1、植物蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向電泳 在在TEMED TEMED 催化過(guò)硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺催化過(guò)硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長(zhǎng)鏈。單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長(zhǎng)鏈。 在雙功能交聯(lián)劑如在雙功能交聯(lián)劑如N N，N-N-亞甲叉雙丙烯酰胺的參與下的共聚亞甲叉雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。 網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。度。 一、一、 聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)聚丙烯酰胺

2、凝膠的本質(zhì)CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亞甲雙丙烯酰胺） 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。 1967年，Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡(jiǎn)稱SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率間的關(guān)系，可用下式表示： MW=K（10一）. (1)lgMW=lgK-bmR=K1-bmR (2)式

3、中Mw為蛋白質(zhì)的分子量，K、kl為常數(shù)，b為斜率, mR為相對(duì)遷移率.測(cè)定某個(gè)蛋白質(zhì)的分子量，只需比較它和一系列已知分子量的蛋白質(zhì)在SDS-凝膠電泳時(shí)的遷移率就可以了。后來(lái)，Weber等人基本按Shapiro的方法對(duì)約40種蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)方法地可行性。用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，簡(jiǎn)便、快速，只需要廉價(jià)的設(shè)備和微克量的蛋白質(zhì)樣品；所得結(jié)果，在分子量為15,000200，000的范圍內(nèi)，與用其他方法測(cè)得的分子量相比，誤差一般在10%以內(nèi)。因此，近幾年來(lái)，SDS-凝膠電泳測(cè)定分子量的方法，已得到非常廣泛的應(yīng)用和迅速的發(fā)展。 為了闡明SDS-凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理，許多

4、人進(jìn)行了深入的研究。實(shí)驗(yàn)證明，在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4克SDS/1克蛋白質(zhì)。由于十二烷基磺酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)的SDS-復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。 在用SDS-凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，應(yīng)注意以下幾個(gè)問(wèn)題：1如果蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物不能達(dá)到1.4克SDS/1克蛋白質(zhì)的比率并具有相同的構(gòu)象，就不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。影響蛋白

5、質(zhì)和SDS結(jié)合的因素主要有以下3個(gè)：（1）二硫鍵是否完全被還原：只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之具有相同的構(gòu)象。一般以巰基乙醇作還原劑。在有些情況下，還需進(jìn)一步將形成的巰基烷基化，以免在電泳過(guò)程中重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體。 （2）溶液中SDS的濃度：溶液中的SDS的總量，至少要比蛋白質(zhì)的量高3倍，一般需高達(dá)10倍以上。 （3）溶液的離子強(qiáng)度：溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)較低，最高不能超過(guò)0.26，因?yàn)镾DS在水溶液中是以單體和分子團(tuán)的混合體而存在的，SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量，僅決定于平衡時(shí)SDS單體的濃度而不是總濃度，在低離子強(qiáng)度的溶液中，S

6、DS單體具有較高的平衡濃度。 2不同的凝膠濃度適用于不同的分子量范圍Weber的實(shí)驗(yàn)指出，在5%的凝膠中，分子量25,000200,000的蛋白質(zhì)，其分子量的對(duì)數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；在10%的凝膠中，10.00070,000分子量的蛋白質(zhì)呈直線關(guān)系；在15%的凝膠中，10,00050,000分子量的蛋白質(zhì)呈直線關(guān)系；3.33%（以上各種濃度的凝膠，其交聯(lián)度都是2.6%）的凝膠可用于分子量更高的蛋白質(zhì)。 可根據(jù)所測(cè)分子量范圍選擇最適凝膠濃度，并盡量選擇分子量范圍和性質(zhì)與待測(cè)樣品相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率（蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以染料遷移距離即為相對(duì)遷移率）最好在0.20.8

7、之間均勻分布。 在凝膠電泳中，影響遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過(guò)程中，很難每次都將各項(xiàng)條件控制得完全一致，因此，用SDS-凝膠電泳法測(cè)定分子量，每次測(cè)定樣品必須同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用另一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)赟DS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測(cè)定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測(cè)定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果互相參照。 4不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳

8、法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的。這些蛋白質(zhì)有：電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測(cè)定的結(jié)果卻是35,000。因此，在分析SDS-凝膠電泳所得的結(jié)果時(shí)，應(yīng)該小心。一般至少用兩種方法來(lái)測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。為了判斷待測(cè)樣品是否可用SDS-凝膠電泳法來(lái)測(cè)定分子量，也可以使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在不同濃度（交聯(lián)度相同）的SDS-凝膠中電泳。 如果待測(cè)樣品

9、的自由遷移率與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率基本交于一點(diǎn)，而且在不同濃度的SDS-凝膠中測(cè)得的分子量都相同，則表明此蛋白質(zhì)在SDS-凝膠電泳中的行為是正常的，可以用SDS-凝膠電泳法測(cè)定其分子量。 SDS-PAGE有連續(xù)體系及不連續(xù)體系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩沖液，但加樣方式，電泳過(guò)程及固定、染色與脫色方法完全相同。 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法二、聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法1 器材與試劑：1.1 .器材：夾心式垂直板電泳槽，凝膠模（1351001.5mm）（北京六一儀器廠）直流穩(wěn)壓電源（電壓300600V，電流50100mA）吸量管（1,5,10 ml） 燒杯（25,50,100 ml）細(xì)長(zhǎng)

10、頭的滴管 1ml注射器及6號(hào)長(zhǎng)針頭微量注射器（10l或50l） 水泵或油泵真空干燥器 培養(yǎng)皿（直徑120mm） 1.2 試劑1.2.1 高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒（Pharmacia公司產(chǎn)品) 5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)目前國(guó)內(nèi)外均有廠商生產(chǎn)低分子量及高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)成套試劑盒，用于SDS-PAGE測(cè)定未知蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)名稱Mr來(lái) 源甲狀腺球蛋白鐵蛋白過(guò)氧化氫酶乳酸脫氫酶血清清蛋白669 000440 000232 000140 00067 000豬甲狀腺馬 肺牛 肝牛 心牛 血 清5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱Mr磷酸化酶B牛血清蛋白肌動(dòng)蛋白磷酸酐酶煙草花葉病毒外殼蛋白94 00067 00

11、043 00030 00017 500每種蛋白含量為40g。用時(shí)加入200l樣品溶解，經(jīng)處理后，上樣10l（2g）就能顯示出清晰的條帶。 1.2.2 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒 自己配制低分子量或高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合試劑。如買不到標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒時(shí)，可參考常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及其分子量表。從中選擇35種蛋白質(zhì)，如馬心細(xì)胞色素C（Mr12 500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25 000）、豬胃胃蛋白酶（Mr35 000）、雞卵卵清蛋白（Mr43 000）、牛血清白蛋白（Mr67 000）等蛋白質(zhì)，按照每種蛋白0.51mgml樣品溶解液配制。可配制成單一蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。 1.2.3

12、 連續(xù)體系SDS-PAGE有關(guān)試劑 0.2molL-1pH7.2磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸氫二鈉(AR)Na2HPO42H2O 25.63g或Na2HPO412H2O 51.58g，再稱取磷酸二氫鈉(AR)NaH2PO4H2O7.73g或NaH2PO42H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容到1000ml。 樣品溶解液：0.01molpH7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1%SDS、1%巰基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚藍(lán)。用來(lái)溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測(cè)固體蛋白質(zhì)樣品。連續(xù)體系樣品溶解液配制SDS巰基乙醇甘油溴酚藍(lán)0.2molL-1磷酸鹽緩沖液加重蒸水至最后總體積為100mg0.1ml1ml2mg0.

13、5ml10ml如樣品為液體，則應(yīng)用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。凝膠貯液：稱Acr 30g，Bis 0.8g，加重蒸水至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶，4貯存可用12個(gè)月。 凝膠緩沖液：稱SDS 0.2g，加0.2molL-1 pH7.2磷酸鹽緩沖液至100ml。4貯存，用前，稍加溫使SDS溶解。1%TEMED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶?jī)?nèi)4貯存。 10%過(guò)硫酸銨（AP）：稱AP1g，加重蒸水至100ml，此液應(yīng)每周新配，置棕色瓶?jī)?nèi)，4貯存。 電極緩沖液（0.1%SDS，0.1molL-1 pH7.2磷酸鹽緩沖液）：稱SDS 1g，加500ml0.2molL-1 pH

14、7.2磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水定容至1000ml。 1.2.4不連續(xù)體系SDS-PAGE有關(guān)試劑10%（W/V）SDS溶液：稱5gSDS，加重蒸水至50ml，微熱使其溶解，置試劑瓶中，4貯存。SDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解。 1%TEMED（V/V）：取1mLTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4貯存。 10%AP（W/V）：稱AP1g，加重蒸水至10ml。最好臨用前配制。 樣品溶解液：內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01molL-1 pH8.0 Tris-HCl緩沖液。 先配制0.05molL-1 pH8.0 Tris-H

15、Cl緩沖液：稱Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再中入約3ml 1molL-1 HCl，調(diào)pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。 凝膠貯液 30%分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱Acr 29.2g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，過(guò)濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。 10%濃縮膠貯液：稱Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，過(guò)濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。 凝膠緩沖液 分離膠緩沖液（3.0molL-1 pH8.9 Tris-HCl緩沖液）：稱Tris 36.3g，加少許重蒸水使其溶解，再加1molL-1 HCl約48ml，調(diào)pH至

16、8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4貯存。 濃縮膠緩沖液（0.5molL-1 pH6.7 Tris-HCl緩沖液）：稱Tris 6.0g，加少許重蒸水使其溶解，再加1molL-1 HCl約48ml調(diào)pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4貯存。 電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05molL-1 Tris0.384 molL-1甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。 1%瓊脂（糖）溶液：稱瓊脂（糖）1g，加電極緩沖液100ml，加熱使其溶解，4貯存，備用。SDS巰基乙醇溴酚藍(lán)蔗糖0.05molL-1Tr

17、is-HCl加重蒸水至最后總體積為100mg0.1ml2mg4g2ml10ml1.2.5 不連續(xù)體系樣品溶解液配制如樣品為液體，則應(yīng)用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。 2.配膠及凝膠板的制備2.1配膠 根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。由于SDS-PAGE有連續(xù)系統(tǒng)及不連續(xù)系統(tǒng)兩種，兩者間有不同的緩沖系統(tǒng)，因而有不同的配制方法。 電極緩沖液為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS。電極緩沖液為0.1molL-1pH7.2磷酸緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS。2.1.1 SDS連續(xù)體系凝膠配制SDS-連續(xù)體系凝膠的制備：配制20ml所需濃度的分離膠，用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將分離膠

18、混合液加到兩塊玻璃板的縫隙內(nèi)直至距離短玻璃板上緣0.5cm處，插入樣品槽模板。為防止?jié)B漏，可在上、下電極槽中加入蒸餾水，但不能超過(guò)短板，以防凝膠被稀釋，約30min，凝膠聚合，繼續(xù)放置2030min后，倒去上、下電極槽中的蒸餾水，小心拔出梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去殘余水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面。倒入電極緩沖液即可進(jìn)行預(yù)電泳或準(zhǔn)備加樣。 2.1.2 SDS-不連續(xù)體系凝膠的制備 分離膠的制備：按表配制20ml10%分離膠，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入，約34mm高，以進(jìn)行水封。約30min后，凝膠

19、與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。 濃縮膠的制備：配制10ml 3%濃縮膠，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約30min后凝膠聚合，再放置2030min，使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒(méi)過(guò)短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。 3. 樣品的處理與加樣3.1樣品的處理根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液，按51mg/1mL樣品溶解液，溶解后，在100沸

20、水浴中保溫3min，取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時(shí)不用，可入在20冰箱保存較長(zhǎng)時(shí)間，使用前在100沸水中加熱3min。3.2、加樣一個(gè)凹形樣品槽內(nèi)，只加一種樣品或已知分子量的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，加樣體積要根據(jù)凝膠厚及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為1020L（即210g蛋白）。如樣品較稀，加樣體積可達(dá)100L。如樣品槽中有所泡，可用注射器針頭挑除。加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過(guò)電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層。3.3 電泳分離膠聚合后是否進(jìn)行預(yù)電泳則應(yīng)根據(jù)需要

21、而定，SDS連續(xù)系統(tǒng)預(yù)電泳采用30mA60120min。3.3.1連續(xù)系統(tǒng)在電極槽中倒入0.1%SDS pH7.2 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，連接電泳儀與電泳槽，上槽接負(fù)極，下槽接正極。打開(kāi)電源，將電流調(diào)至20mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至50mA，待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊11.5cm處，停止電泳，一般需56h。 3.3.2不連續(xù)系統(tǒng)在電極槽中倒入pH8.3Tris-HCl電級(jí)緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS即可進(jìn)行電泳。在制備濃縮膠后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，因預(yù)電泳會(huì)破壞pH環(huán)境，如需要電泳只能在分離膠聚合后，并用分離膠緩沖液進(jìn)行。預(yù)電泳后將分離膠面沖洗干凈，然后才能制備濃縮膠。電泳條件

22、也不同于連續(xù)SDS-PAGE。開(kāi)始時(shí)電流為10mA左右，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為2030mA，當(dāng)染料前沿距硅橡膠框底邊1.5cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。 4. 凝膠板剝離與固定電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開(kāi)短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標(biāo)志，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。將凝膠板放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入固定液。固定液取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。染色液稱考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加上述固定液250ml，過(guò)濾后應(yīng)用。脫色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。 將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h左右，用蒸餾水

23、漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。固定與染色5. 結(jié)果與分析5.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離（cm）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（cm）。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.2根據(jù)未知蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。 6. 注意事項(xiàng) 6.1 由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；剝膠時(shí)凝膠板易斷裂，為防止引現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣

24、品槽模板及電泳槽用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”仔細(xì)清洗。玻璃板浸泡在重鉻酸鉀洗液34h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復(fù)刷洗，最后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。 6.2 安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng)、短玻璃板的硅橡膠框時(shí)，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽板梳齒應(yīng)平整光滑。 6.3 在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進(jìn)行。洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。 6.4 電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向泳動(dòng)，電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流、電壓，

25、過(guò)高或過(guò)低無(wú)可影響電泳效果。 6.5 SDS純度：在SDS-PAGE中，需高純度的SDS，市售化學(xué)純SDS需重結(jié)晶一次或兩次方可使用。重結(jié)晶方法如下：稱20g SDS放在圓底燒瓶中，加300mL無(wú)水乙醇及約半牛角匙活性碳，在燒瓶上接一冷凝管，在水浴中加熱至乙醇微沸，回流約10min，用熱布氏漏斗趁熱過(guò)濾。濾液應(yīng)透明，冷卻至室溫后，移至20冰箱中過(guò)夜。次日用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，再用少量20預(yù)冷的無(wú)水乙醇洗滌白色沉淀3次，盡量抽干，將白色結(jié)晶置真空干燥器中干燥或置40以下的烘箱中烘干。 6.6 用SDS處理蛋白質(zhì)樣品時(shí)，每次都會(huì)在沸水溶中保溫35min，以免有亞穩(wěn)聚合物存在。 6.7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的

26、相對(duì)遷移率最好在0.20.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測(cè)定未知物分子量時(shí)，都應(yīng)同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不是利用過(guò)去的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用此法測(cè)定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整的分子量。為測(cè)得精確的分子量范圍，最好用其他測(cè)定蛋白分子量的方法加以校正。此法對(duì)球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測(cè)定較好，對(duì)糖蛋白，膠原蛋白等分子量測(cè)定差異較大。 6.8 對(duì)樣品的要求：應(yīng)采納低離子強(qiáng)度的樣品。如樣品中離子強(qiáng)度高，則應(yīng)透析或經(jīng)離子交換除鹽。加樣時(shí)，應(yīng)保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以1015L為宜，如樣品系較稀的液體狀，為保證區(qū)帶清晰，加樣量可增加，同時(shí)應(yīng)將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。

27、6.9 由于凝膠中含SDS，直接制備干板會(huì)產(chǎn)生龜裂現(xiàn)象。如需制干板，則用25%異丙醇內(nèi)含7%乙酸浸泡，并經(jīng)常換液，直到SDS脫盡（約需23天才可制備干板。為方便起見(jiàn)，常采用照像法，保存照片。蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳 一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋劢梗↖soelectrofocusing,IEF）,根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離；第二向?yàn)镾DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），按亞基分子量大小進(jìn)行分離。經(jīng)過(guò)電荷和分子量?jī)纱畏蛛x后，可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。等電聚焦是一種特殊的聚丙烯酰胺凝膠電泳，其特點(diǎn)是在凝膠中加入一種兩性電解質(zhì)載體，從而使凝膠在電場(chǎng)中形成

28、連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)是典型的兩性電解質(zhì)分子，它在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陰離子形式向電場(chǎng)的正極移動(dòng)，在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陽(yáng)離子形式向負(fù)極移動(dòng)。這種泳動(dòng)只有在等于等電點(diǎn)的pH環(huán)境中才停止。如果在一種pH梯度的環(huán)境中將含有各種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳，那么在電場(chǎng)作用下，不管這一群混雜的蛋白質(zhì)分子原始分布如何，各蛋白質(zhì)分子將按照它們各自的等電點(diǎn)大小在pH梯度相對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行聚集經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，不同的蛋白質(zhì)組分別分割在不同的區(qū)域之中。這個(gè)過(guò)程稱作等電聚焦蛋白質(zhì)聚集的部位蛋白質(zhì)所帶電荷為零，測(cè)定此部位的pH值，即可知該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PA

29、GE），主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量，SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑則能使半光氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子被解聚成它們的多肽鏈。解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同分子之間原有電荷的差異。因此這種膠束在SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD到200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子

30、量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)雙向電泳是將蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量?jī)煞N特性結(jié)合起來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的技術(shù)，因而具有較高的分辨率和靈敏度，已成為蛋白質(zhì)特別是復(fù)雜體系中的蛋白質(zhì)檢測(cè)和分析的一種強(qiáng)有力的生化手段。二、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1、凝膠原液（28.38%Acr +1.62%Bis）。2、TEMED原液。3、過(guò)硫酸銨。4、pH3.510、pH46、pH68兩性電解質(zhì)載體。5、尿素。6、10%非離子去污劑NP-40。7、50mmol/L NaOH；。8、25mmol/LH3PO4 。9、SDS。10、60mmolTris-Cl pH6.8。11、2-巰基乙醇。12、10倍SDS-PAGE電極緩沖液（0.25mo

31、l/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。13、0.05%溴酚藍(lán)。14、1%瓊脂。15、蛋白質(zhì)抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗壞血酸，1%PVP，5%甘油，0.02% 2-巰基乙醇）。16、丙酮。17、研缽，石英砂，燒杯，試管，玻棒，量筒。18、雙向電泳槽一套（包括圓盤(pán)電泳槽和垂直板狀電泳槽等），電泳儀。 三、實(shí)驗(yàn)方法1、葉片可溶性蛋白質(zhì)的制備： 取葉片200mg加少許石英砂于液氮中研成粉末懸浮于3ml可溶性蛋白抽提液中，4放置1小時(shí)以上，于4，15000 r/min條件下離心15min，取上清按1

32、：4與冷丙酮混合，-20放置3小時(shí)以上或過(guò)夜，同樣離心取沉淀，用80%丙酮洗兩次，同上離心，真空干燥，溶于400l（9.5mol/L尿素，5mmol/L K2CO3 ，1.25%SDS，0.5% 2-巰基乙醇，2.2%兩性電解質(zhì)PH 3.510，6%TritonX-100）中，經(jīng)離心取上清上樣。2、第一向等電聚焦電泳（IEF）2.1 玻管的準(zhǔn)備：取內(nèi)徑1.52mm，長(zhǎng)16cm玻管用乙醇/鹽酸為6/4的溶液浸泡30min再用蒸餾水沖洗，烘干。灌膠前用封口膜封住管的一端，并固定。2.2 凝膠的配制與電聚焦：取尿素2.06g，加入0.75ml蒸餾水，0.75ml 10%的NP-40，37水浴（不能超

33、過(guò)37）待尿素充分溶解后加入0.5ml的凝膠原液和兩性電解質(zhì)0.05mlpH3.510、0.05ml pH46、0.15mlpH68，再加入10l 10% AP和3l TEMED，混勻后灌膠。在灌好的膠管的頂部覆蓋1cm的雙蒸水，室溫聚合1小時(shí)以上，待膠聚合好后吸去上層水溶液加樣30l，再加入20l樣品覆蓋液8mol/L尿素，1.5%兩性電解質(zhì)（0.3%pH3.510，0.3%pH46，0.9%pH68），5%NP-40，5%2-巰基乙醇和50mmol/LNaOH至管口，待電泳。電極液為：上槽（負(fù)極）50mmol/LNaOH，下槽（正極）25mmol/LH3PO4，在室溫下，按200V15mi

34、n，300V20min，400V30min，500V30min，600V16h的程序進(jìn)行聚焦。2.3、取膠、pH梯度的測(cè)定及膠條的平衡聚焦結(jié)束后，取出玻管，吸去兩端的溶液并以雙蒸水清洗，然后用10ml注射器套上200l的tip頭吸取一些水從進(jìn)樣的一端輕輕將膠條打出。將要測(cè)定的膠條按每段1cm分成若干段后，安順序裝入盛有脫氣的雙蒸水的小瓶中，放4冰箱過(guò)夜，次日用pH計(jì)分別測(cè)定各段的pH值。對(duì)要進(jìn)行第二向SDS-PAGE的膠條則必須放入平衡液60mmol/LTris-Cl pH6.8，2%SDS，5%2-巰基乙醇，10%甘油，0.05%溴酚藍(lán)中平衡1030min（平衡后的膠條酸端染成淡綠色而堿端染

35、成深藍(lán)色）。暫不進(jìn)行第二向電泳的膠條可放入-20保存數(shù)日。2.4、第二向SDS-PAGE選用DDY-28D型（北京六一儀器廠生產(chǎn)）電泳槽（規(guī)格為2001301mm，雙板），分離膠濃度13%，濃縮膠濃度5%，分離膠長(zhǎng)160mm，濃縮膠長(zhǎng)40mm（灌至玻板上沿），灌好濃縮膠后在一端插入單孔梳，以便加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品。待膠聚合后，將第一向平衡好的膠條平放于濃縮膠頂部（避免膠條拉伸）并用1%瓊脂糖（用電極緩沖液配制）封膠。此時(shí)應(yīng)注意避免膠條與濃縮膠上沿之間產(chǎn)生氣泡（可先用尖頭滴管加熱到70的瓊脂糖在濃縮膠上沿薄薄地涂上一層，立即將平衡好的膠條平放于其上，再用注射器針頭挑動(dòng)膠條使其結(jié)合完好）。待瓊脂

36、糖凝固后拔出單孔梳，加入適量按變性膠處理過(guò)的marker，加滿電極緩沖液，4冰箱電泳，恒壓200V，至溴酚藍(lán)達(dá)膠底部為止（約5h）。2.5、染色與脫色2.5.1 考馬斯亮藍(lán)染色電泳結(jié)束后，剝下膠板，放入染色液（0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250，50%甲醇，10%甲酸40%水）中于室溫2h，換脫色液（慢脫色液：7%乙酸；快脫色液：30%乙醇，10%乙酸），脫色至背景清晰。溫度升高，染色或脫色速度相對(duì)加快。脫色好后的膠最好立即照相，也可放入7%乙酸于4冰箱保存隨時(shí)照相。2.5.2 硝酸銀染色：（整個(gè)操作在搖床上進(jìn)行）（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去離子水，60 分鐘。（

37、2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入），17g醋酸鈉，165ml去離子水，30分鐘。（3） 清洗：用250ml 的去離子水清洗3 次每次5 分鐘。（4） 銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水，（使用之前配制）20 分鐘。（5） 顯色：6.25g碳酸鈉，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去離子水。（6） 終止：5%的醋酸。（7） 照相分析。（8） 保存制作干膠。結(jié)果舉例】 3.注意事項(xiàng)樣品預(yù)處理是雙向電泳的關(guān)鍵。等電聚焦電泳的樣品中必須去除鹽離子、色素、酚類和核酸等物質(zhì)，還要加入防止蛋白質(zhì)水解的抑制劑，所以根據(jù)不同樣品需要查閱有關(guān)資料進(jìn)行樣品預(yù)處理。是否聚

38、焦的好壞與兩性電解質(zhì)的質(zhì)量也有關(guān)系。4. 雙向電泳常見(jiàn)問(wèn)題雙向電泳常見(jiàn)問(wèn)題 1. 重泡脹后的膠可以不用轉(zhuǎn)移到另一個(gè)電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？ 一般情況下是可以的。但當(dāng)上樣量特別大時(shí)，可能會(huì)有一部分蛋白質(zhì)沒(méi)有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會(huì)有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)電泳漕中進(jìn)行電泳。 2. 跑第一向時(shí)，為什么要設(shè)定一個(gè)電流的最大值電壓(50 A/ 膠)？ 電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會(huì)導(dǎo)致膠條的溫度增加。當(dāng)溫度超過(guò) 30 攝氏度時(shí)，緩沖液里的尿素就容易解離，產(chǎn)生一些極性分子，從而對(duì)等電聚焦產(chǎn)生影響。 3. 跑第一向時(shí)，為什么剛開(kāi)始的電壓比較低，而后逐漸增高？ 剛開(kāi)始時(shí)，體系內(nèi)的帶電小分子比較多（比如無(wú)機(jī)鹽和雙極性分子）。所以在這個(gè)階段，電流主要是由這些小分子的移動(dòng)所產(chǎn)生的。由于這些分子質(zhì)量小，移動(dòng)他們不需要很高的電壓。當(dāng)這些小分子移動(dòng)到他們的目的地時(shí)（無(wú)機(jī)鹽移動(dòng)到極性相反的電極；兩性分子移動(dòng)到對(duì)應(yīng)的 pH 條帶），體系內(nèi)的蛋白質(zhì)才開(kāi)始肩負(fù)起運(yùn)載電流的任務(wù)，逐漸向所對(duì)應(yīng)的