿;8.等分成100l樣品, 貯存于-70;待用的樣品可貯存于-20或4.2021/6/163切取目的DNA條帶溶膠結(jié)合玻璃奶離心沉淀玻璃奶洗脫DNA漂洗玻璃奶操作步驟操作步驟2021/6/164原理原理 玻璃奶(Glassmilk) 是一種白色硅顆粒，能結(jié)合0.2kb至50kb大小的DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀或超螺旋）。 DNA與玻璃奶結(jié)合原理 在高鹽狀態(tài)下，玻璃奶周圍的負(fù)電荷被打破，并允許DNA的磷酸負(fù)電荷與玻璃奶特異性結(jié)合。在低鹽（H2O或1TE）時(shí)溶解分離。 鹽濃度 DNA100bp:低鹽狀態(tài)下結(jié)合率高。 pH值 pH7.0:結(jié)合率高。2021/6

3、/165磁珠種類磁珠：磁珠：超順磁性納米顆粒硅磁（硅磁（Magnetic Silica Particle）：）：磁珠微珠表面包裹一層硅材料，來(lái)吸附核酸，其純化原理類型于玻璃奶的純化方式。氧化硅羥基磁珠：氧化硅羥基磁珠：此種微球具有核殼結(jié)構(gòu)，即超順磁性核心及無(wú)機(jī)氧化硅外殼，表面修飾大量硅烷醇基團(tuán)。硅烷醇基團(tuán)（羥基）在chaotropic（如鹽酸胍、異硫氰酸胍等）存在的條件下，能夠和溶液中的核酸通過(guò)疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發(fā)生特異性結(jié)合，而不與蛋白和其他雜質(zhì)結(jié)合。氧化硅羧基磁珠：氧化硅羧基磁珠：該磁珠表面修飾有羧基官能團(tuán)，能夠在特殊化學(xué)試劑（如EDC）的作用下將蛋白、寡聚核苷酸等生物配體共價(jià)

4、偶聯(lián)到磁珠表面，可應(yīng)用在蛋白純化、核酸純化、親和層析、細(xì)胞分類篩選、免疫測(cè)定分析和臨床診斷等多個(gè)生物領(lǐng)域。SA磁珠（磁珠（Fe3O4/SiO2/SA)：利用生物納米表面技術(shù)，使重組Streptavidin高密度定向包被到超順磁性微球表面，其在表面的包被密度高達(dá)9.31013 moleculescm-2，排列均勻，并朝向一致。產(chǎn)品具有較高的生物素結(jié)合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附率，每毫克磁珠結(jié)合游離生物素的量可達(dá)到1200 pmol以上。2021/6/166磁珠品牌Agencourt Bioscience Corporation（Beckman Coulter Company） Agenc

5、ourt AMPure XP beadsBruker Daltonics GenoPure ds Genopure oligo（single-stranded DNAs）Macherey-Nagel NucleoMag 96 PCROmega Mag bind NGS Clean-IT 96 KitNEB NEBNext Oligo d(T)25 Magnetic Beads NEBNext Protein A Magnetic Beads Agilent Streptavidin T1 magnetic beads2021/6/167磁珠選擇大小樣品起始樣品起始100l，0.55去除大片段后

6、去除大片段后155 l，0.16largetargetWhat plays the role in size selection is not AMPure beads, but its buffer.2021/6/168磁珠選擇大小stock buffer: 20% PEG 8000, 2.5M NaCl, Tris2021/6/169磁珠選擇大小Roche2021/6/1610磁珠選擇大小12 l product was mixed with 12 l of 12p XP beads and incubated at RT for 6 minutes. The supernatant wa

7、s then mixed with 12 l of AMPure XP beads and 5 l of 40% of PEG8000 and eluted with 10 l of nuclease-free water, it was then again purified using 12 l of AMPure XP beads and eluted in 30 mL of EB buffer.For size-selection using the SPRI beads, we replaced the stock buffer of AMPure XP beads with a 12% PEG-8000 and 2.5 M NaCl solution (12p XP buffer). One mL of Ampure XP beads were placed on a magnetic stand and left for 10 minutes. Thesupernatant was then removed and the beads were washed twice with ultra-pure water and