1、西安交通大學(xué)西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院雷榮輝雷榮輝 主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容 1.發(fā)育毒性和致畸作用的基本概念 2.發(fā)育毒性和致畸作用的特點(diǎn)和影響因素3.發(fā)育毒性的劑量-反應(yīng)模式4.母體毒性與發(fā)育毒性5.發(fā)育毒性和致畸作用常用評價(jià)方法:動物發(fā)育毒性試驗(yàn)、流行病學(xué)研究、替代試驗(yàn)。 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 一、發(fā)育毒理學(xué)一、發(fā)育毒理學(xué)（developmental toxicologydevelopmental toxicology）：是毒）：是毒理學(xué)的重要分支學(xué)科，理學(xué)的重要分支學(xué)科，是是研究發(fā)育生物體在受精卵、研究發(fā)育生物體在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的發(fā)育過程中，由于妊娠期、

2、出生后、直到性成熟的發(fā)育過程中，由于出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的作用機(jī)制、發(fā)病原理、影響因素和毒物動力有關(guān)的作用機(jī)制、發(fā)病原理、影響因素和毒物動力學(xué)等。學(xué)等。畸胎學(xué)（古代）畸胎學(xué)（古代）現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)（現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)（1919世紀(jì)）世紀(jì)）發(fā)育毒理學(xué)發(fā)育毒理學(xué)從畸胎學(xué)到發(fā)育毒理學(xué)從畸胎學(xué)到發(fā)育毒理學(xué) 畸胎學(xué)畸胎學(xué)(Teratology）作為一個(gè)描述性的科作為一個(gè)描述性的科學(xué)學(xué)在有文字之前就已經(jīng)在有文字之前就已經(jīng)存存在了。最早可以追溯在了。最早可以追溯到到6500D.B。雜交理論雜交理論（Hybride theory） 認(rèn)為畸形是人

3、和動物雜交的結(jié)認(rèn)為畸形是人和動物雜交的結(jié)果并且這種雜交動物廣泛存在果并且這種雜交動物廣泛存在 于神話傳說中，如人頭馬身怪于神話傳說中，如人頭馬身怪物、人頭牛身等物、人頭牛身等。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)：現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)：始于始于19世紀(jì)，研究者注意到作世紀(jì)，研究者注意到作用時(shí)間在決定畸形類型方面比損傷的性質(zhì)更重要。用時(shí)間在決定畸形類型方面比損傷的性質(zhì)更重要。 從畸胎學(xué)到發(fā)育毒理學(xué)從畸胎學(xué)到發(fā)育毒理學(xué)物理（震動、物理（震動、倒置、針刺）倒置、針刺）化學(xué)因素化學(xué)因素雞蛋雞蛋畸形小雞畸形小雞神經(jīng)管缺陷、無腦畸神經(jīng)管缺陷、無腦畸形、脊柱裂、獨(dú)眼畸形、脊柱裂、獨(dú)眼畸形、心臟缺陷、位置形、心臟缺陷、位置顛倒、聯(lián)體雙胞

4、胎等。顛倒、聯(lián)體雙胞胎等。 反應(yīng)停（thalidomide）事件 孕婦的理想選擇？1953年，聯(lián)邦德國一家名為Chemie Gruenenthal的制藥公司研究人員發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)靜安眠藥反應(yīng)停對孕婦懷孕早期的妊娠嘔吐療效極佳。1957年10月1日該公司將反應(yīng)停正式推向市場。 反應(yīng)停便成了“孕婦 的理想選擇”（當(dāng)時(shí) 的廣告用語），此藥在歐洲、亞洲、非洲、澳洲和南美洲被醫(yī)生量處方給孕婦以治妊娠嘔吐。 科學(xué)家們在研制反應(yīng)停時(shí)并科學(xué)家們在研制反應(yīng)停時(shí)并沒有料到這種藥物會產(chǎn)生如沒有料到這種藥物會產(chǎn)生如此可怕的副作用此可怕的副作用。令人恐怖的副作用到了1960年，歐洲的醫(yī)生們開始發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)畸形嬰兒的出生率明顯

5、上升。這些嬰兒有的是四肢畸形（主要是雙上肢的短肢畸形），還有的是腭裂、盲兒、聾兒或內(nèi)臟畸形。西德的Lenz和澳大利亞的McBride兩人同時(shí)于1961年分別獨(dú)立確認(rèn)反應(yīng)停為誘發(fā)短肢畸形的病因。反應(yīng)停被迫從市場撤回，動物模型復(fù)制成功。其致畸劑量為1mg/(kg .d)，只要末次月經(jīng)后68周內(nèi)口服200mg反應(yīng)停便可引起嚴(yán)重的短肢畸形；服藥婦女還有流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等發(fā)生。(孕婦的口服劑量是50-200mg/d) 據(jù)推算，當(dāng)時(shí)全世界有700010000畸形兒是由反應(yīng)停所致。服用過量維生素引起的畸形維生素A每日服用5萬單位（相當(dāng)于濃縮A丸劑2丸、或濃縮魚肝油滴劑30滴），連續(xù)3個(gè)月，會使胎兒骨骼畸形、

6、并指、腭裂、眼與腦畸形、腎及中樞神經(jīng)損害。酒酒精精胎胎兒兒綜綜合合征征上述事件讓人們逐漸認(rèn)識到生物、物理、化學(xué)因素和不良生活嗜好都可引起人類畸形；尤其是反應(yīng)停事件的發(fā)生，大大推動了外源化學(xué)物致畸作用和發(fā)育毒性的研究及新藥發(fā)育毒理學(xué)研究和管理法規(guī)的建立。悲劇帶來的福音！悲劇帶來的福音！1966年美國食品與藥品管理局（FDA）提出三段生殖毒性試驗(yàn)指南，其中包括對致畸等發(fā)育毒性的評價(jià)。1986年美國環(huán)保局（EPA）提出可疑發(fā)育毒物危險(xiǎn)度評價(jià)指南，第一次明確提出要對化學(xué)物進(jìn)行發(fā)育毒性評價(jià)。從20世紀(jì)70年代起，我國已開始了對藥品、農(nóng)藥、食品添加劑和環(huán)境污染物的致畸研究，并把致畸試驗(yàn)、生殖毒性試驗(yàn)列為新

7、藥、農(nóng)藥、食品及首次進(jìn)口化學(xué)品的安全性毒理學(xué)評價(jià)的重要組成部分。 第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)育毒性與致畸性發(fā)育毒性與致畸性 一、基本概念一、基本概念 畸形（畸形（malformation）：指發(fā)育生物體解剖學(xué)上形：指發(fā)育生物體解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷。對態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷。對外觀外觀、生理功能和（或）壽命、生理功能和（或）壽命等等可產(chǎn)生有害影響，可以存活也可能死亡。可產(chǎn)生有害影響，可以存活也可能死亡。 致畸物（致畸物（teratogenteratogen）: : 致畸作用（致畸作用（teratogenic effectteratogenic effect）: : 致畸性致畸性（teratogenteratoge

8、nicityicity）: :是是由遺傳和遺傳外因素控制的外觀變化，或由于分化由遺傳和遺傳外因素控制的外觀變化，或由于分化改變而引起的差異。改變而引起的差異。指指在在同一同一種屬種屬的子代與親代之間或子代的個(gè)體之間，的子代與親代之間或子代的個(gè)體之間，有時(shí)出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象。有時(shí)出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象。例如肋骨或椎骨數(shù)目多于或少于正常，甚至某些內(nèi)臟易位都屬于變異。 2.變異變異u一般認(rèn)為變異不影響正常生理功能，更不危及生命。u但是在動物致畸試驗(yàn)中，如果某種變異出現(xiàn)較多，并呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系，應(yīng)該引起注意。2.變異變異廣義上包括孕體結(jié)構(gòu)和功能方面的各種損害，狹義廣義上包括孕體結(jié)構(gòu)和功能方面的各種損

9、害，狹義指孕體的死亡和生長發(fā)育遲緩，不包括結(jié)構(gòu)畸形。指孕體的死亡和生長發(fā)育遲緩，不包括結(jié)構(gòu)畸形。區(qū)分胚體和胎體兩個(gè)階段；區(qū)分胚體和胎體兩個(gè)階段；每個(gè)階段損害的主要特點(diǎn)。每個(gè)階段損害的主要特點(diǎn)。3.3.胚體胚體- -胎體毒性胎體毒性(embryo-fetal (embryo-fetal toxicity)toxicity)指出生前指出生前后接觸有害因素，后接觸有害因素，子代子代個(gè)體發(fā)育為個(gè)體發(fā)育為成體之成體之前前誘發(fā)的有誘發(fā)的有害害影響，主要表現(xiàn)為影響，主要表現(xiàn)為：發(fā)育生物體死亡發(fā)育生物體死亡生長生長改變改變結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)異常異常功能功能缺陷缺陷 4.4.發(fā)育毒性發(fā)育毒性（developmental

10、toxicitydevelopmental toxicity） 發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)發(fā)育生物體發(fā)育生物體死亡：包括受精卵未發(fā)育即死亡；胚泡未著床即死亡（早早孕丟失）；著床后發(fā)育到某一階段死亡。早期死亡被吸收或自子宮排出（自然流產(chǎn)）；晚期死亡成為死胎。 發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)v生長生長改變改變（altered altered growth growth ）: :生長遲緩，生長發(fā)育生長遲緩，生長發(fā)育指標(biāo)低于正常對照的均值指標(biāo)低于正常對照的均值2 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。 v結(jié)構(gòu)異常（結(jié)構(gòu)異常（structural abnormalitystructural abnorma

11、lity）: : 指胎兒形態(tài)結(jié)指胎兒形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，即畸形。構(gòu)異常，即畸形。 v功能缺陷（功能缺陷（functional deficiencyfunctional deficiency）: :即胎仔的生化、即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常。生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常。 5.5.出生缺陷（出生缺陷（birth defect)birth defect): :指嬰兒出生前即已形成的指嬰兒出生前即已形成的發(fā)育障礙，包括畸形和功能缺陷。如先天性心臟發(fā)育障礙，包括畸形和功能缺陷。如先天性心臟病、唇腭裂、神經(jīng)管畸形、尿道下裂、隱睪癥等。病、唇腭裂、神經(jīng)管畸形、尿道下

12、裂、隱睪癥等。6.6.不良妊娠結(jié)局（不良妊娠結(jié)局（adverse pregnancy outcomes)adverse pregnancy outcomes)：指妊娠后不能產(chǎn)生外觀和功能正常的子代。指妊娠后不能產(chǎn)生外觀和功能正常的子代。二、發(fā)育毒性的作用特點(diǎn)和影響因素二、發(fā)育毒性的作用特點(diǎn)和影響因素與對其他器官系統(tǒng)的毒性作用相比，外源化學(xué)物的發(fā)育毒性作用有顯著的特點(diǎn):致畸作用受到多種因素的影響，包括敏感期、遺傳類型、劑量、母體毒性等。（一）（一）發(fā)育發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用特點(diǎn)和致畸敏感各階段發(fā)育毒性作用特點(diǎn)和致畸敏感期期卵子受精后一直發(fā)育直至出生為止，都稱為孕體 。從受精到新生兒的發(fā)育過程經(jīng)歷

13、著:u著床前期u器官形成期 最容易引起畸形的階段u胎兒期u圍生期和出生后的發(fā)育期 1.著床前期又稱為分化前期，從受精時(shí)算起，到完成著床之前。該期限在人類為11-12天；嚙齒動物為前6天。這時(shí)受損傷的胚泡容易死亡，稱為著床前丟失。有些化學(xué)毒物作用于胚泡，使之死亡而丟失。著床前期發(fā)育毒性 一般認(rèn)為，此時(shí)很少發(fā)生特異的致畸效應(yīng)。也有著床前期接觸毒物導(dǎo)致胎兒畸形的例子。如： 甲基亞硝脲 子代神經(jīng)管缺陷小鼠妊娠 第2.5天、3.5天和4.5天 腭 裂 孕體著床后直到硬腭閉合的一段時(shí)間。孕體著床后直到硬腭閉合的一段時(shí)間。是發(fā)生結(jié)構(gòu)是發(fā)生結(jié)構(gòu)畸形的關(guān)鍵期畸形的關(guān)鍵期(critical period)，也稱，

14、也稱致畸敏感期致畸敏感期。在此期間，大多數(shù)器官對致畸作用有特殊敏感期，即所謂的時(shí)間“靶窗”（target window）。自受精之日計(jì)算：人是3-8周；大、小鼠是615天；家兔為618天。2.器官形成期器官形成期同一劑量的一種致畸物在敏感期與胚胎接觸，同一劑量的一種致畸物在敏感期與胚胎接觸，可因胚胎所處發(fā)育階段不同而出現(xiàn)不同的畸形。可因胚胎所處發(fā)育階段不同而出現(xiàn)不同的畸形。Case1：大量維生素：大量維生素A在受精后第在受精后第8天給予大鼠，主要出天給予大鼠，主要出現(xiàn)骨骼畸形；在第現(xiàn)骨骼畸形；在第12天給予，則誘發(fā)腭裂。天給予，則誘發(fā)腭裂。case2：同樣劑量砷酸鈉在小鼠受精第：同樣劑量砷酸鈉

15、在小鼠受精第7天和第天和第9天分別天分別給予，前者主要出現(xiàn)臍疝，后者主要為露腦。給予，前者主要出現(xiàn)臍疝，后者主要為露腦。器官形成期器官形成期發(fā)育毒性發(fā)育毒性 Rodent development 在器官形成期，染毒除致畸外，也可能引起胚胎死亡。人和靈長類以流產(chǎn)告終，一胎多仔動物胚胎死亡后被吸收，稱為吸收胎。在這一時(shí)期，外源化學(xué)物表現(xiàn)出發(fā)育毒性，以結(jié)構(gòu)畸形最突出，也可有胚胎死亡、生長遲緩。器官形成期器官形成期發(fā)育毒性發(fā)育毒性 器官形成結(jié)束后（人類從第器官形成結(jié)束后（人類從第56-5856-58天起）到天起）到分娩的一段時(shí)間。分娩的一段時(shí)間。 以組織分化，生長和生理學(xué)的成熟為基本以組織分化，生長和

16、生理學(xué)的成熟為基本特征特征，接觸發(fā)育毒物很可能對生長和功能成熟接觸發(fā)育毒物很可能對生長和功能成熟產(chǎn)生效應(yīng)。產(chǎn)生效應(yīng)。 全身生長遲緩全身生長遲緩 特異的功能障礙特異的功能障礙 經(jīng)胎盤致癌經(jīng)胎盤致癌 死胎死胎3.胎兒期胎兒期發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)：發(fā)育免疫毒性神經(jīng)行為發(fā)育異常兒童期腫瘤4.圍生期和出生后的發(fā)育期圍生期和出生后的發(fā)育期圍生期和出生后的發(fā)育毒性圍生期和出生后的發(fā)育毒性 發(fā)育免疫毒性二噁英、氯氰菊酯、乙醇等 影響出生后T細(xì)胞、B細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的發(fā)育、分化、遷移、歸巢和功能。最終暫時(shí)或永久性損害子代的免疫系統(tǒng)。圍生期和出生后的發(fā)育毒性圍生期和出生后的發(fā)育毒性發(fā)育神經(jīng)毒性表現(xiàn)為對感覺、運(yùn)動、自主

17、和認(rèn)知的影響。u妊娠期飲酒 乙醇綜合征胎兒（FAS）。u父母親吸煙（煙堿）可改變胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)煙堿受體發(fā)育，增加出生后的學(xué)習(xí)、行為和注意力障礙。圍生期和出生后的發(fā)育毒性圍生期和出生后的發(fā)育毒性 兒童期腫瘤圍生期是一生中對致癌物最敏感的時(shí)期，許多兒童期高發(fā)腫瘤（如急性淋巴細(xì)胞性白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骶骨前畸胎瘤等）都可能與出生前因素有關(guān)。 因?yàn)檫@一時(shí)期細(xì)胞增殖快，藥物代謝酶的個(gè)體發(fā)生不全，免疫監(jiān)視功能低。 發(fā)育各階段發(fā)育毒性的重要表現(xiàn) 發(fā)育階段發(fā)育階段 重要表現(xiàn)重要表現(xiàn) 著著 床床 前前 期期 胚胎死亡胚胎死亡 器官形成期器官形成期 畸形、胚胎死亡畸形、胚胎死亡 胎胎 兒兒 期期 生長遲緩、功

18、能不全、胎兒死亡、經(jīng)胎盤致癌生長遲緩、功能不全、胎兒死亡、經(jīng)胎盤致癌新新 生生 兒兒 期期生長遲緩、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能不全、兒童期腫瘤生長遲緩、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能不全、兒童期腫瘤（二）發(fā)育毒性的劑量-反應(yīng)模式u除了在較高劑量幾乎全窩胚胎死亡外，正常胎、生長遲緩和結(jié)構(gòu)畸形同時(shí)存在：這一類型較常見。u在遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于胚胎致死的劑量下即可出現(xiàn)致畸，甚至全窩致畸：這種模式表示受試物有高度致畸作用，較少見。u只有生長遲緩和胚胎致死，但沒有畸形發(fā)生。發(fā)育毒性的閾值概念發(fā)育毒性的閾值概念需要極大的樣本數(shù)，難以用實(shí)驗(yàn)找出一個(gè)發(fā)生率需要極大的樣本數(shù)，難以用實(shí)驗(yàn)找出一個(gè)發(fā)生率很低的劑量很低的劑量-反應(yīng)關(guān)系；反應(yīng)

19、關(guān)系；多數(shù)發(fā)育毒性機(jī)制還不清楚，或支持或不支持閾多數(shù)發(fā)育毒性機(jī)制還不清楚，或支持或不支持閾值的存在；值的存在；考慮個(gè)體的閾值和群體的閾值之間的區(qū)別。考慮個(gè)體的閾值和群體的閾值之間的區(qū)別。（三）發(fā)育毒性的物種差異（三）發(fā)育毒性的物種差異SpeciesHumans0.5 mg/kg/dayMouse 30 60X Rat 50100X Dog100200XHamster 350700XDose(LETD)Fold Difference from HumansCross-Species Differences in Responseto Thalidomide三、母體毒性與發(fā)育毒性三、母體毒性與發(fā)育

20、毒性 母體毒性（母體毒性（maternalmaternaltoxicitytoxicity）：指外源化：指外源化學(xué)物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害學(xué)物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥狀、直至死亡。床癥狀、直至死亡。 （一）母體因素對發(fā)育毒性的影響（一）母體因素對發(fā)育毒性的影響 遺傳學(xué)遺傳學(xué) 、疾病、疾病 、營養(yǎng)、營養(yǎng) 、應(yīng)激、應(yīng)激、對胎盤的毒性對胎盤的毒性 （二）母體毒性與胚胎毒性的關(guān)系（二）母體毒性與胚胎毒性的關(guān)系1 1具有具有發(fā)育發(fā)育毒性，但無母體毒性；毒性，但無母體毒性；2 2同時(shí)出現(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)發(fā)育發(fā)育毒

21、性和母體毒性；毒性和母體毒性；3 3具有母體毒性，但不具有致畸作用；具有母體毒性，但不具有致畸作用；4 4在一定劑量下，既無母體毒性，也不在一定劑量下，既無母體毒性，也不 表現(xiàn)發(fā)育毒性。表現(xiàn)發(fā)育毒性。 第四節(jié)第四節(jié) 發(fā)育毒性和致畸作用試驗(yàn)與評價(jià)發(fā)育毒性和致畸作用試驗(yàn)與評價(jià) 外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價(jià)動物發(fā)育毒性試驗(yàn)人群流行病學(xué)調(diào)查發(fā)育毒性替代試驗(yàn)動 物 發(fā) 育 毒 性 試 驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)： 容易控制接觸條件、接觸動物數(shù)量、年齡、狀態(tài)及選擇檢測效應(yīng)指標(biāo)（終點(diǎn)）。甚至一些輕微的效應(yīng)對研究人體影響很有意義。缺點(diǎn)：試驗(yàn)結(jié)果外推到人存在不肯定性，預(yù)測對人的致畸性特異性不夠高；從較高劑量暴露結(jié)果外推到人（暴露劑量較

22、低）有一定困難，況且人與人之間的個(gè)體差異要比動物的更大。一、動物發(fā)育毒性試驗(yàn)一、動物發(fā)育毒性試驗(yàn)主要的試驗(yàn)方案主要的試驗(yàn)方案1.1.三段生殖毒性試驗(yàn)主要用于評價(jià)藥物的生殖發(fā)育三段生殖毒性試驗(yàn)主要用于評價(jià)藥物的生殖發(fā)育毒性。毒性。2.2.一代和多代生殖毒性試驗(yàn)主要用于評價(jià)食品添加一代和多代生殖毒性試驗(yàn)主要用于評價(jià)食品添加劑、農(nóng)藥及其他化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性。劑、農(nóng)藥及其他化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性。3.3.改進(jìn)的大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性的試驗(yàn)程序：改進(jìn)的大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性的試驗(yàn)程序：19881988年年EPAEPA發(fā)布。發(fā)布。 最佳方案是對成年動物進(jìn)行染毒并試驗(yàn)，包最佳方案是對成年動物進(jìn)行染毒并試驗(yàn)，包 括子代從

23、受精卵到性成熟所有生長發(fā)育階段；括子代從受精卵到性成熟所有生長發(fā)育階段； 觀察期應(yīng)貫穿一個(gè)完整的生命周期。觀察期應(yīng)貫穿一個(gè)完整的生命周期。 設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于試驗(yàn)對生殖和生長發(fā)育各階關(guān)鍵在于試驗(yàn)對生殖和生長發(fā)育各階段的影響無間隔，并可直接或間接評價(jià)生殖循段的影響無間隔，并可直接或間接評價(jià)生殖循環(huán)的全過程。環(huán)的全過程。 最常選用的方案為三段生殖毒性試驗(yàn)最常選用的方案為三段生殖毒性試驗(yàn) 。動物發(fā)育毒性試驗(yàn)動物發(fā)育毒性試驗(yàn)的基本要求的基本要求為了進(jìn)行生殖發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方便，將連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程細(xì)分為以下6個(gè)階段：交配交配性成熟性成熟三段生殖毒性實(shí)驗(yàn)示意圖三段生殖毒性實(shí)驗(yàn)示意圖 I 生育力與

24、早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn); II 胚體胎體毒性試驗(yàn)； III 出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(yàn)。 實(shí)線表示染毒期。處死懷孕前著床前器官形成期 胎期新生兒期 開始懷孕 著床分娩斷乳I 4周15天處死IIIII生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)流程圖生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)流程圖胚胎胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)流程圖胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)流程圖圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)流程圖圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)流程圖致畸試驗(yàn)致畸作用是發(fā)育毒性中最重要、最容易觀察到一種表現(xiàn)，故化學(xué)物發(fā)育毒性的評定主要通過致畸試驗(yàn)。在致畸試驗(yàn)中除可觀察到出生幼仔畸形外，也可同 時(shí)發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育遲緩和胚胎致死。段試驗(yàn)是評定化學(xué)物是否具有致畸作用的標(biāo)準(zhǔn)方法。動物選擇動物選擇: :

25、一般要求選用兩種哺乳動物一般要求選用兩種哺乳動物v嚙齒類：首先考慮大鼠，也可采用小鼠。嚙齒類：首先考慮大鼠，也可采用小鼠。v非嚙齒類：多選家兔。非嚙齒類：多選家兔。劑量分組劑量分組試驗(yàn)劑量組最少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組：高、中、低。試驗(yàn)劑量組最少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組：高、中、低。每組劑量成等比級數(shù)關(guān)系。每組劑量成等比級數(shù)關(guān)系。另設(shè)對照組。另設(shè)對照組。原則上高劑量組可引起母體輕度中毒；中劑量組原則上高劑量組可引起母體輕度中毒；中劑量組可允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀；最低劑量可允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀；最低劑量組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀。組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀。動物交配動物交配將性成熟雌雄動物按雌雄將性成

26、熟雌雄動物按雌雄1 1：1 1或或2 2：1 1比例同籠交比例同籠交配，每日通過陰栓或陰道涂片精子檢查，將已確配，每日通過陰栓或陰道涂片精子檢查，將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對照組。出現(xiàn)陰定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對照組。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕第栓或精子之日即為受孕第1 1天。天。動物染毒動物染毒n染毒時(shí)間：在器官形成期，即從著床期到硬腭閉合染毒時(shí)間：在器官形成期，即從著床期到硬腭閉合大、小鼠孕期的第大、小鼠孕期的第615615天天兔孕期的兔孕期的618618天。天。n染毒方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致染毒方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致一般多經(jīng)口給予。一般多經(jīng)口給予。染毒期

27、間觀察妊娠動物的：染毒期間觀察妊娠動物的：n體征和死亡（體征和死亡（1 1次次/ /日）日）; ;n體重和體重改變（體重和體重改變（ 2 2次次/ /日）；日）；n攝食量（攝食量（ 1 1次次/ /日）；日）；n其他毒性研究中已證實(shí)的重要靶效應(yīng)。其他毒性研究中已證實(shí)的重要靶效應(yīng)。胎體檢查：胎體檢查：n自然分娩前自然分娩前1212天將受孕動物處死：天將受孕動物處死：一般大鼠在受孕后第一般大鼠在受孕后第19201920天；天；小鼠第小鼠第18191819天；天；家兔在第家兔在第2929天。天。剖腹處死時(shí)對所有妊娠動物進(jìn)行尸體解剖和肉眼檢查。剖腹處死時(shí)對所有妊娠動物進(jìn)行尸體解剖和肉眼檢查。保存肉眼發(fā)

28、現(xiàn)有改變的臟器，以便進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。保存肉眼發(fā)現(xiàn)有改變的臟器，以便進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。取出子宮及活產(chǎn)胎體，并另行記錄死胎和吸收胎。取出子宮及活產(chǎn)胎體，并另行記錄死胎和吸收胎。活胎取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計(jì)算平活胎取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計(jì)算平均體重，然后由下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：均體重，然后由下列幾方面進(jìn)行畸形檢查： 外觀畸形外觀畸形 內(nèi)臟及軟組織畸形內(nèi)臟及軟組織畸形 骨骼畸形。骨骼畸形。畸形檢查只限活產(chǎn)胎體畸形檢查只限活產(chǎn)胎體。以上檢查只能檢出結(jié)構(gòu)與形態(tài)的畸形，不能檢出以上檢查只能檢出結(jié)構(gòu)與形態(tài)的畸形，不能檢出可能發(fā)生的生化功能或神經(jīng)行為缺陷。可能發(fā)生的生化功能或神經(jīng)行為

29、缺陷。故為了全面了解可能存在的先天缺陷和生理功能故為了全面了解可能存在的先天缺陷和生理功能異常，可將試驗(yàn)雌鼠保留異常，可將試驗(yàn)雌鼠保留1/41/4左右待其自然分娩，左右待其自然分娩，飼養(yǎng)觀察出生幼仔以便檢查。飼養(yǎng)觀察出生幼仔以便檢查。結(jié)果評定：結(jié)果評定：對對母體母體毒性的評價(jià)指標(biāo)：體重、體重變化、毒性的評價(jià)指標(biāo)：體重、體重變化、食物和水消耗量、死亡率、交配率、受孕食物和水消耗量、死亡率、交配率、受孕率、臟器重及母體畸胎出現(xiàn)率等。率、臟器重及母體畸胎出現(xiàn)率等。結(jié)果評定：結(jié)果評定：對對孕體孕體影響的評價(jià)指標(biāo)：著床數(shù)、黃體數(shù)、影響的評價(jià)指標(biāo)：著床數(shù)、黃體數(shù)、平均胎體體重平均胎體體重/ /窩、活胎數(shù)窩

30、、活胎數(shù)/ /窩、吸收胎數(shù)窩、吸收胎數(shù)/ /窩、窩、畸胎數(shù)畸胎數(shù)/ /窩等。窩等。v結(jié)果評價(jià)結(jié)果評價(jià)發(fā)育毒性的劑量發(fā)育毒性的劑量- -反應(yīng)關(guān)系比較復(fù)雜。隨著劑量增反應(yīng)關(guān)系比較復(fù)雜。隨著劑量增加，先出現(xiàn)發(fā)育遲緩，然后胚胎加，先出現(xiàn)發(fā)育遲緩，然后胚胎- -胎兒死亡和畸形發(fā)胎兒死亡和畸形發(fā)生，劑量很大時(shí)可致全部死亡。生，劑量很大時(shí)可致全部死亡。試驗(yàn)最后應(yīng)能得出受試物對母體和胚胎試驗(yàn)最后應(yīng)能得出受試物對母體和胚胎- -胎兒各自胎兒各自的的NOAELNOAEL和和LOAELLOAEL。為了比較不同化學(xué)物的致畸強(qiáng)度，可計(jì)算致畸指數(shù)：為了比較不同化學(xué)物的致畸強(qiáng)度，可計(jì)算致畸指數(shù)：致畸指數(shù)致畸指數(shù) = = 評

31、定標(biāo)準(zhǔn)：評定標(biāo)準(zhǔn)： 致畸指數(shù)在致畸指數(shù)在1010以下不致畸；以下不致畸； 10-100 10-100為致畸；為致畸； 100 100以上為強(qiáng)致畸。以上為強(qiáng)致畸。最小致畸劑量雌鼠50LD動物實(shí)驗(yàn)中所見發(fā)育毒性的類型，不一定與人所動物實(shí)驗(yàn)中所見發(fā)育毒性的類型，不一定與人所產(chǎn)生的一樣；產(chǎn)生的一樣；發(fā)育毒性的所有表現(xiàn)（死亡、生長遲緩、結(jié)構(gòu)異發(fā)育毒性的所有表現(xiàn)（死亡、生長遲緩、結(jié)構(gòu)異常和功能缺陷），常和功能缺陷），與與人都是有關(guān)系的，不應(yīng)僅注人都是有關(guān)系的，不應(yīng)僅注意結(jié)構(gòu)異常；意結(jié)構(gòu)異常；人在孕期中攝入量不太小的物質(zhì)，只要對實(shí)驗(yàn)動人在孕期中攝入量不太小的物質(zhì)，只要對實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生發(fā)育毒性，就表示對人是一種

32、潛在危害。物產(chǎn)生發(fā)育毒性，就表示對人是一種潛在危害。（二）流行病學(xué)研究二）流行病學(xué)研究用流行病學(xué)的方法研究環(huán)境中的生殖毒物對人群生用流行病學(xué)的方法研究環(huán)境中的生殖毒物對人群生殖、發(fā)育影響的情況，包括性質(zhì)，程度以及原因。殖、發(fā)育影響的情況，包括性質(zhì)，程度以及原因。環(huán)境流行病學(xué)研究必須配合以環(huán)境化學(xué)毒物的檢測環(huán)境流行病學(xué)研究必須配合以環(huán)境化學(xué)毒物的檢測和人體生物標(biāo)志物的檢測即分子流行病學(xué)研究。和人體生物標(biāo)志物的檢測即分子流行病學(xué)研究。環(huán)境流行病學(xué)研究不是一般的流行病學(xué)調(diào)查，須科環(huán)境流行病學(xué)研究不是一般的流行病學(xué)調(diào)查，須科學(xué)設(shè)計(jì)、嚴(yán)格選擇對象和對照，觀察指標(biāo)客觀量化學(xué)設(shè)計(jì)、嚴(yán)格選擇對象和對照，觀察指

33、標(biāo)客觀量化。 (1 1) ) 在某些罕見的病例中，可能不需要正式研究就可以在某些罕見的病例中，可能不需要正式研究就可以識別異常出生結(jié)局的原因。識別異常出生結(jié)局的原因。 ( (2 2) ) 對老污染物或老產(chǎn)品只能采用回顧性或橫斷面調(diào)查，對老污染物或老產(chǎn)品只能采用回顧性或橫斷面調(diào)查，這類調(diào)查較難獲得明確的結(jié)論。這類調(diào)查較難獲得明確的結(jié)論。 需要足夠大的效應(yīng)和研究人群。需要足夠大的效應(yīng)和研究人群。 在出生時(shí)異常結(jié)局的發(fā)生率不能反映異常的真實(shí)比在出生時(shí)異常結(jié)局的發(fā)生率不能反映異常的真實(shí)比率。率。 3. 3. 病例報(bào)告和出生缺陷監(jiān)測登記對獲得人類的發(fā)育毒病例報(bào)告和出生缺陷監(jiān)測登記對獲得人類的發(fā)育毒性證據(jù)

34、是有用的。性證據(jù)是有用的。 流行病學(xué)研究流行病學(xué)研究確認(rèn)人類致畸物的標(biāo)準(zhǔn)：確認(rèn)人類致畸物的標(biāo)準(zhǔn)： 一種特殊的缺陷或幾種缺陷并發(fā)（綜合征）的頻率突一種特殊的缺陷或幾種缺陷并發(fā)（綜合征）的頻率突然增加。然增加。 缺陷的增加與某種已知的環(huán)境改變（如一種新藥的廣缺陷的增加與某種已知的環(huán)境改變（如一種新藥的廣泛使用）相關(guān)聯(lián)。泛使用）相關(guān)聯(lián)。 在妊娠的特殊階段已知暴露于某種環(huán)境的改變，產(chǎn)生在妊娠的特殊階段已知暴露于某種環(huán)境的改變，產(chǎn)生有特征性缺陷的綜合征。有特征性缺陷的綜合征。 缺少妊娠時(shí)引起特征性缺陷嬰兒的其他共同的因子。缺少妊娠時(shí)引起特征性缺陷嬰兒的其他共同的因子。體外初篩試驗(yàn)體外初篩試驗(yàn)體內(nèi)初篩試驗(yàn)

35、體內(nèi)初篩試驗(yàn)隨著細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)展了一隨著細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)展了一些發(fā)育毒物體外初篩試驗(yàn)，建立了全胚胎培養(yǎng)、器些發(fā)育毒物體外初篩試驗(yàn)，建立了全胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的體外試驗(yàn)法。官培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的體外試驗(yàn)法。這些試驗(yàn)方法的結(jié)果與沒有母體毒性的整體動物致這些試驗(yàn)方法的結(jié)果與沒有母體毒性的整體動物致畸試驗(yàn)有較好的相關(guān)，且可嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，故畸試驗(yàn)有較好的相關(guān)，且可嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，故可用這些試驗(yàn)作發(fā)育毒物的初篩，預(yù)測對整體動物可用這些試驗(yàn)作發(fā)育毒物的初篩，預(yù)測對整體動物的致畸性，發(fā)現(xiàn)致畸作用的靶器官，或闡明致畸機(jī)的致畸性，發(fā)現(xiàn)致畸作用的靶器官，或闡明致畸機(jī)

36、制等。制等。常見的體外初篩試驗(yàn)有：常見的體外初篩試驗(yàn)有：大鼠全胚胎培養(yǎng)大鼠全胚胎培養(yǎng)器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法自從年首次在體外進(jìn)行嚙齒類動物全胚胎自從年首次在體外進(jìn)行嚙齒類動物全胚胎培養(yǎng)成功后，這一技術(shù)逐漸被應(yīng)用于毒理學(xué)研究。培養(yǎng)成功后，這一技術(shù)逐漸被應(yīng)用于毒理學(xué)研究。用于著床后全胚胎培養(yǎng)的胚體正處于器官發(fā)生期，用于著床后全胚胎培養(yǎng)的胚體正處于器官發(fā)生期，是對有毒外源物高度敏感的發(fā)育階段，能較好的反是對有毒外源物高度敏感的發(fā)育階段，能較好的反映化學(xué)物對胚體的影響。映化學(xué)物對胚體的影響。該方法在毒理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但本該方法在毒理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但本法技術(shù)難度相

37、對較大，費(fèi)用高。法技術(shù)難度相對較大，費(fèi)用高。具體試驗(yàn)方法；從孕期具體試驗(yàn)方法；從孕期9 91010天大鼠子宮取出胚體，天大鼠子宮取出胚體，剝?nèi)內(nèi)eichertReichert膜，放入培養(yǎng)液中膜，放入培養(yǎng)液中加入加入外源化學(xué)物，在孵外源化學(xué)物，在孵箱中通氣旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中通氣旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。觀察心臟搏動、卵黃囊直徑、胚芽、神經(jīng)管閉合、體觀察心臟搏動、卵黃囊直徑、胚芽、神經(jīng)管閉合、體節(jié)數(shù)目及體長等發(fā)育情況。根據(jù)節(jié)數(shù)目及體長等發(fā)育情況。根據(jù)BrowBrow評分對器官形態(tài)評分對器官形態(tài)分化做出評價(jià)。分化做出評價(jià)。可篩可篩選受試選受試化學(xué)物的發(fā)育毒性、探討其劑量反應(yīng)關(guān)系化學(xué)物的發(fā)育毒性、探討其劑量反應(yīng)關(guān)系和作

38、用機(jī)制。和作用機(jī)制。是將胚體或胚體組織、器官或器官的一部分在體外是將胚體或胚體組織、器官或器官的一部分在體外培養(yǎng)，觀察化學(xué)物對其發(fā)育過程的影響。培養(yǎng)，觀察化學(xué)物對其發(fā)育過程的影響。常選用常選用胚體肢芽胚體肢芽、腭板、晶狀體、腎、肺、肝、牙、腭板、晶狀體、腎、肺、肝、牙等組織器官進(jìn)行培養(yǎng)。等組織器官進(jìn)行培養(yǎng)。其中以肢芽培養(yǎng)系統(tǒng)在方法學(xué)上較為完備。其中以肢芽培養(yǎng)系統(tǒng)在方法學(xué)上較為完備。肢芽培養(yǎng)的具體方法：肢芽培養(yǎng)的具體方法：取取12 12 天小鼠胚體，在顯微鏡下選用天小鼠胚體，在顯微鏡下選用52555255體節(jié)數(shù)的體節(jié)數(shù)的胚體，取下前肢，置于含受試物的培養(yǎng)液中，連續(xù)胚體，取下前肢，置于含受試物的培養(yǎng)液中，連續(xù)通氣浸沒旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)通氣浸沒旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3 3天，固定天，固定、染色染色、制作肢體壓片，制作肢體壓片，檢查肢體中軟骨原基的發(fā)育和分化。檢查肢體中軟骨原基的發(fā)育和分化。細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)從第從第1111天的大鼠胚體取出達(dá)標(biāo)天的大鼠胚體取出達(dá)標(biāo)CNSCNS的原代中腦細(xì)胞的原代中腦細(xì)胞微團(tuán)、肢芽區(qū)或其他區(qū)的細(xì)胞微團(tuán)，置于含有不同微團(tuán)、肢芽區(qū)或其他區(qū)的細(xì)胞微團(tuán)，置于含有不同濃度受試物的培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)濃度受試物的培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)5 5天，天，用中性紅染色判斷細(xì)胞存活，蘇木精染色判斷用中性紅染色判斷細(xì)胞存活，蘇木精染色判斷CNSCNS分分化數(shù)量，用