1、 應用特異應用特異PCR快速鑒定微生快速鑒定微生物肥料中物肥料中4種乳酸菌種乳酸菌微生物學通報微生物學通報 Microbiology China Apr. 20, 2014, 41(4): 674680 2014 by Institute of Microbiology, CAS摘要摘要 目的目的:植物乳桿菌植物乳桿菌 、鼠李糖乳桿菌、鼠李糖乳桿菌 、嗜酸乳、嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌是微生物肥料生產中常用的乳桿菌和德氏乳桿菌是微生物肥料生產中常用的乳酸菌，它們表型特征相似，若采用傳統方法鑒定酸菌，它們表型特征相似，若采用傳統方法鑒定則費時費力，為準確、快速地鑒定這些菌種，建則費時費力，為準確、快

2、速地鑒定這些菌種，建立種特異立種特異PCR方法。方法。 方法方法:利用利用 NCBI 中中 Primer-BLAST (引物設引物設計和特異性檢驗工具計和特異性檢驗工具)，以，以 GenBank 數據庫中上數據庫中上述菌種的述菌種的 recA 和和 gyrB 為靶基因，設計和篩選種為靶基因，設計和篩選種特異性引物從而建立相應特異特異性引物從而建立相應特異 PCR 鑒定方法。鑒定方法。 摘要摘要 結果：經過乳桿菌屬、結果：經過乳桿菌屬、 乳球菌屬、乳球菌屬、 片球菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬和假芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬和假單胞菌屬單胞菌屬7 個屬個屬 24

3、 個種共個種共 40 株標準菌株的實驗株標準菌株的實驗驗證，驗證， 4 個目標種分別擴增出唯一的目的產物，個目標種分別擴增出唯一的目的產物，而其他種均無目的擴增產物。采用建立的而其他種均無目的擴增產物。采用建立的 4 種特種特異異 PCR 方法對產品中分離的方法對產品中分離的 16株乳桿菌進行鑒株乳桿菌進行鑒定，結果與定，結果與 16S rDNA 序列分析、序列分析、 Biolog 鑒定結鑒定結果一致。果一致。 結論：建立的特異結論：建立的特異PCR 鑒定方法均具鑒定方法均具有較高的種內通用性和種間特異性，可快有較高的種內通用性和種間特異性，可快速、準確的用于微生物制劑中植物乳桿菌、速、準確的

4、用于微生物制劑中植物乳桿菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌的檢測和鑒定，具有較好的應用前景。的檢測和鑒定，具有較好的應用前景。引言引言 乳酸菌是指能發酵糖類且主要產物為乳酸的乳酸菌是指能發酵糖類且主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。具有一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。具有多種重要的生理功能，是食品和藥品行業中的重多種重要的生理功能，是食品和藥品行業中的重要菌種。在微生物肥料行業，以乳酸菌要菌種。在微生物肥料行業，以乳酸菌(主要是乳主要是乳桿菌桿菌)作為有效菌的產品越來越多，準確的識別和作為有效菌的產品越來越多，準確的識別和鑒定微

5、生物制劑中的各種菌是產品質量判定的重鑒定微生物制劑中的各種菌是產品質量判定的重要依據，要依據， 而選擇一種快速而準確的鑒定方法尤為而選擇一種快速而準確的鑒定方法尤為重要。重要。引言引言 乳桿菌屬的許多種其菌體、菌落形態特征乳桿菌屬的許多種其菌體、菌落形態特征相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處。相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處。傳統的生理生化試驗耗時費力，傳統的生理生化試驗耗時費力，Biolog 快速鑒快速鑒定系統、脂肪酸分析等測定繁瑣、成本高，不定系統、脂肪酸分析等測定繁瑣、成本高，不能滿足微生物肥料檢測中的快速、準確的需要。能滿足微生物肥料檢測中的快速、準確的需要。至今已有許多

6、分子鑒定技術和分類方法被用于至今已有許多分子鑒定技術和分類方法被用于乳酸菌的分類和鑒定。其中，特異乳酸菌的分類和鑒定。其中，特異( (引物引物)PCR)PCR技技術簡單、快速、準確及成本低。術簡單、快速、準確及成本低。引言引言 本實驗以微生物肥料中常見的植物乳桿本實驗以微生物肥料中常見的植物乳桿 菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿 菌為材料，用菌為材料，用NCBI中中Primer-BLAST (引物設引物設計和特異性檢驗工具計和特異性檢驗工具)設計種特異性引物，而設計種特異性引物，而后通過優化后通過優化 PCR 反應的退火溫度、引物濃度、反應的退火溫度

7、、引物濃度、Mg2+等關鍵因子，建立等關鍵因子，建立 4 種菌的快速鑒定特種菌的快速鑒定特異異 PCR 方法，應用于微生物肥料產品檢測過方法，應用于微生物肥料產品檢測過程中的菌種識別與鑒定，以提高質檢效率。程中的菌種識別與鑒定，以提高質檢效率。材料與方法材料與方法 1.2.1 基因組基因組 DNA 模板的制備模板的制備：乳酸菌接種：乳酸菌接種MRS 瓊脂培養基，瓊脂培養基，37 C 厭氧培養厭氧培養 1624 h，膠凍樣，膠凍樣類芽孢桿菌接種于硅酸鹽細菌培養基，其他菌株類芽孢桿菌接種于硅酸鹽細菌培養基，其他菌株接種于營養瓊脂，接種于營養瓊脂， 30 C 培養培養 1624 h，用無菌，用無菌水

8、收集培養物，參照水收集培養物，參照 Bead-beater 法并作一定改法并作一定改進快速提取各菌株的基因組進快速提取各菌株的基因組 DNA。材料與方法材料與方法 1.2.2 種特異性種特異性PCR引物設計引物設計：通過分析比較：通過分析比較GenBank 數據庫中上述菌種及其相近種的數據庫中上述菌種及其相近種的16SrRNA、gyrB、recA、hsp60、16S-23S ITS、 lacZ 等基因序等基因序列的差異，列的差異， 確定植物乳桿菌和德氏乳桿菌引物設計確定植物乳桿菌和德氏乳桿菌引物設計的靶基因為的靶基因為 recA (重組蛋白基因重組蛋白基因)， 鼠李糖乳桿菌和鼠李糖乳桿菌和嗜酸

9、乳桿菌為嗜酸乳桿菌為 gyrB (促旋酶基因促旋酶基因 )。利用。利用NCBI中中 Primer-BLAST (引物設計和特異性檢驗工具引物設計和特異性檢驗工具)設計引設計引物并同時在物并同時在GenBank 數據庫中進行引物特異性驗證，數據庫中進行引物特異性驗證，最終篩選出上述特異性引物各最終篩選出上述特異性引物各1對，分別為對，分別為 planF/planR(植物乳桿菌特異引物植物乳桿菌特異引物) 、aciF/aciR (嗜酸嗜酸乳桿菌特異引物乳桿菌特異引物)、 delF/delR (德氏乳桿菌特異引物德氏乳桿菌特異引物)和和 rhaF/rhaR (鼠李糖乳桿菌特異引物鼠李糖乳桿菌特異引物

10、)。表。表 2 為各引為各引物序列物序列。材料與方法材料與方法 1.2.3 特異特異 PCR 反應體系及程序：反應體系及程序：以參考菌株的以參考菌株的基因組基因組 DNA 為模板，利用設計好的特異性引物為模板，利用設計好的特異性引物進行進行 PCR 擴增。擴增。PCR 反應總體系為反應總體系為20 L，包括，包括10PCR Buffer (不含不含Mg2+ ) 2.0L，MgCl2 (25 mmol/L) 1.6L，dNTP mixture (各各2.5 mmol/L)1.6L，引物，引物 F (20mol/L)、引物、引物 R (20 mol/L)各各0.5L， Taq DNA聚合酶聚合酶(

11、5 U/L) 0.2L，模板模板 DNA50 ng，加無菌重蒸水補足至，加無菌重蒸水補足至 20L。PCR 擴增程序：擴增程序：94 C 3 min；94 C 60 s， 67 C 45 s，72 C 60 s，共，共 30 個循環；個循環；72 C 10 min，4 C 保存。產物經保存。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢瓊脂糖凝膠電泳檢測。測。材料與方法材料與方法 1.2.4 PCR 特異性驗證實驗特異性驗證實驗：用：用 4 對引物分別對對引物分別對40 株參考株參考菌株進行擴增，產物經菌株進行擴增，產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測。 1.2.5 特異特異 PCR 產物測序產物測

12、序：對菌株：對菌株 L. plantarum CGMCC1.2437T ， L. rhamnosus ACCC10534T ， L. acidophilus CGMCC1.1878T ， L. delbrueckii subsp. delbruekii CGMCC1.2624T 的的 PCR 產物進行測序，產物進行測序，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。 1.2.6 生產菌株的檢測生產菌株的檢測：采用：采用 Biolog 方法和方法和 16SrDNA 序列序列分析方法對分析方法對 16 株從微生物肥料產品中分離的乳桿菌進行株從微生物肥料產品中分離的

13、乳桿菌進行鑒定，然后分別用鑒定，然后分別用 4 對引物采用特異對引物采用特異 PCR 方法對其進行方法對其進行鑒定，檢驗本實驗建立的特異鑒定，檢驗本實驗建立的特異 PCR 方法與其他方法鑒定方法與其他方法鑒定結果是否一致。結果是否一致。材料與方法材料與方法 1.2.7 16S rDNA 序列分析方法：序列分析方法：以生產菌株基因以生產菌株基因組組 DNA 為模板，采用通用引物為模板，采用通用引物 27F 和和 1492R進進行行 16S rDNA 擴增，擴增， PCR 產物經純化后測序，所產物經純化后測序，所測測 16S rDNA 序列經校對、拼接后與序列經校對、拼接后與 GenBank 數數

14、據庫中相關種屬的序列進行據庫中相關種屬的序列進行 BLAST 比較。反應比較。反應體系體系 (50L) ：10PCR buffer 5.0L， MgCl2 (25 mmol/L) 4L，dNTP mixture (各各 2.5 mmol/L) 5L，引物，引物 27F 和和 1492R (10mol/L)各各 1L， TaqDNA聚合酶聚合酶(5U/L)0.5L，模板，模板DNA 100ng，加無菌重蒸水補足至加無菌重蒸水補足至 50L。擴增程序：。擴增程序： 95 C 5 min；93 C 60 s，50 C 60 s，72 C 70 s，共共 30個循環；個循環；72 C 10 min；

15、4 C 保存。保存。結果結果 2.1 乳桿菌乳桿菌 PCR 方法的特異性檢測方法的特異性檢測：使用：使用 4 對特對特異引物分別對異引物分別對 31 株乳桿菌屬參考菌株株乳桿菌屬參考菌株(表表 1)進行進行 PCR 擴增，結果顯示，所有目標菌株中擴增，結果顯示，所有目標菌株中 1 株嗜酸株嗜酸乳桿菌乳桿菌 CGMCC1.2467 除外，均產生唯一目的條除外，均產生唯一目的條帶，非目標菌株均沒有擴增出目的條帶。圖帶，非目標菌株均沒有擴增出目的條帶。圖 1A、 B、C、D 顯示的是各個目標種所有菌株及非目標顯示的是各個目標種所有菌株及非目標種代表菌株的種代表菌株的 PCR 結果。將嗜酸乳桿菌結果。

16、將嗜酸乳桿菌 CGMCC1.2467 基因進行基因進行 16S rDNA 擴增，擴增， 測序測序后與后與GenBank 數據庫和數據庫和 RDP 數據庫中相關種屬數據庫中相關種屬的序列進行比較，結果均顯示與鼠李糖乳桿菌的的序列進行比較，結果均顯示與鼠李糖乳桿菌的序列一致性最高，達到序列一致性最高，達到 100%；采用；采用 Biolog 對該對該菌進行鑒定，結果也是鼠李糖乳桿菌。利用鼠李菌進行鑒定，結果也是鼠李糖乳桿菌。利用鼠李糖乳桿菌特異引物對該菌進行特異糖乳桿菌特異引物對該菌進行特異 PCR，擴增結，擴增結果為陽性果為陽性(圖圖 1D)。結果結果 使用使用 4 對特異引物分別對對特異引物分

17、別對 9 株非乳桿株非乳桿菌屬參考菌株菌屬參考菌株(表表 1)進行進行 PCR 擴增，且分擴增，且分別以一株目標菌株為陽性對照。結果除陽別以一株目標菌株為陽性對照。結果除陽性對照出現目標條帶外，其余均沒有目的性對照出現目標條帶外，其余均沒有目的擴增產物。擴增產物。 以上結果表明，建立的以上結果表明，建立的 4 種特異種特異 PCR 鑒定方法均具有較高的種內通用性和種間鑒定方法均具有較高的種內通用性和種間特異性。特異性。結果結果 2.2 PCR 產物序列分析：產物序列分析：對對 模模 式式 菌菌 株株 L.plantarum 1.2437T 、 L.rhamnosus 10534T、 L. ac

18、idophilus 1.1878T 和和 L.delbrueckii subsp. delbruekii 1.2624T 的特異的特異 PCR 產物進行測序，結產物進行測序，結果通過果通過 GenBank 中中 BLAST 比對，與數據庫中的比對，與數據庫中的同一區段核酸序列的一致性均達到同一區段核酸序列的一致性均達到99%或或100%，結果說明各特異性引物具有很強的忠實性、特異結果說明各特異性引物具有很強的忠實性、特異性和保守性。性和保守性。結果結果 2.3 生產菌株的檢測生產菌株的檢測：16 株生產菌株的株生產菌株的 4 次特異次特異 PCR 結結果、果、 16S rDNA 序列在序列在

19、GenBank 和和 RDP 兩個數據庫中的兩個數據庫中的綜合分析結果和綜合分析結果和 Biolog 鑒定結果見表鑒定結果見表 3。其中。其中 11 株菌產株菌產生了唯一擴增條帶，生了唯一擴增條帶， 根據片段大小分屬于嗜酸乳桿菌、根據片段大小分屬于嗜酸乳桿菌、 鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌，其鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌，其 16S rDNA序列分析結果序列分析結果和和 Biolog 鑒定結果均與其一致，另外鑒定結果均與其一致，另外 5 株菌無擴增產物，株菌無擴增產物，序列分析和序列分析和 Biolog 鑒定的結果顯示是布氏乳桿菌、類布鑒定的結果顯示是布氏乳桿菌、類布氏乳桿菌、干酪乳桿菌和類干酪乳桿菌

20、。以上結果表明特氏乳桿菌、干酪乳桿菌和類干酪乳桿菌。以上結果表明特異異 PCR 方法可用于微生物肥料中這方法可用于微生物肥料中這 4 種菌的快速檢測鑒種菌的快速檢測鑒定，定， 并且乳桿菌屬其它種的特異并且乳桿菌屬其它種的特異 PCR 方法還有待建立。方法還有待建立。另外，因另外，因 L-13 和和 L-16 的的 16S rDNA 序列分別與序列分別與 2 種菌的種菌的序列一致性達到序列一致性達到 99%以上，不能確定到某個種，故表中以上，不能確定到某個種，故表中給出給出 2 個菌名，這也證實了個菌名，這也證實了 16SrDNA 序列分析不適合乳序列分析不適合乳桿菌相近種的鑒定。桿菌相近種的鑒

21、定。討論討論 16S rDNA 序列同源性分析作為細菌系統發序列同源性分析作為細菌系統發育和親緣關系的研究已被普遍接受和廣泛應用，育和親緣關系的研究已被普遍接受和廣泛應用，并且已作為細菌分類鑒定的有力佐證。但是乳桿并且已作為細菌分類鑒定的有力佐證。但是乳桿菌屬內許多種的菌屬內許多種的 16S rRNA 基因序列具有較高同基因序列具有較高同源性，利用該方法無法準確鑒定到種源性，利用該方法無法準確鑒定到種 ，本實驗，本實驗2 株生產菌株的株生產菌株的 16S rDNA 序列分析結果也證實了序列分析結果也證實了這一觀點。研究表明，這一觀點。研究表明，gyrB、recA、rpoD、hsp60等基因序列更適合細菌的系統發育分析，用等基因序列更適合細菌的系統發育分析，用作引物設計的靶基因，作引物設計的靶基因， 較較 16S rDNA 序列更好地序列更好地區分相似種區分相似種 。討論討論 本實驗以本實驗以 gyrB、 recA 為靶基因設計了為靶基因設計了 4種種乳桿菌的特異性引物，經乳桿菌屬多個種、目標乳桿菌的特異性引物，經乳桿菌屬多個種、目標種的相近種以及微生物肥料產品中非乳桿菌屬代