1、PCR技術的應用1、PCR技術在分子生物學中的應用一：基因克隆 基因的克隆和分離是分子生物學和細胞生物學研究中必不可少的手段。運用PCR技術進行基因克隆和亞克隆比傳統的方法具有更大的優點。由于PCR可以對單拷貝的基因放大上百萬倍，產生微克(pg)級的特異DNA片段，從而可省略從基因組DNA中克隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切、連接到載體DNA上、轉化、建立DNA文庫及基因的篩選、鑒定、亞克隆等煩瑣的實驗步驟。二：重組PCR在分子生物學研究中常常需要將兩個不同的基因融合在一起。通過PCR反應可以比較容易地實現這一目的。三：DNA序列的測定 目前廣泛采用的DNA測序方法有化學法和雙脫氧法兩種

2、，它們對模板的需要量比較大。傳統的模板制備方法是將含目的基因的DNA片段進行酶切，建立基因庫，篩選克，并亞克隆到M13噬菌體載體上，經噬菌體產生單鏈DNA。這是一項比較復雜的工作。利用PCR方法可以比較容易地測定位于兩個引物之間的序列。四：用于基因定量應用PCR技術可以定量監測標本中靶基因的拷貝數，這在研究基因的擴增等方面具有重要意義，這種方法稱為差示PCR(differential PCR)。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于同一個試管中進行PCR擴增。電泳分離后呈兩條區帶，比較兩條區帶的豐度；或在引物5端標記上放射性核素后，通過檢測兩條區帶放射性強度即可測出目的基因的拷貝數。利用差示

3、PCR還可以對模板DNA(或RNA)的含量進行測定，在一系列PCR反應中，分別加入待測模板DNA和參照DNA片段。參照DNA片段基本上按待測DNA的方式進行構建，但增加了一小段內部連接順序，這樣使得兩種DNA片段的PCR產物可在凝膠電泳上分開。由于這兩種不同的DNA片段可以在同一種寡核苷酸引物作用下同步擴增，因此可以避免因使用不同的引物所引起的可能誤差。這兩種擴增產物的相對量就反應了在起始反應混合物中的目的DNA和參照DNA的相對濃度。 利用差示PCR同樣可以做mRNA的定量。與DNA模板含量測定基本相似，所不同的是首先應提取總RNA，加入一個與mRNA 3 7區互補的引物，在逆轉錄酶的作用下

4、，合成cDNA，其余的操作與DNA定量相同。利用PCR可以對tuRNA(如進行性肌萎縮蛋白mRNA)作比較準確的定量，甚至連Northern印跡雜交未能發現的1TIRNA都可以得到檢測。2、PCR技術在傳染病病原體檢測中的應用 PCR是一種具有高敏感性、且特異性好的靶DNA快速檢測方法，能對前病毒或潛伏期低復制的病原體特異性靶DNA片段進行擴增檢測，只要標本中含有lfg靶DNA就可檢出。可檢出經核酸分子雜交呈陰性的許多標本，而且對標本要求不高，經簡單處理后就能得到滿意擴增。可做到早期及時診斷，對防止傳染病流行有重要意義。3、PCR在腫瘤相關基因檢測中的應用 寡核苷酸探針雜交法 限制性內切酶切片

5、段長度多態性(RFLP)技術 PCRRFLP技術 RNA酶A錯配清除法 核酸序列分析法4、PCR技術在遺傳病早期診斷中的應用 基因診斷技術的發展是現代醫學發展的一個重要標志，它從基因水平開辟了診斷學新領域。聚合酶鏈反應(PCR)技術是基因診斷主要技術之一，以PCR為基礎的各種分子生物學新技術在遺傳病的基因診斷等方面得到廣泛的應用。 由于PCR技術具有高特異性、高靈敏度、操作快速、簡便、對樣本要求低等特點，加之它能與多種分子生物學技術配合使用，PCR技術日益成為遺傳病診斷、發病機理的研究等方面最有效、最可靠的方法之一。PCR技術的出現為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了新途徑 5、PCR在骨髓移植

6、HLA-D位點配型中的應用 HLADRp位點配型方法，即PCR指紋圖，該技術是的DNA經PCR擴增HLADR盧區基因的高度多態區域，在分別擴增后將供、受者產物混合，混合后進行2個PCR循環，擴增產物經12的聚丙烯酰胺凝膠電泳，照相后分析不同個體的指紋圖型。當HLA-DRfl基因相合時，其基因產物在聚丙烯酰胺凝膠中可產生一致的帶型，這種多條帶型的產生是由于各種HLA單倍體中的HLA-DRfl基因的不同亞型以及假基因上的多態性所致。當PCR最后兩個匹配循環退火時，這些基因的單鏈DNA復性，DRfl基因相同的個體形成同型雙鏈，而不同的DRfl基因之間的不同序列形成異型雙鏈，因此，混合匹配可進一步證實

7、HLADRfl是否相合。6、PCR技術在法醫學鑒定中的應用 PCR技術用于生物物證的分析，與RFLP技術相比，具有操作簡單、省時、成本低廉的優點，還可避免同位素分析所帶來的一系列問題，如放射性污染、操作時的人身防護以及材料來源困難等。近年來，在PCR技術基礎上，又發展了許多基因位點分型系統，用于法醫物證的DNA分析，其中發展最為完善并得到公認的是HLADQa位點的分型系統，此系統應用PCR技術擴增HLADQa基因特異片段，結合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術檢測HLADQa位點的4個等位基因，有特異性好、靈敏度高、結果穩定可靠等優點，成為國際上法醫科學中應用PCR技術進行個人識別和親子鑒定最有效的方法。7、PCR在進化分析中的應用 rRNA基因有“化石”之稱，PCR擴增并分析其序列，可分析比較界或門分類水平上的生物。通常，細胞核小亞基r