1、關于免疫組化技術關于免疫組化技術 (2)(2)現在學習的是第一頁，共47頁組織化學染色技術組織化學染色技術v Histochemistry Techniquev 觀察對象 組織、細胞v 使用工具 普通顯微鏡 熒光顯微鏡形態與結構現在學習的是第二頁，共47頁蘇木素曙紅現在學習的是第三頁，共47頁免疫組織化學染色技術免疫組織化學染色技術v Immunohistochemistry Technique 指用標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原（目的蛋白）進行定性、定位、定量測定的一項免疫檢測方法。現在學習的是第四頁，共47頁Immunohistochemis

2、try Technique特定蛋白（抗原）現在學習的是第五頁，共47頁（透膜）現在學習的是第六頁，共47頁授課提綱授課提綱v 基質標本的制作v 熒光免疫組化技術v 酶免疫組化技術v 相關問題與解決方案現在學習的是第七頁，共47頁授課提綱授課提綱v 基質標本的制作v 熒光免疫組化技術v 酶免疫組化技術v 相關問題與解決方案現在學習的是第八頁，共47頁標本類型標本類型v 組織標本 冰凍切片 石蠟切片v 細胞標本 體外培養細胞（單層細胞、懸浮細胞） 體液細胞（涂片）現在學習的是第九頁，共47頁固定與保存固定與保存v 固定的目的 防止細胞自溶，保持細胞形態與機構； 保存組織細胞抗原性； 防止標本脫落；

3、 防止滋生微生物，預防組織腐敗v 標本固定以不損傷細胞形態、不損傷抗原特異性為基本原則現在學習的是第十頁，共47頁固定與保存固定與保存v 固定劑 蛋白類 乙醇或甲醇 微生物類 丙酮、三氯化碳 多糖類 10%福爾馬林現在學習的是第十一頁，共47頁抗原修復抗原修復v 目的： 充分暴露抗原表位，利于抗體識別。v 方法： 酶（無花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法； 鹽酸水解 微波處理 煮沸法現在學習的是第十二頁，共47頁授課提綱授課提綱v 基質標本的制作v 熒光免疫組化技術v 酶免疫組化技術v 相關問題與解決方案現在學習的是第十三頁，共47頁標記物標記物v 熒光素 異硫氰酸熒光素（FITC） 四乙基羅丹明（

4、RB200） 藻紅蛋白（PE） 藻紅蛋白花青苷（PE-Cy5）現在學習的是第十四頁，共47頁技術類型技術類型v 直接染色法 熒光素直接標記在特異性抗體（Ab1)v 間接染色法 熒光素標記第二抗體（Ab2) 第二抗體針對第一抗體種屬特異性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）現在學習的是第十五頁，共47頁直接法直接法現在學習的是第十六頁，共47頁實例：細胞鑒定實例：細胞鑒定v 免疫細胞及其亞群（流式細胞術） T細胞 CD3+ CD4+ CD8+ B細胞 NK細胞現在學習的是第十七頁，共47頁免疫細胞分類與計數免疫細胞分類與計數18Suppressor T cellR1T cell / B cell

5、Helper T cell現在學習的是第十八頁，共47頁間接法間接法現在學習的是第十九頁，共47頁實例：檢測抗核抗體實例：檢測抗核抗體v 檢測原理 已知抗原 肝細胞/HEp-2 待檢抗體 第二抗體 熒光標記兔抗人Ig現在學習的是第二十頁，共47頁實例：檢測病原體（病毒、細菌）實例：檢測病原體（病毒、細菌）v檢測原理 待檢病毒（抗原） 已知抗體單抗或多抗第二抗體熒光標記羊抗鼠（或兔）Ig現在學習的是第二十一頁，共47頁熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）v關鍵 汞燈光源 激發濾片 暗場聚光鏡 吸收濾片現在學習的是第二十二頁，共47頁熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）現在學習的是第二十三

6、頁，共47頁熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）現在學習的是第二十四頁，共47頁授課提綱授課提綱v 基質標本的制作v 熒光免疫組化技術v 酶免疫組化技術v 相關問題與解決方案現在學習的是第二十五頁，共47頁主要類型主要類型v 酶標記抗體 同熒光免疫組化v 非酶標記抗體 酶-抗酶系統 生物素-鏈霉親和素系統現在學習的是第二十六頁，共47頁技術特點技術特點v以酶作為抗原，制備抗酶抗體；v酶（抗原）與抗酶（抗體）結合制備酶-抗酶復合物；v通過橋聯抗體與識別系統（待檢抗原-特異性抗體）連接；現在學習的是第二十七頁，共47頁酶橋法酶橋法現在學習的是第二十八頁，共47頁常用酶和相應底物常用酶和相應底物

7、v 過氧化物酶 Peroxidase（P） 二氨基聯苯胺（DAB）v 堿性磷酸酶（AP） alkaline phosphatase（AP） 溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP） 現在學習的是第二十九頁，共47頁過氧化物酶過氧化物酶- -抗過氧化物酶（抗過氧化物酶（PAPPAP）法）法PAPPAP復合物現在學習的是第三十頁，共47頁抗體選擇抗體選擇v 第一抗體 識別抗原v 第二抗體（橋聯抗體） 能同時與第一、第三抗體結合v 第三抗體 抗酶抗體 與第一抗體同源現在學習的是第三十一頁，共47頁PPPAAA 圖圖 雙酶雙底物雙酶雙底物(復合物法復合物法)雙重酶標染色原理雙重酶標染色原理兔兔PAPGAR IgG

8、兔抗兔抗Ag鼠鼠APAAPGAM. IgG鼠抗鼠抗現在學習的是第三十二頁，共47頁實例：淋巴瘤輕鏈雙重染色法實例：淋巴瘤輕鏈雙重染色法v 一抗一抗 兔抗兔抗 鼠抗鼠抗v 二抗二抗 羊抗兔羊抗兔 羊抗鼠羊抗鼠v 顯色系統顯色系統 PAPPAP APAAP APAAP現在學習的是第三十三頁，共47頁親和素親和素- -生物素生物素- -過氧化物酶復合體（過氧化物酶復合體（ABCABC）v 生物素（Biotin）v 親和素（Avidin）v 生物素標記抗體（B-Ab）v 生物素標記過氧化物酶（B-P）現在學習的是第三十四頁，共47頁親和素親和素- -生物素生物素- -過氧化物酶復合體（過氧化物酶復合體

9、（ABCABC）現在學習的是第三十五頁，共47頁EnVision現在學習的是第三十六頁，共47頁授課提綱授課提綱v 基質標本的制作v 熒光免疫組化技術v 酶免疫組化技術v 相關問題與解決方案現在學習的是第三十七頁，共47頁現在學習的是第三十八頁，共47頁識別抗體（第一）選擇識別抗體（第一）選擇v 單克隆抗體（McAb） 特異性強 敏感性差v 多克隆抗體（McAb） 特異性差 敏感性強現在學習的是第三十九頁，共47頁識別（第一）抗體選擇識別（第一）抗體選擇構象 糖基化碳水化合物現在學習的是第四十頁，共47頁第二抗體選擇第二抗體選擇現在學習的是第四十一頁，共47頁選擇顯色系統選擇顯色系統v 熒光免疫組化v 酶免疫組化 PAP APAAP ABC LAB？現在學習的是第四十二頁，共47頁封閉非特異性結合封閉非特異性結合現在學習的是第四十三頁，共47頁特異性顯色特異性顯色v 具備 特定部位顯色 特定組織、特定細胞、特定結構 不均一顯色 現在學習的是第四十四頁，共47頁非特異性