1、實驗二 蛋白質和氨基酸的呈色反應一、實驗目的1.了解構成蛋白質的基本結構單位及主要聯接方式。2.了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理。3.學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法二、呈色反應：(一)雙縮脫反應：1.原理：尿素加熱至180左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發生此反應。可用于蛋白質的定性或定量測定。一切蛋白質或二肽以上的多肽部有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。2.試劑：(1)尿索： 10克(2)10%氫氧化鈉溶液 250毫升(3)1%硫酸銅溶液 6

2、0毫升(4)2卵清蛋白溶液 80毫升3.操作方法：取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現的粉紅顏色。避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約l毫升和10氫氧化鈉溶液約2毫升，搖勻，再加1硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫色的出現。(二)茚三酮反應1.原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。該反應十分靈敏，1：1 500 000濃度的氨

3、基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。 茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質。 反應機理如下：此反應的適宜pH為57，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。2.試劑：(1)蛋白質溶液 100毫升2卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液(蛋清：水1：9)(2)0.5甘氨酸溶液 80毫升(3)0.1茚三酮水溶液 50毫升(4)0.1茚三酮乙醇溶液 20毫升 3.操作方法： (1)取2支試管分別加入蛋白質溶液和甘氨酸溶液1毫升，

4、再各加0.5毫升0.1茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍。 (2)在一小塊濾紙上滴一滴0.5的甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴上一滴0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現。(三)黃色反應：1.原理：含有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應式如下：多數蛋白質分子臺有帶苯壞的氨基酸，所以有黃色反應，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應。2.試劑：(1)雞蛋清溶液 100毫升將新鮮雞蛋的蛋清與水按1：20混勻，然后用六層紗布過濾。 (2)大豆提取液 10

5、0毫升將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀用紗布過濾。(3)頭發 (4)指甲(5)0.5苯酚溶液 50毫升(6)濃硝酸 200毫升(7)0.3色氨酸溶液 10毫升(8)0.3酪氨酸溶液 10毫升(9)10氫氧化鈉溶液 100毫升3.操作方法：向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現的現象，有的試管反應慢可略放置或用微火加熱。待各管出現黃色后，于室溫下逐滴加入10氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。(四)乙醛酸反應1.原理：在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應生成紫色物質,反應機理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍相似的物質。含有色氨酸的蛋白質也有此反應。2.試劑：(1)蛋白質溶液 100毫升 雞蛋清：水1：20(2)0.03色氨酸溶液 10毫升(3)冰醋酸 200毫升(4)濃硫酸(分析純) 100毫升3.操作方法： 取3支試管。編號。分別按上表加入蛋白質溶液、色氨酸