1、1CD-DST膠滴腫瘤藥敏檢測技術小林昶運（Kobayashi H）博士CD-DST（癌癥化療藥物敏感實驗癌癥化療藥物敏感實驗）2 腫瘤個體化化療簡介 腫瘤藥敏實驗發展歷程 腫瘤藥敏實驗方法分類 CD-DST檢測介紹 CD-DST法實驗流程3腫瘤個體化化療簡介腫瘤個體化化療簡介4一、腫瘤個體化化療簡介2022-3-224資料顯示：我國惡性腫瘤年發病例數為資料顯示：我國惡性腫瘤年發病例數為200萬，死亡約萬，死亡約150萬，并以萬，并以3的速度遞增且呈年輕化趨勢，居各類疾病中死亡率之最的速度遞增且呈年輕化趨勢，居各類疾病中死亡率之最5 腫瘤治療的三大手段 手術治療：局部治療 放射治療（簡稱放療）

2、：局部治療 化學藥物治療（簡稱化療）： 全身性治療，近100種2022-3-225化療藥物：主要作用是阻止癌細胞增殖、浸潤、轉移直到最終殺滅癌組織。目前所使用的絕大多數化療藥物，主要是利用藥物抑制細胞增殖和腫瘤生長效應發揮抗癌作用細胞毒作用（化療藥物副作用的根源）6長期以來，由于無法在治療前判斷不同腫瘤個體對藥物的敏感性和耐藥性，臨床醫生主要根據經驗對患者進行治療，具有相對的盲區。（培養成功率低、臨床符合率低等）不正確的治療不僅使患者遭受痛苦，身體狀態嚴重受損，同時可誘導腫瘤細胞產生對多種藥物的聯合耐藥，導致化療失?。毎咀饔茫?。因此，臨床需要能在化療前為患者篩選敏感性藥物的檢測技術，客觀的

3、針對不同個體選擇和優化化療藥物（組合），實現腫瘤病人的個體化治療。2022-3-22677 個體化治療（最適宜藥物療法）-藥敏試驗 目前代表性體外藥敏實驗：MTT 、ATP-TCA、HDRA。不同程度地部分解決腫瘤個體化治療的問題，但均存在所需細胞數量多，不能解決小量標本進行藥敏檢測的問題。 CD-DST技術克服了其它方法的缺點：所需細胞數量少、敏感、快速、臨床相關性好（日本臨床廣泛應用）2022-3-2278 由于遺傳背景的差異, 患者對化療的反應各不相同：有的患者經化療后可達到完全緩解, 有的卻表現為無效甚至病情進展 不同種類的腫瘤, 對抗癌藥物的敏感性不同, 即使同一種類型的腫瘤（臨床分

4、期、病理類型、患者基本狀態相同）, 不同的患者對藥物的敏感性及預后也不相同。 必須化療藥物個體化2022-3-2289 各種腫瘤常見化療方案 各種腫瘤癌癥化療方案-20130503.docx2022-3-2210藥敏試驗發展歷程1953年，Blank和Speer提出了“化療(Chemotherapy)”的理念1969年，Cline提出了理想的藥敏實驗方法應該具備的特點：簡單、快速、敏感、可篩選不同藥物、與臨床有良好相關性1978年，Bogden將裸鼠腎包膜下人類癌模型應用于化療藥敏實驗（SRCA）1983年，Mosmann采用四氮唑鹽比色法（MTT）進行藥敏實驗1988年，Scvin等將三磷酸

5、腺苷-生物熒光腫瘤藥敏檢測技術（ATP-TCA）應用于卵巢癌腫瘤藥物敏感性檢測1997年，小林昶運（Kobayashi H）提出CD-DST技術，并指導醫生對患者進行個體化治療。11腫瘤藥敏試驗方法分類12按照培養方法的不同分類腫瘤單細胞培養：單層培養法，HTCA(人腫瘤細胞集落測定)HDRA (立體微小組織塊細胞培養法)SRCA (腎包膜下移植藥敏檢測)CD-DST（膠滴腫瘤藥敏檢測技術）MTT(四氮唑化合物)法ATP-TCA法DISC法(區別染色細胞毒檢測)熒光細胞印記分析法FCM法(流式細胞術) 中性紅染色法按照測定原理的按照測定原理的不同分類不同分類13一、單層培養法獲得腫瘤標本，制成

6、單細胞懸液后，加入不同濃度的化療藥，檢測細胞的存活量得出藥敏試驗結論。特點：方法簡單、實用失去了體內的三維結構藥物接觸濃度與體內不同人肝癌細胞14二、HTCA法(人腫瘤細胞集落測定法)將腫瘤細胞分別暴露于各種抗癌藥物，再接種到軟瓊脂上，經過4-6周，腫瘤細胞將增殖并最終長成集落，對照集落形成數量的比較，從而分析受試藥物的抗增值效應。特點：幾乎適用于所有類型的腫瘤實驗周期長（4-6 周）費時費力，主觀性強骨髓瘤細胞集落神經母細胞瘤集落15三、HDRA(微小組織塊培養藥敏實驗)在膠原上培養微小腫瘤組織塊（1 mm3），加入化療藥物后，觀察組織塊對化療藥物的敏感性。特點：更接近機體實體瘤環境方法繁瑣

7、MTT處理后16四、 SRCA法(腎包膜下移植藥敏檢測)在裸鼠腎包膜下接種人類腫瘤組織，腫瘤形成后，將化療藥物注入裸鼠腹腔進行化療藥物實驗，通過測量腫塊兩頂端直徑，比較腫瘤體積改變，評估化療藥物效果。特點：保持腫瘤原有的生物學特性能客觀反映化療藥物敏感程度實驗動物要求高，價格昂貴操作過程較復雜、接種成功率低GFP標記的腫瘤細胞17五、CD-DST法(膠滴腫瘤藥敏檢測)將腫瘤細胞包埋于膠原凝膠滴中進行立體培養, 使其在接近人體生理狀態的環境中對抗癌藥物的敏感性進行定量分析。特點：原代腫瘤細胞培養成功率高少量標本即可進行試驗抗癌藥物效果與臨床匹配度很高18名稱2D/3D培養細胞/組織培養結果判斷標

8、準單層培養法2D細胞形態學的改變或同位素前提的摻入量多少HTCA法(人腫瘤細胞集落測定法)2D細胞集落形成數量HDRA(微小組織塊培養藥敏實驗)3D組織測定活細胞數SRCA法(腎包膜下移植藥敏檢測)3D組織測量腫瘤塊兩頂端直徑CD-DST法(膠滴腫瘤藥敏檢測)3D細胞測定活細胞數19名稱檢測物質顏色特點MTT(四氮唑化合物)法甲臜紫色方法簡便，細胞量大ATP-TCA法ATP熒光檢測效率高、體內體外符合率較高、自動化程度較高、間質細胞干擾較大DISC法（區別染色細胞毒檢測法）堅固綠或堅固綠-苯胺黑染料亮綠色不需要單細胞懸液、不依賴細胞的分裂，僅應用于血液系統標本熒光細胞印跡分析法熒光素熒光測試范

9、圍廣，熒光易淬滅FCM法（流式細胞術）FDA(乙酰乙酸熒光素)或PI(碘化丙啶)或熒光藥物含量等熒光所需細胞數量少；測量的參數多，儀器昂貴、技術需求高中性紅染色法活細胞紅色操作簡便，費用較低，結合成像系統可定量分析20目前體外抗癌藥物敏感性試驗的問題點原代培養成功率及試驗成功率低很難做到體外三維共培養，不能良好模擬體內環境藥物接觸濃度高真陽性率低（藥敏試驗判斷為敏感的抗癌藥物實際臨床效果不顯著）無法區分混在一起的成纖維細胞和癌細胞數據偏差大多數方法缺乏臨床驗證數據多數方法質控不嚴謹21CD-DST法實驗流程22DAY 1DAY 2DAY 3DAY 9技術流程圖23一、腫瘤組織標本采集數枚大小為1cm3的活性較高的標本此實驗所需手術標本的量：肺癌、大腸癌等固體癌需要0.5-1.0g間質較多的乳腺癌、胃癌、大腸癌等需1.0-3.0g24二、分散腫瘤細胞將腫瘤組織分散成小的細胞團切碎的腫瘤組織分散的腫瘤細胞25三、膠原凝膠包被培養瓶預培養促進腫瘤細胞生長，清除血細胞、死細胞及非細胞雜質等26四、膠原凝膠滴培養癌細胞可在膠滴培養基內良好地增殖，體現出與活體內相同的生物形態及活性。27五、抗癌藥物接觸 藥物濃度數據為長期實驗研究獲得，與臨床用藥效果相符。28六、無血清培養 藥物清洗后，需繼續培養5-7天，再檢測藥物抗癌效果。PCM2培養基培養5-7天29