1、WS/T 230-2002 臨床診斷中聚合酶鏈反應(PCR)技術的應用Guidelines for use of polymerase chain reaction(PCR) technique in clinical diagnosis1范圍    本標準規定了臨床診斷中聚合酶鏈反應(PCR)技術的應用準則。    本標準適用于各級，各類的醫療、衛生、保健機構應用PCR技術進行臨床診斷。2定義    本標準采用下列定義。2.1引物primer    與待擴增靶DNA片段兩端

2、互補的寡核昔酸，其本質是單鏈DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能進行延伸，從而合成新的互補鏈。2.2模板template    待擴增的靶DNA或RNA鏈，包括人類基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、eDNA和mRNA、擴增后的DNA產物等幾乎所有形式的DNA或RNA。2.3變性denaturation    DNA或RNA由雙鏈轉變為單鏈狀態，加熱、提高pH或加入甲酰胺、脲等試劑都可使雙鏈DNA或RNA發生變性。2.4  退火annealing    引物與互補的核苷酸序列在合適

3、的溫度下通過氫鍵形式相互結合的過程。2.5  延伸  extension    在合適的條件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引導引物DNA鏈延伸的合成過程。2.6  污染  contamination    由來源子非待測樣品的核酸所引起的一個樣品、一系列樣品或試劑的非特異性擴增或擴增后在產物分析過程中造成的樣品之間的污染，污染通常引起假陽性結果。2.7  遺留污染  carry-over contamination    同一類靶序列上一

4、次PCR擴增產物對以后擴增反應的后續污染。2.8  內對照  internal control    在同一反應混合物體系中與待測靶核酸同時進行擴增反應的已知對照物。2.9 Taq DNA聚合酶  Taq DNA polymerase    一種耐熱的DNA聚合酶，最初是從美國黃石國家公園溫泉中存在的水生棲熱菌(Thermu$ aquati-cus)中分離獲得，Taq酶最適活性溫度在70 80，能耐受PCR變性過程中的高溫，是目前PCR擴增反應中經常使用的DNA聚合酶。2.10抑制物干擾物inhibiti

5、on/interference    臨床樣品中能導致假陽性或假陰性擴增的內源性物質（如血液中的某些成分，痰液中的酸性多糖、尿液、體液等）和外源性物質（如滑石粉、抗凝劑等）。2.11  dNTP deoxynueleotide triphosphate    三磷酸脫氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。在PCR擴增反應中，作為反應底物聚合形成新的DNA鏈。2.12熱循環儀thermocycler    在PCR或其他需要在反應過程中轉換溫度的體系中用來保證溫度準確快速

6、轉換的設備。3用途    對目前已有穩定、可靠的微生物學和免疫學方法檢測的疾病或病原體，不推薦應用PCR進行檢測。例如，大多數的細菌感染通過細菌培養34天即可報告并明確藥敏結果；對甲型肝炎病毒等的感染。通過對其抗原或和抗體的檢測也可明確診斷。對于目前尚無其他實驗室診斷技術或現有的診斷技術不成熟、敏感性太低、不能及時準確地反映感染情況的疾病，可推薦應用PCR技術進行檢測。如丙型肝炎病毒的感染，檢測其抗體不能做到早期診斷、也不能表明血清中有無病毒的存在，又如結核桿菌的感染，培養需23個月，耗時太長，影響診斷，對此類病原體，PCR檢測有其獨到的優點。 

7、0;  PCR臨床實驗根據其應用的不同可分為三個互相交叉的類型t“過篩實驗”，“診斷實驗”、“驗證實驗”。3.1過篩實驗    過篩實驗適用于數目較大的群體，可能大部分元癥狀（疾病的流行性可能很低）。一個陽性結果并不能確定病原微生物的流行或反映某種疾病狀態，它只能提示有必要作進一步的檢測。較高的診斷敏感性和陰性可信度是過篩實驗最重要的特性。3.2診斷實驗    診斷實驗用于當地某種疾病流行率很高、疑診患有某種疾?。ɑ蛱禺愋愿腥荆┑娜后w，特異性靶基因（或病原體）的有無對診斷和治療有重要意義。因此，要求在保證實驗特異性的情況下-

8、敏感性盡可能地高。3.3驗證實驗    對于過篩實驗或診斷實驗為陽性的情況，驗證實驗可作為其補充實驗，用于確診。特異性和陽性可信度是驗證實驗最重要的特性。4方法4.1  引物序列的選擇    引物的設計是在模板序列中挑選出兩段寡核苷酸片段，使其能有效地擴增模板。模板序列的選擇隨著檢測的不同而不同，但也有一些共同之處，如：1）模板序列應是特異的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部分），模板序列的選擇應避免核苷酸重復片段區I2）模板序列在某些情況下需要的是種屬內部的保守區、非保守區（尤其是引物部分）或屬內特異區。

9、60;   選擇合適的引物是保證PCR擴增特異性和敏感性的關鍵。首先，對應用于臨床診斷的PCR。在設計引物時，其靶核酸的序列一定是已知的，這些基因序列信息可從基因數據庫（如GenBank）中獲得。雖然引物的設計在一定程度上依靠經驗，尤其是目前已有多種計算機軟件可應用于核苷酸的序列分析和PCR引物的設計，但引物的適用性尚需通過實驗性研究加以確定。PCR引物設計一般遵循以下基本原則：    a)引物的長度一般為1530個堿基；        b)兩引物相距的距離以100300核背酸為最優，

10、這樣可獲得較佳的擴增效果；    c)引物內堿基應盡可能隨機分布，避免出現嘌呤或嘧啶堆集現象，引物中GC含量宜在40%60%左右；    d)引物內部不應有二級結構，兩個引物之間、尤其在3端的序列不應互補；    e)引物3端與模板一定要互補，末端堿基不要出現多個A。4.2常規PCR實驗方案4.2.1材料    模板DNA (102105拷貝)    上游引物    下游引物    Ta

11、q DNA聚合酶和濃縮反應緩沖液    氯化鎂(MgCl2)    無DNA酶(DNase)的水    無DNase礦物油    dNTP混合物(含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)4.2.2擴增反應（一般情況下，每50 L反應體積所含組分如下）：    成分                &

12、#160;   終濃度    無DNase的水      將反應體積補足至50L    濃縮反應緩沖液    1×工作濃度    dNTP混合物       各0.2 mmol/L    Taq DNA聚合酶    0.51.0 U/50 L  &#

13、160; 氯化鎂(MgCI2)    1.5 mmol/L    上游引物         1 mol/L    下游引物         1mol/L    模板            102105拷貝/50

14、L。    每個反應管加12滴(20L40L)無DNase的礦物油，根據適合各個PCR反應的擴增參數，按變性、退火、延伸三步驟的熱循環程序進行擴增反應。4.3 PCR擴增產物的分析    擴增產物的分析，根據研究對象和目的的不同可采用不同的分析方法，瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等可幫助判斷擴增產物的大小，有助于擴增產物的鑒定點雜交還有助于對擴增產物進行基因分型（如HLA-DQ分型）；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異性產物的大小，因此，可增加檢測的特異性和敏感性。其他一些方法，如微孔板雜交、PCR-酶聯免疫吸附實驗(

15、ELISA)等均有助于產物的精確分析。4.3.1凝膠電泳    這種方法是根據帶負電的DNA可以在pH中性的緩沖液巾向陽極遷移的原理而建立的，凝膠基質可以是瓊脂糖或聚丙烯酰胺等，核酸的遷移率與瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的濃度、電流、離子強度以及溫度等因素有關。電泳后，通過溴化乙啶(EB)染色，在紫外下可以清晰地觀察到PCR擴增產物條帶，但擴增產物的特異性必須用探針雜交等方法加以鑒定。4.3.2點雜交法    點雜交法的基本過程是t首先將擴增產物固定到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用核素或非核索標記的探針進行雜交，由于核素有較大的放射危害性，現

16、在多用非核索進行探針標記，如生物寨、熒光素、酶及化學發光劑等州玉可在反應時直接摻入地高辛或生物素標記的單核替酸，然后將擴增產物固定，再用抗地高辛抗體或親合索進行反應來檢設4靶序列。    4.3.3微孔板夾心雜交法    該方法是通過固定子微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域進行特異性雜交，使擴增產物間接地固定于微孔板上，然后，再用生物泵等非核紊標記的檢測探針與擴增產物的另一區域雜交，漂洗、顯色后即可判斷結果。4.3.4 PCR-ELISA    將引物的5，端用生物素或異硫氰酸熒光素(FITC)等修飾

17、后并不影響其擴增特異性靶核酸的特性，因此，可以通過修飾其中一個引物的5端使其攜帶便于PCR產物被捕獲、固定的功能基團（如生物紊）。而通過另一引物5，端的修飾(如FITC)使產物便于檢測，這樣避免了電泳和雜交等步驟，適于常規檢測。4.3.5其他    如限制性內切酶長度多態性分析(Restriction-fragment-length-polymorphism，RFLP)、核苷酸序列分析等。5樣品的收集、運輸、處理和存放    正確的樣品收集、運送和保存是十分重要的。雖然PCR檢測對上述環節的要求與傳統的微生物培養和血清學檢測基本相同，

18、但在許多情況下仍有其特殊性。即無論在什么情況下都至少應保持靶核酸的完整性，樣品中的干擾物應能被充分稀釋，使其不致于干擾檢測。5.1樣品的收集    實驗室對每項特定的PCR檢測都應制定并為臨床提供詳細的樣品收集規則。5.1.1樣品收集的時間    在某一疾病的病程中，樣品收集過早或過遲都會導致假陽性或假陰性結果，因此。要注意樣品收集的時限性或時效性。5.1.2收集場所的準備    樣品的收集場所應要求避免細菌污染并去除可能造成污染的物質，樣品的收集需由經過專門培訓的工作人員來完成。5.1.3樣品的類型和數

19、量    樣品的類型、數量應是一定的，它們可能與常規微生物學、血清學實驗的要求相同或不同，這是由疾病病原體的不同特性決定的。一般而畝，如果所收集的樣品可以進行培養，那么提取核酸進行擴增分析也是可行的。5.1.4樣品的質量    樣品的質量可根據以下一種或幾種方法進行評估：肉眼觀察、顯微鏡檢查或化學分析。評估其細胞組成、細胞數目、核酸總量等。5.1.5樣品的收集運輸裝置    樣品的收集需采用一次性材料，樣品的收集材料（如拭子、試紙）或試劑（如防腐荊、抗凝劑或其他常規添加劑）必須不會干擾擴增或檢測過程，抗凝

20、劑一般采用乙二胺四乙酸鹽(EDTA)或枸櫞酸鹽，肝索對擴增反應有一定的抑制作用而且在以后的靶核酸提取中不易除去，應盡量避免使用l對游離的核酸，需滅活核酸酶使其穩定。靶核酸（如DNA）應能從收集裝置中釋放出來，另外，收集、運輸過程中某些介質可能會稀釋樣品，因此，必須考慮稀釋對測定結果的影響。5.1.6樣品的核對    收到樣品后，應對病人姓名、樣品類型、收集時間等進行詳細核對。5.2樣品的運輸    樣品收集后應盡快送至實驗室進行檢測，運輸過程中，特別是在需要保持細胞的完整性時，應注意避免樣品的過冷或過熱，并盡量減少細菌等污染物的生長，

21、而且必須保證樣品巾的靶核酸免受內源性或外源性核酸酶的破壞與降解；游離核酸需經穩定化處理，靶核酸為RNA時要求更為嚴格（如對靶核酸為RNA的樣品可加入異硫氰酸胍鹽滅活其中的核酸酶），不同的實驗對運輸方法都有其特殊要求，應明確加以規定。5.3樣品的處理    樣品中的許多雜質能抑制Taq DNA聚合酶的活性，從而干擾擴增反應，樣品的處理可去除這些干擾雜質，增加PCR擴增的成功率和可重復性，有利于檢測的標準化，純化樣品中的核酸(DNA或RNA)，可使待測核酸暴露，有利于與引物的退火。5.3.1靶核酸的釋放    待擴增的靶核酸可能來源于不同

22、的臨床樣品，如血液、體液、尿液、糞便、游離的細胞或組織塊等。靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。如病原微生物的靶核酸可存在于宿主細胞內與宿主DNA整合在一起、游離子宿主細胞核中或以各種形式存在于宿主細胞質中。而且，臨床樣品中常含有蛋白、脂類等干擾物質，因此，在進行PCR擴增前，必須對樣品進行預處理，實驗中應根據靶核酸不同的存在狀態，采取相應的處理方法。承3.2靶核酸的分離    經典的核酸提取方法包括去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及醇類沉淀等步驟，利用玻璃粉、二氧化硅及硅藻等具有吸附核酸特性的固體顆粒建立的核酸提取方法可以簡單、快速、高效地提取適合于PCR擴

23、增的靶核酸，目前已有許多商品化的核酸分離試劑盒可供選擇。5.3.3靶核酸的質量    用于擴增的靶核酸序列必須是完整的，將制備的樣品與標準品通過凝膠電泳進行比較即可初步判斷靶核酸的完整性和含量，也可通過測定260 nm和280 nm波長下的吸光度確定提取的靶核酸的濃度和純度。5.3.4處理過程的復雜性    樣品的處理應盡量簡化，以減少樣品的交叉污染或丟失靶核酸的機會。5.3.5樣品的生物安全性    樣品中可能含有對人體有害的生物因子，處理過程中應注意防止其危害操作人員f對臨床樣品的處理，可參照實驗室對

24、臨床樣品的常規處理方法進行。5.4樣品的存放    臨床用于PCR測定的DNA靶核酸樣品應在一定的緩沖液(如1×TE)中4保存lRNA靶核酸樣品應在一定緩沖液中80或液氮中存放。用乙醇或異丙醇等沉淀的靶核酸樣品存放在20即可。6污染的預防和控制    由于PCR的擴增高效性和檢測的高敏感性，極微量的污染即可導致假陽性結果，因此，必須特別注意避免樣品DNA的污染所導致的假陽性結果。PCR的污染途徑主要有三個：    a)來自其他待測樣品DNA的交叉污染；    b)來

25、自其他實驗材料如克隆質粒或菌體DNA的污染；    c)來自同一靶序列上次PCR擴增產物的污染。    其中由同一靶序列上次PCR擴增產物所引起的污染（遺留污染）最為常見，必須制定嚴格的實驗室標準操作規程(standard operation procedure，SOP)以減少污染所致的假陽性結果。6.1劃分不同的操作區    PCR的前處理和后處理應在不同的隔離工作臺（生物安全柜）或房間內進行，整個操作流程要在不同的隔離區進行：1）試劑準備和儲存區；2）樣品處理區；3）PCR擴增區；4）產物分析區。雖然

26、上述操作是分開的，但是還要注意儀器設備和耗材的專用及操作人員、物流的單方向流動。如使用擴增反應和產物檢測同時完成的熒光定量PCR方法或全自動PCR分析儀時，3）、4）兩個區可以合并。6.2分裝試劑    試劑的分裝是預防、控制PCR污染的一項重要措施。PCR所用的去離子水和緩沖液均應經過高壓滅菌，由于引物和dNTP不能高壓，一定要用高壓過的去離子水進行配制，所有這些試劑均應在無待測樣品和PCR擴增產物的試劑準備和儲存區進行制備，分裝貯存；同樣，用于PCR檢測的引物也應在以上環境中進行稀釋、分裝，每管標記批次。6.3改進實驗操作   

27、盡管上次PCR擴增產物的遺留污染是大多數假陽性反應的原因，但樣品之間的交叉污染也是污染的原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應時謹慎操作，在樣品處理的所有環節（從樣品收集到靶核酸提?。┒紤⒁?，下面幾點應格外引起重視：    a)加樣器最易受樣品核酸或擴增產物氣溶膠的污染，試劑準備、樣品準備和擴增產物分析等各步驟中的加樣器應嚴格分開使用；    b)戴一次性手套進行操作，在進出不同的隔離區時都要換手套；    c)避免反應液的飛濺，開蓋時尤應注意，可予開蓋前離心幾秒鐘使壁上和蓋上的反應液集于管底，一旦飛濺，

28、應立即更換手套；    d)用一次性移液器或吸頭進行操作，吸頭不要暴露于空氣，以預防擴增產物氣溶膠的污染；    e)在操作多份樣品時，要制備反應混合液，先加可混合的組分(dNTP、緩沖液、引物和酶等)，混合后再分裝到不同的反應管，這樣，可以減少操作，避免污染，增加反應的重復性；    f)最后加入模板，加入后立即益緊反應管；    g)用過的加樣器吸頭必須放人專門的消毒（如含次氯酸鈉溶液）的容器內，實驗桌椅表面每次工作后都應進行清潔，實驗材料如出現外濺則必須作出記錄。6.4

29、設立陽性與陰性對照    選擇陽性對照時，應選擇特異性擴增條帶較弱、重復性較好的樣品；陰性對照應最后配制，這樣，可以反映擴增反應的基本狀況。此外，每次擴增均應設立包括PCR體系各試劑的空白對照，空白對照中應含有除模板核酸外的所有組分。6.5環境污染    常見的污染源包括：加樣器、離心機、真空瓶、電泳裝置、紫外燈箱、水浴鍋、冰箱門把手、門把手和實驗臺面（生物安全柜）、空氣氣溶膠等，各區的工作臺面工作前可先用0.5%次氯酸鈉、再用70%乙醇擦拭。6.6擴增產物的滅活及污染的處理    尿嘧啶DNA糖基化酶(

30、UNG)法；該法是在PCR反應中用脫氧尿嘧啶堿基(dU)置換脫氧胸腺嘧啶(dT)，這樣，擴增產物中含有幾十或幾百的dU，這種產物與UNG一起孵育后，因UNG可裂艇尿嘧啶堿基和戊糖磷酸骨架間的N。糖苷鍵，可除去dU，產生數十或數百的無dU堿基位點，無dU的位點阻止Taq DNA聚合酶的鏈延伸作用，使其失去再擴增的能力，而且，這樣的位點是熱不穩定的，在熱循環中會發生斷裂，防止再次擴增的發生，PCR擴增產物越長，UNG抗污染的效率就越高。UNG對不含dU的模板無任何影響，對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子也無任何作用。    光化學滅活：滅活PCR擴增產物另一個可選擇的

31、方法是應用可溶性的補骨脂素衍生物，這些化合物具有熱穩定性，對引物退火和Taq DNA聚合酶的活性無影響。擴增前，將補骨脂素衍生物加入到PCR反應混合液中，擴增后，在打開反應管盞之前，用長波紫外線照射，紫外線能穿透聚丙烯管。激活補骨脂素衍生物，補骨脂素衍生物隨后形成環丁烷，與擴增產物DNA上的嘧啶作用，形成帶有嘧啶堿基的環戊烷，阻止Taq DNA聚合酶對這一分子的進一步擴增，其效率取決于擴增產物的長度和核苷酸的堿基組成，一般而言，產物長度超過300bp、堿基G+C含量大于50%時，本法幾乎可滅活所有的擴增產物。和酶法滅活不同，該方法不僅可滅活擴增產物，而且可滅活原始的靶核酸。7質量控制 

32、;   進行PCR檢測的實驗室應經過檢查并符合國家行政部門的相關認證要求，由經過培訓的合格上崗人員進行操作。有條件的實驗窒還應積極參加各級質控機構和組織的室間質評活動，這樣，有利于對不同實驗室之間的檢測結果進行同比分析。7.1  擴增反應的質量控制  樣品準備的質量控制    設計一個樣品處理方法最先應考慮的問題是：能夠最有效地分離出靶核酸并避免導入抑制因子和污染物，避免靶核酸被核酸酶降解并除去干擾檢測的物質，設立這部分的對照必須能夠反映以下問題，即，在樣品中是否有靶核酸以及核酸的分離方式是否影響PCR反應。當驗證一個實驗系

33、統的樣品處理方法時，需要用含靶核酸的整個有機體、以接近預期的檢測極限濃度添加至陰性樣品基質中，這樣，所設立的對照可提供有關靶有機體溶解及靶核酸提取回收是否成功的有關信息，如果靶核酸存在于細胞內（如淋巴細胞），就應以整個細胞作為驗證樣品加入陰性基質中作為對照。7.1.2設立外對照  每次實驗至少應設有弱陽性對照和一份陰性對照，以確定擴增的有效性。7.1.3設立內對照    利用內對照可驗證每個單份樣品中是否含有核酸，例如人類的HLA-DQAI、-微球蛋白基因和其他一些保守序列，這些基因存在于樣品的有核細胞中，可將其與靶核酸擴增體系一起擴增。在設計擴增和檢測

34、基因突變時，可在突變區之外，同時擴增保守區序列作為對照。7.1.4設立平行組    兩份病人樣品，其中一份加入已知的核酸作為副本，加入量應臨近可檢測到的極限濃度，如果正本PCR結果為陰性，而副本為陽性，則可確定其陰性結果是真實的。7.1.5樣品的稀釋    對制備的樣品進行幾個稀釋度的稀釋，來檢測抑制因子的存在，當樣品稀釋后，檢測到的信號持續變強，說明有抑制因子存在，只要樣品中存在有抑制因子，就應考慮進行樣品稀釋。但樣品稀釋后靶核酸也被同時稀釋，因此，必須注意確保稀釋過程中靶核酸仍保持在具有臨床檢測意義的范圍之內。7.2抑制因子和干擾

35、物的質控    在臨床樣品中有多種成分通過與PCR反應組分發生作用，從而抑制PCR擴增反應。已知血紅素及其代謝物可抑制DNA聚合酶的活性，腦脊液、尿液中也含有成分尚未確定的DNA聚合酶的抑制因子，痰液中的酸性多糖、糖蛋白組分是聚合酶的抑制因子；臨床樣品中含有的核酸酶，會降解靶核酸。另外，許多分子生物學研究巾常用的試劑，如乙二胺四乙酸、去污劑（如十二烷磺酸鈉）、破膜荊（如鹽酸胍）等對DNA聚合酶的活性也有一定抑制作用，從而導致假陰性結果。    擴增反應的抑制因子可通過應用對照模板來進行檢測，必要時，這種對照模板可在樣品準備過程中加入（

36、如內對照），因此也可作為靶核酸提取過程的對照（見7.1.3）。設立內對照來監測是否存在抑制反應應根據實際需要而定，因為建立和應用這些內對照有相當的技術難度，并且可能會影響到整個實驗。7.2.1同源內對照    同源內對照基因與擴增的目的靶基因有相似的序列，它們通過分子大小的差別或內部序列的不同相互區別。同源內對照可以與目的靶基因二起應用相同的引物進行擴增，對照模板先加入到反應混合液中，每個反應提供10到1 000個拷貝，用同源引物進行擴增。但必須注意保證同源內對照的存在不能降低擴增體系的敏感性，假如一起擴增的內對照模板量太多的話，往往會降低目的基因擴增的敏感性。含

37、抑制物的樣品，如不支持對內對照的擴增，那么很可能也不會支持對靶核酸序列的擴增，樣品就應被視為不適于進行PCR擴增，或需要進一步處理以減少或清除抑制因子。通常簡單地將樣品稀釋就會降低，抑制因子的影響，此時要注意樣品不能過度稀釋，以致靶核酸被稀釋到檢測限度之下。7.2.2異源內對照    異源內對照不包含靶序列，需要用另一組獨立的引物來擴增對照基因。異源內對照通常采用人類HLA-DQAI和人類-微球蛋白位點基因，任意靶核酸一般都可滿足需要。對照組擴增產物的分子量應與目的靶基因大小相同或更大，以保證更小分子量的任何產物都能被成功擴增。7.3儀器的質量控制 &#

38、160;  所有的儀器設備都必須保持清潔并進行定期維護，所有的水浴裝置、培養箱都應貼有適當溫度范圍的質量控制表，記錄每天的溫度。在實驗室的質量保證(Quality Assurance，QA)手冊中應有儀器校對的操作方法。  a)加樣槍，加樣槍必須保證每年校正兩次，校正方法可參考生產廠商推薦的方法或采取吸樣稱重法；    b)水浴箱：實驗前用溫度計進行校準；    c)離心機：離心機的速度每年應檢查兩次，離心機可能是污染的重要來源，應注意采取必要的預防措施；    d)酶標儀：每年進行兩

39、次校準；    e)熱循環儀：目前各實驗室使用的熱循環儀有許多不同的種類和型號，可根據生產廠商推薦的方法進行校正，一年內至少對儀器校正兩次I除儀器的自檢功能外，應進一步進行循環參數的校正和功能性擴增實驗，對不同部位的加熱孔應保證其溫度的均一性。7.4校正測試    校正測試是用來確保臨床實驗的可重復性和評價臨床實驗室的操作技能。每一個檢測臨床樣品的實驗室都需要作校正測試，并以此來確定實驗室能夠進行某一特定實驗的能力。每年應至少進行兩到三次校正測試，每次實驗的間隔要相等，每個實驗至少5個樣品，所提供的樣品必須覆蓋整個反應范圍，從強陽性反

40、應到陰性反應，由實驗室日常進行PCR檢測的實驗人員按實驗室的常規要求進行操作。一般來說，校正實驗所用樣品與臨床實驗室常規檢測樣品的類型應相同或組成成份相似，即全血、血漿、血清、尿、腦脊液或組織樣品等。校正測試樣品可以從相關部門（如各級室間質評機構和組織）獲得，如果沒有標準的校正測試樣品，已有的商品試劑盒中的對照樣品是一個重要來源。8結果的判讀、報告和解釋8.1一般考慮    與其他檢測方法相比，PCR的檢測下限很低，因此，應當明確如此低的檢測限度的臨床意義及結果的解釋標準，應對該疾病已經做過的其他實驗室檢測結果與PCR檢驗結果之間的一致性和差異性進行比較，闡明PC

41、R技術相對于其他實驗方法的優越性和PCR技術的合理應用等。例如，臨床樣品中結核桿菌的直接PCR檢測，仍需進行常規的涂片顯微鏡鏡檢和細菌培養來確定PCR檢測的敏感性，并鑒定不同種群的重疊感染。8.2不能確定的結果    PCR實驗和其他臨床實驗一樣，可能有不能確定的結果，這些結果將反映出樣品的質量以及實驗方法的影響。因此，對PCR擴增產物的檢測應當有一個明確的結果判讀方式，并對不能確定結果的樣品有適當的鰓釋和處理方法，例如，重復取樣、重復實驗或反向實驗等。在任何診斷實驗中，都會有很小百分率的健康人群的檢驗結果表現為陽性或異常，因此，重復實驗是一個經常應用的重要策略。

42、8.3結果的報告  雖然擴增實驗有嚴格的自身控制，但如果沒有經過細致的審查，錯誤結果還是會報告出來，審查人員應仔細檢查每一個待報告的結果。實驗步驟中必須包括結果的解釋標準，包括對不可確定結果的解釋標準，對已商品化的PCR診斷試劑盒，有關信息必須由生產廠商提供。臨床實驗室負責對本醫療機構內受試人群實驗結果的及時報告和解釋；臨床醫生在綜合考慮其他可利用的臨床信息后，負責對實驗結果的臨床解釋，臨床和實驗室的溝通對于實驗結果合理、有效的應用是十分重要的。8.4對不合格樣品的處理    如果實驗室收到的樣品不宜用于檢測，必須馬上通知樣品呈送單位，對運送方法不當、送

43、達時間過遲及數量不足的樣品應拒絕接收。8.5結果回報時間    實驗室應制定回報時間的規定，并對延誤報告的原因進行分析。附錄A（標準的附錄）定量PCR技術    定量PCR技術是在常規PCR原理的基礎上發展起來的新的核酸擴增技術，通過對靶核酸進行量化檢測來反映靶核酸量的變化與臨床疾病的關系，并可用于檢測疾病的發生、發展，考察治療藥物的療效等。A1定量PCR技術的方法學    定量PCR技術一般通過定量分析擴增產物的量的多少來判斷待測樣品中初始靶核酸模板的拷貝數，目前常用以下幾種方法對擴增產物進行量化檢測。

44、A1.1競爭性聚合酶鏈反應量化檢測核酸技術    基本原理：具有相同引物結合區的兩種模板在同一管中擴增可得到幾乎相同的擴增效果。初始含量多的模板，其擴增產物就多，兩種PCR擴增產物量與二者初始核酸模板含量的比值有相關性；其中一種核酸為已知含量的內參照模板，而另一種核酸為待測樣品，同時進行競爭性聚合酶鏈反應擴增，因為待測核酸與內參照擴增產物片段的大小或序列不同，因此可通過凝膠電泳或探針雜交等方法進行檢測，從而得到兩種核酸擴增產物的比值，而初始內參照的模板量是已知的。根據這些數據可以推算出待測核酸的初始含量。本方法將內參照模板與樣品靶核酸模板放在同一個試管內同時進行擴

45、增，保證兩者在同等的反應條件下，避免了管與管之間的差異，是一種靈敏度較高、能比較客觀反映樣品初始狀態時靶核酸模板含量的方法；但該方法由于存在內參照模板與樣品模板長度的差異以及最小二級結構不完全相同等影響因素，因此二者的擴增效率不可能完全一致。A1.2自動化熒光檢測法    擴增體系所采用的引物除具有退火、延伸功能外，還包含有兩段額外基因，一段為信號基因(re-porter)，單獨存在時可以發光；另一段為抑制基因(quencher)，其存在時可抑制信號基因的功能，不產生發光現象，在進行核酸擴增反應時，由于Taq酶具有一定的5端外切酶活性，可將引物上的信號基因切下、失

46、去抑制基因的抑制作用而產生熒光，每當一次擴增中一條引物被退火、延伸后，整個體系就會增加一個單位的熒光。該擴增儀在每一次擴增循環結束后都要通過熒光光度計進行掃描，由此可得出每一次擴增循環結束后產物的量。A1.3固相雜交酶免疫法量化檢測核酸擴增產物    使用酶免疫法(EIA)量化檢測核酸的擴增產物，是目前應用較為普遍的核酸量化檢測手段，如應用生物素標記引物，這樣在PCR反應結束后，擴增產物帶有生物素成分，隨后通過包被子酶標微孔板上的鏈親和素（包被蛋白）將PCR擴增產物捕獲到固相載體上，解鏈變性后加入FITC標記的特異性探針雜交成DNA雙鏈，再加入辣根酶標記的FITC抗體使底物顯色，通過顯色反應顏色的深淺來量化反映樣品中核酸模板的情況?；驅⑻禺愋蕴结槹蛔庸滔噍d體上（包被探針）。通過雜交反應將標記有生物素的產物固定在酶標微孔板上，再加入辣根酶標記的鏈親和素-利用顯色反應顯示待測樣品中核酸模板的情況。這兩種方法靈敏度較高、特異性好、可以避免因PCR非特異擴增引起的假陽性，結果準確可靠、成本不高，更有利于推廣和普及。但由于PCR體系不同管之間不同的模板提取效率、逆轉錄效率、擴增效率等因素的影響，酶標結果并不能完全客觀地表示模板含量，而且酶免疫顯色反應的線