1、12主要內容 PCR介紹 引物設計原理 引物設計的優化原則 Primer Premier 5.0 介紹 舉例說明引物的設計3PCR介紹介紹1、什么是PCR2、PCR的組成3、如何提高PCR成功率 （定量，對照）4引物設計原理 引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物設計總體上包含三個程序：序列下載，同源性比較，引物設計篩選 。56引物設計的原則1、引物長度 大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。如果期待的產物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618)的引物；若產物長5 kb，則用24個核苷酸的引 物。有人用2023個核苷酸引物得到40 kb的產

2、物。 7引物設計的原則2、引物GC含量 GC含量在40%60%之間，以45-55為宜。這可為有效退火提供足夠熱。 8引物設計的原則3、引物Tm 引物所對應模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之間。 Tm=2(A+T)+4(C+G)9引物設計的原則4、引物3端 引物3末端和模板的堿基完全配對 防止一對引物內的同源性 考慮末端5個堿基的G 引物3端要避開密碼子的第3位 10引物設計的原則5、引物序列與模板序列組成的相似性引物序列與模板序列組成的相似性 可能的錯誤引發位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發率高 。11引物設計的原則6、最好在模板最好在模板cDNA

3、的保守區內設計的保守區內設計 DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。 12引物設計的原則7、引物自身及引物之間不應存在互補序引物自身及引物之間不應存在互補序 列列 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。 13引物設計的原則8、堿基要隨機分布堿基要隨機分布 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（Fal

4、se priming）。 14引物設計的原則9、引物應具有特異性引物應具有特異性 引物設計完成以后，應對其進行檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 15引物設計的原則10、G值值 G值(自由能)反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9（G值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發反應而可防止錯誤引發。 16引物設計的原則11、引物的引物的5端端 引物的5端可以修飾，而3端不可修飾，引物5 端修飾包括：加酶切位點、標記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插

5、入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 17引物設計的原則12、在在DNA測序和測序和PCR中最好用中最好用5末端穩末端穩定定(如如GC含量較多含量較多)，而，而3末端不太穩定末端不太穩定(如如AT含量較多含量較多)的引物的引物 18Primer Premier 5.0 簡介主要功能:1、即引物設計2、限制性內切酶位點分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析19Primer Premier 5.0使用介紹Preimer Premier 啟動界面Load sequence20基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button

6、 to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function 21引物設計界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer22引物搜索選項設定引物類型搜索模式5引物位置范圍3引物位置范圍產物大小范圍引物長度23搜索結果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物24引物信息回到主窗

7、口引物及產物信息是否出現hairpin,dimer,false priming and cross dimer25一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But 26引物編輯27引物編輯Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window28任務任務用綠色熒光蛋白用綠色熒光蛋白(GFP)標記蛋白標記蛋白NR1舉例說明舉例說明29SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFP30SPBamHI(GGATC

8、C)pcDNA3.1NR1-1aGFP31 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatg

9、tt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tc

10、catctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的編碼序列的編碼序列(4000bp)紅色紅色為信號肽, 藍色藍色為B

11、amHI酶切位點, 下劃線下劃線標出酶切位點的閱讀框 32ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACG

12、ACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGG

13、AC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)33引物要求 PCR擴增GFP GFP兩邊添加BamHI酶切位點 保證NR1的閱讀框不改變345 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGC

14、TGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 TTACTT

15、GTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：擴增第一步：擴增GFP基本序列基本序列變性變性, 引物復性引物復性35第二步：GC比值；Tm值Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%

16、,Tm：66）36第三步：酶切位點Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）BamHI: ggatccPrimer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 37第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca

17、 tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：序列：Primer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA38atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttt

18、tcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acac