1、技能訓練8 雞新城疫的診斷 掌握雞新城疫的臨床診斷和實驗室診斷的方法實訓目標疑似雞新城疫病死雞、剪刀、鑷子、病理剖檢記錄表、工作服、膠靴、圍裙、橡膠手套和來蘇兒等。911日齡SPF雞胚、恒溫箱、照蛋器、蛋盤、接種箱、注射器（15ml）、針頭、中號鑷子、剪刀、眼科剪刀和鑷子、毛細吸管、橡皮乳頭、滅菌平皿、試管、吸管（0.5ml、1ml、5ml）、酒精燈、試管架、膠布、蠟、錐子、煮沸消毒器、消毒劑（3%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸）、離心機、離心管、生理鹽水、96孔V型微量血凝集反應板、微量吸液器、混合振蕩器；1%雞紅細胞懸液、雞新城疫弱毒疫苗、雞新城疫標準陽性血清等。 儀器材料方法步驟（一）

2、ND的臨床診斷（二）ND的實驗室診斷（一）ND的臨床診斷 1按家禽尸體剖檢程序，首先檢查雞的體表組織，然后檢查皮下組織，最后打開體腔，暴露整個胸腔和腹腔器官，檢查內(nèi)部組織器官。雞新城疫主要檢查消化道病變。2將剖檢所見填寫于病理剖檢記錄表內(nèi)。3根據(jù)剖檢記錄，歸納分析進行初步診斷。 （二）ND的實驗室診斷 1病毒的分離培養(yǎng) 2病毒的鑒定 1病毒的分離培養(yǎng)（1）病料采集與處理分離病毒的材料應來自早期病例病雞撲殺后應用無菌操作采取脾、腦、肺、肝、腎等器官組織混合將病料制成1 51 10的乳劑，每毫升加入青霉素10000單位、鏈霉素10mg，以抑制可能污染的細菌置冰箱中作用24h，然后離心沉淀，取其上清

3、液作為接種材料。在這同時，應對接種材料作無菌檢查如有細菌生長，應將原始材料再作除菌處理，也可改用細菌濾器過濾除菌。 （2）雞胚接種 用911日齡的SPF雞胚（如果沒有SPF雞胚，也可用非免疫雞胚），將上述處理過的材料，取0.10.2ml接種于尿囊腔內(nèi)。接種后以熔化的石蠟將卵殼上的接種孔封閉，繼續(xù)置溫箱內(nèi)。每日上下午各照蛋一次，連續(xù)觀察5d，接種24h內(nèi)死亡的雞胚，廢棄不用，于24h后死亡的雞胚，立即取出置4冰箱冷4h以上（氣室向上）。然后用無菌操作吸取尿囊液，并做無菌檢查，尿囊液渾濁應廢棄。留下無菌的尿囊液置低溫冰箱保存，供作進一步鑒定。在這同時可將雞胚傾入一平皿內(nèi)，仔細觀察病變。由新城疫病毒

4、致死的雞胚，胚體全身充血，在胚頭、胸、背、翅和趾部有小出血點，尤其以翅，趾部明顯，這在診斷上有參考價值。 2病毒的鑒定（1）微量血凝試驗（HA）（2）微量血凝抑制試驗（HI）（1）微量血凝試驗（HA） 一方面判斷分離病毒是否具有血凝性，另一方面確定HI試驗中所用抗原的HA滴度。用微量移液器向反應板每個孔分別加生理鹽水50l，共加12孔。換一吸頭吸取50l待檢病毒液，加于第1孔的生理鹽水中，并用移液器擠壓35次使病毒混和均勻，然后取50l移入第二孔，混勻后取50l移入第3孔，依次倍比稀釋到第11孔，第11孔中液體混勻后從中吸出50l棄去。第12孔不加病毒抗原，作對照。換一吸頭吸取1紅細胞懸液依次

5、加入112個孔中，每孔加50l。加樣完畢，將反應板置于微型振蕩器上振蕩1min。并放室溫（1820）下作用3040min，或置37恒溫培養(yǎng)箱中作用1530min取出，觀察并判定結(jié)果。結(jié)果判定及記錄“”表示紅細胞完全凝集。紅細胞凝集后完全沉于反應孔底層，呈顆粒狀，邊緣不整或鋸齒狀，而上層液體中無懸浮的紅細胞。“”表示紅細胞未凝集。反應孔底部的紅細胞沒有凝集成一層，而是全部沉淀成小圓點，位于小孔最底端，邊緣水平。“”表示部分凝集。紅細胞下沉情況介于“”與“”之間。新城疫病毒液能凝集雞的紅細胞，但隨著病毒液被稀釋，其凝集紅細胞的作用逐漸變?nèi)酢Ｏ♂尩揭欢ū稊?shù)時，就不能使紅細胞出現(xiàn)明顯的凝集，從而出現(xiàn)可

6、疑或陰性結(jié)果。血凝試驗（HA） 孔號試劑1239101112生理鹽水50505050505050病毒液5050505050501%的紅細胞50505050505050振蕩1min，置于室溫3040min，或置37溫箱1530 min 結(jié)果觀察（血凝價） 凝 不凝不凝 不滑 滑滑棄HA視頻用上述分離病毒制備4單位病毒，再用標準的陽性血清進行HI試驗。用微量移液器向112號孔中分別加入50l生理鹽水。 換一吸頭取標準陽性血清50l 置于第孔中，擠壓35次混勻，吸出50l放入第二孔中，然后依次倍比稀釋至第10孔，并將第10 孔的液體混勻后取50l棄去。第11孔為病毒對照，第12孔為鹽水對照。用微量移

7、液器吸取稀釋好的4個血凝單位的病毒抗原，向111孔中分別加50l。然后，振蕩1min，將反應板置室溫下作用20min， 或在37恒溫培養(yǎng)箱中作用510min。取出血凝板，用微量移液器向每一孔中各加入1紅細胞懸液50l，再將反應板置于微型振蕩器上振蕩1530s，混和均勻。將反應板置37 溫箱中作用1530min 后取出，觀察并記錄結(jié)果。（2）微量血凝抑制試驗（HI）結(jié)果判斷和記錄“”表示紅細胞凝集抑制。高濃度的新城疫抗體能抑制新城疫病毒對雞紅細胞的凝集作用，使反應孔中的紅細胞呈圓點狀沉淀于反應孔底端中央，而不出現(xiàn)血凝現(xiàn)象。“”表示紅細胞完全凝集。隨著血清被稀釋，它對病毒血凝作用的抑制減弱，反應孔中的病毒逐漸表現(xiàn)出血凝作用，而最終使紅細胞完全凝集，沉于反應孔底層，邊緣不整或呈鋸齒狀。“”表示不完全抑制。紅細胞下沉情況介于“”與“”之間。如果待檢抗體被標準陽性血清所中和，則確診為NDV。血凝抑制試驗（HI） 孔號試劑1239101112生理鹽水50505050505050待檢血清50505050504單位病毒505050505050振蕩1min，置于室溫20min，或置37溫箱中