1、 第三章第三章 DNADNA重組的基本操作重組的基本操作 一、核酸的分離提取一、核酸的分離提取 二、電泳技術二、電泳技術 三、外源三、外源DNADNA片段的制備片段的制備 四、轉化方法四、轉化方法 五、重組克隆的挑選五、重組克隆的挑選一、核酸的分離提取一、核酸的分離提取(isolate)(isolate) （一）、（一）、DNADNA的提取的提取一般原理：一般原理：細胞分散：細胞分散：動物組織采用勻漿法；植物組織材料動物組織采用勻漿法；植物組織材料采用液氮法；微生物材料收集細胞，采用離心法。采用液氮法；微生物材料收集細胞，采用離心法。細胞破碎：細胞破碎：對于動物材料，直接加入去污劑（多對于動物

2、材料，直接加入去污劑（多位位SDS),SDS),有細胞壁結構的細胞，用分解細胞壁的有細胞壁結構的細胞，用分解細胞壁的酶處理，如溶菌酶處理大腸桿菌；用纖維素酶處酶處理，如溶菌酶處理大腸桿菌；用纖維素酶處理植物細胞等。然后用去污劑處理使細胞膜破裂，理植物細胞等。然后用去污劑處理使細胞膜破裂，原生質體釋放。原生質體釋放。去除蛋白：去除蛋白：蛋白酶蛋白酶K K處理；酚處理；酚/ /氯仿抽提。氯仿抽提。 去除去除RNA:RNA: RNase RNase 處理。處理。核酸沉淀：核酸沉淀：乙醇沉淀；異丙醇沉淀。乙醇沉淀；異丙醇沉淀。溶解：溶解：1XTE 1XTE 溶解溶解定性分析：定性分析：電泳分析，根據標

3、準分子量標準確定電泳分析，根據標準分子量標準確定大小、純度（有無大小、純度（有無RNARNA）定量分析：定量分析：電泳，以標準含量的電泳，以標準含量的DNADNA確定濃度；確定濃度；紫外測定紫外測定OD260OD260。質量：質量：OD280/OD260.OD280/OD260.DNADNA提取操作實例：提取操作實例：質粒DNA的提取 堿裂解法堿裂解法溶液溶液1GET緩沖液：緩沖液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA，20mmol/L 20mMTris-HCl pH8.0， 100 g/ml RNas A 4oC 保存。保存。溶液溶液20.2mol/L NaOH,

4、1%SDS溶液溶液3乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE緩沖液緩沖液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇1.1.質粒擴增質粒擴增.從從AmpAmp抗性培養的培養平板上挑取生長狀態好的單菌落，置于抗性培養的培養平板上挑取生長狀態好的單菌落，置于4ml4ml的的100ug/ml100ug/ml的的AmpLBAmpLB液體培養基中，液體培養基中，3737，120rpm120rpm空氣搖床培養空氣搖床培養4

5、-54-5小時，小時，待培養物約為對數生長期，用于擴大培養。待培養物約為對數生長期，用于擴大培養。1.21.2取取500ml500ml離心瓶，含有離心瓶，含有200ml200ml的的LBLB培養基（培養基（LBLB培養基配置見試劑配制），培養基配置見試劑配制），將過夜培養物，以備質粒提取。將過夜培養物，以備質粒提取。2.2.質粒提取質粒提取.取取250ml250ml離心瓶，將過夜培養物（離心瓶，將過夜培養物（200ml200ml菌液）倒于離心瓶中，菌液）倒于離心瓶中，4000rpm4000rpm，44，離心，離心1515分鐘。分鐘。.上清液小心轉入廢液杯中，沉淀為菌

6、體。將沉淀打散，加入上清液小心轉入廢液杯中，沉淀為菌體。將沉淀打散，加入4ml4ml質粒質粒提取液提取液I I，室溫放置，室溫放置5 5分鐘。分鐘。.將所有液體倒入將所有液體倒入50ml50ml離心管中（以下操作都在離心管中（以下操作都在50ml50ml離心管中進行），離心管中進行），加入質粒提取液加入質粒提取液II 8mlII 8ml，混合后于室溫放置，混合后于室溫放置5 5分鐘。加質粒提取液分鐘。加質粒提取液III6mlIII6ml，混勻，可見白色沉淀，冰上放置混勻，可見白色沉淀，冰上放置1515分鐘。分鐘。2.4. 10000rpm2.4. 10000rpm，44，離心，離

7、心1515分鐘，取液相。加入等體積的異丙醇混合，分鐘，取液相。加入等體積的異丙醇混合，2020放置放置1515分鐘。分鐘。2.5.10000rpm2.5.10000rpm離心離心,4,4，1515分鐘分鐘, ,去上清，沉淀用去上清，沉淀用5ml 15ml 1TETE溶解后，加溶解后，加5ml 5M 5ml 5M LiClLiCl混勻，混勻，10000rpm10000rpm，44離心離心2020分鐘。分鐘。.取上清，加入等體積異丙醇沉淀，取上清，加入等體積異丙醇沉淀，10000rpm10000rpm離心離心1515分鐘。沉淀加入分鐘。沉淀加入500l 500l 1 1TETE溶液。

8、將所得溶液吸入溶液。將所得溶液吸入1.5ml1.5ml離心管中。再加入離心管中。再加入3lRNA3lRNA酶，酶，3737放置放置2 2小小時（以下操作均在時（以下操作均在1.5ml1.5ml離心管中進行）。離心管中進行）。.加入等體積聚乙二醇溶液。加入等體積聚乙二醇溶液。12000 rpm12000 rpm離心離心1010分鐘，收集沉淀。沉淀用分鐘，收集沉淀。沉淀用400l 1400l 1TETE溶解。溶解。.加入加入400l400l飽和酚，混勻，飽和酚，混勻，12000 rpm12000 rpm，離心，離心3 3分鐘，取上清至新的分鐘，取上清至新的1.5ml1.

9、5ml離心管內。離心管內。加入加入200l200l飽和酚飽和酚200l200l氯仿，混勻，氯仿，混勻，12000 rpm12000 rpm，離心，離心3 3分鐘，取上清至新分鐘，取上清至新的的1.5ml1.5ml離心管內。加入離心管內。加入400l400l氯仿，混勻，氯仿，混勻，12000 rpm12000 rpm，離心，離心3 3分鐘。取水相分鐘。取水相至新的至新的1.5ml1.5ml離心管內。離心管內。.加入加入35ul 3mol/L,35ul 3mol/L,然后加然后加NaAC,700lNaAC,700l乙醇沉淀混勻，室溫放置乙醇沉淀混勻，室溫放置1010分鐘后，分鐘后，于

10、于44，12000 rpm12000 rpm，離心，離心5 5分鐘，取沉淀。分鐘，取沉淀。0.加入加入200l 80%200l 80%乙醇洗鹽。置于乙醇洗鹽。置于3737烘干。烘干。1.用用100l100lTETE溶解沉淀。溶解沉淀。3.3.檢測檢測3.13.1電泳檢測電泳檢測.1.1.配制配制0.80.8的瓊脂糖凝膠。稱取瓊脂糖的瓊脂糖凝膠。稱取瓊脂糖0.24g,0.24g,置于置于100ml100ml的三角瓶中，加的三角瓶中，加電泳緩沖液電泳緩沖液30ml, 30ml, 放于水平的桌子上，在三角瓶的水位線處作以標記。放于水平的桌子上，在三角瓶的

11、水位線處作以標記。.1.2.用牛皮紙包瓶口，于微波爐中加熱至瓊脂融化，取出，放于水平的桌子用牛皮紙包瓶口，于微波爐中加熱至瓊脂融化，取出，放于水平的桌子上，用蒸餾水補充到三角瓶的標記處。冷至上，用蒸餾水補充到三角瓶的標記處。冷至6060時，加溴化乙錠時，加溴化乙錠0.005%0.005%。.1.3.在煮凝膠的同時，準備干凈的可盛膠在煮凝膠的同時，準備干凈的可盛膠30ml30ml的鑄膠托盤一個，用透明膠帶的鑄膠托盤一個，用透明膠帶封兩邊的口。至于水平桌面上，放上封兩邊的口。至于水平桌面上，放上1mm1mm厚，厚，5mm5mm寬的梳子。寬的梳子。.1.4.

12、將凝膠倒入托盤中，自然冷卻。將凝膠倒入托盤中，自然冷卻。.1.5.上樣上樣1ul1ul，15cm/100V15cm/100V電泳電泳1 1小時。小時。3.1.6. 3.1.6. 觀察觀察RNARNA和核和核DNADNA是否除凈。（是否除凈。（RNARNA片段較小，跑在最前面；核片段較小，跑在最前面；核DNADNA片段很片段很大，位于膠孔跑不出來）。如果核大，位于膠孔跑不出來）。如果核DNADNA的亮度強于質粒條帶，質粒提取不合格，的亮度強于質粒條帶，質粒提取不合格，重新抽提。重新抽提。3.23.2ODOD值的測定值的測定.2.1.取石英比色杯一支，加取石英比色杯一支

13、，加3ml3ml蒸餾水，加入蒸餾水，加入DNADNA溶液溶液10ul10ul用紫外分光光度計用紫外分光光度計測測ODOD260260和和O.DO.D280280。.2計算公式計算公式: DNA: DNA含量（含量（ug/ulug/ul）=50XO.D=50XO.D260260X3/10X3/10培養細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種培養細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種到液體培養基，到液體培養基，37培養培養1216小時小時;取液體培養液取液體培養液1.5-3ml于于Eppendorf管中管中，10000r/min離心離心1min，去掉上清液，去掉上清液，加入加入100 l溶液溶液1

14、，充分混勻，充分混勻;加入加入200 l新配制的新配制的0.2mol/L NaOH(內內含含1SDS)，加蓋顛倒，加蓋顛倒6-7次使之混勻，次使之混勻，冰上放置冰上放置5min;質粒小量提取的方法：質粒小量提取的方法：加入加入150 l乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(pH4.8)，加蓋后顛倒，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置次混勻，冰上放置515min;用臺式高速離心機，用臺式高速離心機，10000r/min離心離心7min，上，上清移入另一干凈離心管，并加清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混勻，勻，12000r/min離心離心5min，棄去上清液，棄去上清液;沉淀用沉淀用70乙醇清洗一

15、次，小管倒置于吸水紙乙醇清洗一次，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥上，除盡乙醇，室溫自然干燥;加入加入30-50 l滅菌蒸餾水或滅菌蒸餾水或TE 緩沖液溶解提取物緩沖液溶解提取物，室溫放置，室溫放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有時需有時需要酚要酚:氯仿抽提氯仿抽提);將分離出的質粒將分離出的質粒DNA置于置于-20保存備用。保存備用。WizardTM Plus Minipreps DNAPurification System (Promega)This purification system is silica membrane-based and modifie

16、d alkaline lysis procedure based system, which specifically absorbs DNA in the presence of high concentration of some salt. Proteins and other impurities are not absorbed and will be removed. DNA can be eluted under low-salt condition or water. The yield of plasmid DNA will vary depending on a numbe

17、r of factors. Cell Resuspension Solution 50mM Tris-HCl (pH 7.5) 10mM EDT 100g/ml RNase A Cell Lysis Solution 0.2M NaOH 1% SDS Neutralization Solution 1.32M potassium acetate (pH 4.8) Column Wash Solution 80mM potassium acetate 8.3mM Tris-HCl (pH 7.5) 40M EDTA 55% ethanol TE buffer (1X) 10mM Tris-HCl

18、 (pH 7.5) 1mM EDTA注意：注意： 用移液器（俗稱用移液器（俗稱“槍槍”）操作時，）操作時，每一步都要格外小心，以免切碎每一步都要格外小心，以免切碎DNA(DNA(包括質粒包括質粒DNADNA和基因組和基因組DNA);DNA); 加入溶液加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要后，一定不要劇烈振蕩，避免導致基因組劇烈振蕩，避免導致基因組DNADNA的的斷裂而污染質粒斷裂而污染質粒DNADNA！Pellet 13ml of cells by centrifugation for 12 minutes at 10,000 g in a microcentrifuge. Pou

19、r off the supernatant and blot the tube upside-down on a paper towel to remove excess media.Completely resuspend the cell pellet in 200l of Cell Resuspension Solution (Solution I）. Add 200l of Cell Lysis Solution (Solution II) and mix by inverting the tube 4 times. The cell suspension should clear i

20、mmediately.Add 200l of Neutralization Solution (Solution III)and mix by inverting the tube 4 times.Centrifuge the lysate at 10,000 g in a microcentrifuge for 10minutes. Pipet 1ml of the resuspended resin into each barrel of the Minicolumn/syringe assembly. (If crystals or aggregates are present, dis

21、solve by warming the resin to 2537C for 10 minutes. Cool to 30C before use.)Carefully remove all of the cleared lysate from each miniprep and transfer it to the barrel of the Minicolumn/syringe assembly containing the resin. No mixing is required.Carefully insert the syringe plunger and gently push

22、the slurry into the minicolumn.Detach the syringe from the Minicolumn and remove the plunger from the syringe barrel. Reattach the syringe barrel to the Minicolumn.Pipet 2ml of Column Wash Solution (after the addition of ethanol) into the barrel of the Minicolumn/syringe assembly. Insert the plunger

23、 into the syringe and gently push the Column Wash Solution through the Minicolumn.Remove the syringe and transfer the Minicolumn to a 1.5ml microcentrifuge tube. Centrifuge the Minicolumn at 10,000 g in a microcentrifuge for 2 minutes to dry the resin.Transfer the Minicolumn to a new 1.5ml microcent

24、rifuge tube. Add 50l of nuclease-free water to the Minicolumn and wait 1 minute. Centrifuge at 10,000 g in a microcentrifuge for 20 seconds to elute the DNA. The DNA will remain intact on the Minicolumn for up to 30 minutes; however, prompt elution will minimize nicking of plasmids in the range of 2

25、0kb.Remove and discard the Minicolumn. Follow these storage recommendations: DNA is stable in water without addition of a buffer if stored at 20C or below. DNA is stable at 4C in TE buffer. To store the DNA in TE buffer, add 5l of 10X TE buffer to the 50l of eluted DNA.B. 用分光光度計法定量用分光光度計法定量DNA 取取2 l

26、提取的質粒提取的質粒DNA，加入，加入98 l蒸蒸餾水對待測餾水對待測DNA樣品做樣品做1:50(或更高或更高倍數的稀釋倍數的稀釋); 蒸餾水作為空白蒸餾水作為空白,在波長在波長260nm、280nm處調節紫外分光光度計讀數處調節紫外分光光度計讀數至零。至零。加入加入DNA稀釋液，測定稀釋液，測定260nm 及及280nm的吸收值。的吸收值。260nm 讀數用于計讀數用于計算樣品中核酸的濃度，算樣品中核酸的濃度，OD260值為值為1相相當于約當于約50 g /ml雙鏈雙鏈DNA，33 g /ml單單鏈。可根據在鏈?？筛鶕?60nm以及在以及在280nm的讀的讀數的比值（數的比值（OD260/

27、OD280）估計核酸的）估計核酸的純度。一般純度。一般DNA的純品，其比值為的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質或其它雜質的低于此值說明有蛋白質或其它雜質的污染。污染。記錄記錄OD值，通過計算確定值，通過計算確定DNA濃濃度或純度，公式如下度或純度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數稀釋倍數以上濃度單位為以上濃度單位為 g /ml植物總植物總DNADNA提取提取1.植物總植物總DNA提取原理及方法概述提取原理及方法概述（1）CTAB法法原理：原理：CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，污劑，可

28、溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，當降）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（低溶液鹽濃度到一定程度（ 0.3mol/L NaCl ）時，）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開。然后將合物同蛋白質、多糖類物質分開。然后將CTAB與與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，使核酸沉淀， CTAB能溶于乙醇。能溶于乙醇。方法：方法：1.1.取取1-501-50克新鮮植物材料，于液氮中研磨成粉?？诵迈r

29、植物材料，于液氮中研磨成粉。2.2.將凍粉轉入預冷的離心管中，立即加入等體將凍粉轉入預冷的離心管中，立即加入等體積（積（w/vw/v）65 65 預熱的預熱的2 x CTAB2 x CTAB提取緩沖液，提取緩沖液，充分混勻，充分混勻， 65 65 保溫保溫10-2010-20分鐘，其間不時分鐘，其間不時搖動。搖動。3.3.加入等體積的氯仿加入等體積的氯仿/ /異戊醇，輕緩顛倒離心異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，室溫下管混勻，室溫下12000rpm12000rpm離心離心10-2010-20分鐘。分鐘。4.4.將上清轉入另一離心管中，假如將上清轉入另一離心管中，假如1/101/10體積的體積的10%

30、10%CTABCTAB，混勻，加入等體積的氯仿，混勻，加入等體積的氯仿/ /異戊醇，顛倒離異戊醇，顛倒離心管混勻，室溫下心管混勻，室溫下12000rpm12000rpm離心離心10-2010-20分鐘。分鐘。5.5.取上相，重復取上相，重復4 4操作一次。操作一次。6.6.將上相轉入新的離心管，加入將上相轉入新的離心管，加入1-1.51-1.5倍體積的倍體積的1x 1x CTABCTAB沉淀緩沖液，混勻，室溫下放置沉淀緩沖液，混勻，室溫下放置3030分鐘，沉分鐘，沉淀。淀。 7.3500-4000rpm7.3500-4000rpm離心離心5-105-10分鐘，去上清分鐘，去上清 ，沉淀吹，沉淀

31、吹干。干。8.8.按按0.5ml/g0.5ml/g材料的比例加入材料的比例加入1mol/L1mol/L乙酸銨溶液，乙酸銨溶液，使沉淀溶解完全，再加入使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L7.5mol/L乙酸銨至終乙酸銨至終濃度為濃度為2.5mol/L.2.5mol/L.9.9.加入加入2 2倍體積的異戊醇，混勻，室溫下放置倍體積的異戊醇，混勻，室溫下放置1010分鐘。分鐘。10. 10000rpm10. 10000rpm離心離心5 5分鐘，去上清。分鐘，去上清。11.11.用用70%70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于適量乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于適量TETE。優點：優點： 能很好的去除糖類雜

32、質，對于含糖較高的材能很好的去除糖類雜質，對于含糖較高的材料可優先采用。料可優先采用。（2）SDS法法原理：原理： 利用高濃度的利用高濃度的SDSSDS，在較高溫度（，在較高溫度（55-65 55-65 ）條）條件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質及多糖雜質沉淀（最常用的是加入質及多糖雜質沉淀（最常用的是加入5mol/L 5mol/L 的的KACKAC于于冰上保溫，低溫條件下冰上保溫，低溫條件下KAC KAC 與蛋白質及多糖結合成不與蛋白質及多糖

33、結合成不溶物），離心除去沉淀后，上清中的溶物），離心除去沉淀后，上清中的DNADNA反復用酚反復用酚/ /氯氯仿抽提，用乙醇沉淀水相中的仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNADNA。（3）植物總）植物總DNA提取時常遇到的問題提取時常遇到的問題1.1.植物材料中含有較多的多酚類物質，使植物材料中含有較多的多酚類物質，使DNADNA呈褐色。呈褐色。解決辦法：解決辦法：提高提高CTABCTAB提取緩沖液中巰基乙醇的含量提取緩沖液中巰基乙醇的含量或在或在SDSSDS提取液中加入提取液中加入6%6%的的PVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）。（聚乙烯吡咯烷酮）。2.2.植物細胞壁難以破碎。植物細胞壁難以破碎。解決辦

34、法：解決辦法：在在SDSSDS提取液中加入蛋白酶提取液中加入蛋白酶K K，在液氮冷，在液氮冷凍條件下研磨。凍條件下研磨。植物植物DNADNA樣品純度及濃度的鑒定樣品純度及濃度的鑒定 用于用于SouthernSouthern雜交的植物雜交的植物DNADNA樣品樣品在純度、長度及濃度上均有較高的要求。在純度、長度及濃度上均有較高的要求。純度上應無蛋白質、純度上應無蛋白質、RNARNA、多糖及抑制限、多糖及抑制限制性內切酶活性的物質；在長度上不應低制性內切酶活性的物質；在長度上不應低于于50kb50kb；濃度應在；濃度應在0.5-1 g/ l0.5-1 g/ l之間。之間。目前主要采用瓊脂糖凝膠電泳

35、及紫外分光目前主要采用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法進行檢測。光度法進行檢測。（1 1）瓊脂糖凝膠電泳）瓊脂糖凝膠電泳 1.1.所提植物所提植物DNADNA應呈現出一條分子量較大的清應呈現出一條分子量較大的清晰條帶。如樣品呈彌散狀，說明晰條帶。如樣品呈彌散狀，說明DNADNA已嚴重降解，已嚴重降解，可能原因是：所用的器皿及試劑是否滅菌；材可能原因是：所用的器皿及試劑是否滅菌；材料收集后是否立即冷凍，研碎過程中或研碎后料收集后是否立即冷凍，研碎過程中或研碎后進入提取液前是否融化；是否有劇烈振動、吸進入提取液前是否融化；是否有劇烈振動、吸管口過窄、產生起泡、反復吹打等操作。管口過窄、產生起泡、反復

36、吹打等操作。 2.2.如在溴酚蘭處出現明亮的熒光區，說明如在溴酚蘭處出現明亮的熒光區，說明RNARNA過多，可用過多，可用RNARNA酶消化。酶消化。 3.3.如在樣品槽內有熒光出現，說明如在樣品槽內有熒光出現，說明DNADNA未完全未完全溶解或濃度過高，或樣品不純。溶解或濃度過高，或樣品不純。4.4.估算樣品的濃度。估算樣品的濃度。（）紫外分光光度法測定（）紫外分光光度法測定1.1.純度：純度： 純凈的純凈的DNADNA溶液其溶液其ODOD260260ODOD280280應為應為1.81.8， ODOD260260ODOD230230應大于應大于2.02.0。 如果如果ODOD260260O

37、DOD280280大于大于1.81.8，表明應中含有較多的，表明應中含有較多的RNARNA；如果；如果ODOD260260ODOD280280小于小于1.61.6，則說明樣品中蛋白質較多；，則說明樣品中蛋白質較多； ODOD260260ODOD230230小于小于2.02.0時，表明溶液中有殘存的小時，表明溶液中有殘存的小分子及鹽類雜質，可增加分子及鹽類雜質，可增加70%70%乙醇洗滌沉淀的次乙醇洗滌沉淀的次數。數。2.2.濃度：濃度：DNADNA樣品濃度（樣品濃度（ g/ l g/ l ）= OD= OD260260稀釋倍數稀釋倍數0.050.05制品說明制品說明本試劑盒用于從血液中提取本試

38、劑盒用于從血液中提取DNADNA。通常這種操作非常復雜。通常這種操作非常復雜, , 而使而使用本試劑盒既可以在短時間內完成用本試劑盒既可以在短時間內完成 (40(40分鐘分鐘) ) 全部操作全部操作, , 又可又可以獲得高純度的以獲得高純度的DNADNA。該。該DNADNA可用于包括可用于包括TaKaRa LA PCRTaKaRa LA PCR技術在內技術在內的的PCRPCR反應和限制酶酶切等實驗。本試劑盒既適用于剛采尚未凝反應和限制酶酶切等實驗。本試劑盒既適用于剛采尚未凝固的全血固的全血, ,又適用于經各種抗凝劑又適用于經各種抗凝劑 ( (檸檬酸、檸檬酸、EDTAEDTA、肝素、肝素) )

39、處理處理過的全血。過的全血。原理原理本試劑盒由本試劑盒由GenTLE Solution IGenTLE Solution I、IIII、III III 三部分組成，其中三部分組成，其中GenTLE Solution I GenTLE Solution I 的作用是在破壞血細胞的同時，與核酸形的作用是在破壞血細胞的同時，與核酸形成電中性的復合體，將該復合體離心收集并用成電中性的復合體，將該復合體離心收集并用GenTLE Solution GenTLE Solution II II 清洗后，在沉淀中加入清洗后，在沉淀中加入GenTLE Solution IIIGenTLE Solution III

40、，將，將DNADNA分離出分離出來，再加入異丙醇將來，再加入異丙醇將DNADNA沉淀回收。由于沉淀回收。由于GenTLE Solution I GenTLE Solution I 具具有破壞菌體和病毒粒子的作用，這對于處理那些有可能發生病有破壞菌體和病毒粒子的作用，這對于處理那些有可能發生病原菌等污染的樣品非常有利，而且原菌等污染的樣品非常有利，而且GenTLE Solution I GenTLE Solution I 與核酸與核酸生成的復合體牢固、穩定，便于樣品的運輸以及大量樣品的處生成的復合體牢固、穩定，便于樣品的運輸以及大量樣品的處理。理。（寶）大連生物工程公司的（寶）大連生物工程公司的

41、DNADNA提取產品提取產品LaneM:-EcoT14 I digest Marker (250 ng)1:檸檬酸處理血提取DNA2:EDTA處理血提取DNA3:肝素處理血提取DNABio-Rad Bio-Rad 公司的一個提取產品公司的一個提取產品 DNADNA提取試劑盒提取試劑盒（二）（二）RNARNA的提取的提取 RNA RNA的提取過程基本與的提取過程基本與DNADNA的提取過程相似，同的提取過程相似，同樣有破細胞，除蛋白，沉淀回收樣有破細胞，除蛋白，沉淀回收RNARNA樣品等過程，其樣品等過程，其基本原理也基本一致。所不同的是：由于基本原理也基本一致。所不同的是：由于RNaseRNa

42、se很穩很穩定，所以在定，所以在RNARNA提取中特別注意的是防止提取中特別注意的是防止RNaseRNase的污的污染，導致染，導致RNARNA別降解。通常用別降解。通常用1%1%的的DEPCDEPC（二乙基焦炭（二乙基焦炭酸）溶液處理用具。但這樣也不能保證徹底滅活酸）溶液處理用具。但這樣也不能保證徹底滅活RNaseRNase，所以最好的辦法是所有離心管，吸頭等用品，所以最好的辦法是所有離心管，吸頭等用品都一次性使用，操作時要戴上手套避免操作者將都一次性使用，操作時要戴上手套避免操作者將RNaseRNase帶入樣品中去。帶入樣品中去。 RNA RNA提取方法很多，但基本上是采用提取方法很多，但

43、基本上是采用酸性鹽酸胍酸性鹽酸胍酚酚/ /氯仿一步法的基礎上氯仿一步法的基礎上進行改進的。該方法的原理是：進行改進的。該方法的原理是： 1.1.用胍鹽、用胍鹽、SDSSDS裂解細胞，滅活裂解細胞，滅活RNaseRNase和核蛋白，用酚和核蛋白，用酚/ /氯仿除蛋白；氯仿除蛋白； 2.2.由于在酸性條件下，由于在酸性條件下，DNADNA不溶于水相，不溶于水相，RNARNA不溶于有機相，這樣可以將不溶于有機相，這樣可以將RNARNA和和DNADNA分開；分開； 3.3.然后用乙醇或異丙醇沉淀然后用乙醇或異丙醇沉淀RNARNA樣品。樣品。 細胞中的細胞中的RNARNA主要有主要有rRNArRNA、t

44、RNAtRNA和和mRNA.mRNA.一般將細胞分離的各種一般將細胞分離的各種RNARNA的總和的總和叫總叫總RNA,RNA,某些需要，要純化某些需要，要純化mRNA,mRNA,但多數但多數情況下，只要獲得總情況下，只要獲得總RNARNA就足夠了。就足夠了。 RNARNA用電泳檢測是否完整，用紫外方用電泳檢測是否完整，用紫外方法定量，用法定量，用ODOD260260/OD/OD280280確定其純度，一般確定其純度，一般要求要求OD260/OD280 2.0。RNARNA提取的一般操作程序：提取的一般操作程序： RNARNA提取試劑：提取試劑： 1.1.鹽酸胍鹽酸胍 8Mol/L8Mol/L

45、2.SDS 10% 2.SDS 10% 3. 3.巰基乙醇巰基乙醇 4.NaAC 2Mol/L pH 4.04.NaAC 2Mol/L pH 4.0 1. 1.取取1g1g動物組織于電動組織勻漿器中，加入動物組織于電動組織勻漿器中，加入8ml8ml試劑試劑1 1，80ul80ul試劑試劑2 2，40ul40ul試劑試劑3 3； 2.2.開動電動組織勻漿器，均漿約開動電動組織勻漿器，均漿約2-32-3分鐘，使組分鐘，使組織充分磨碎；織充分磨碎； 3.3.將勻漿液轉入一干凈的將勻漿液轉入一干凈的50ml50ml離心管中，加入離心管中，加入2ml2ml試劑試劑4 4，搖蕩混勻；，搖蕩混勻； 4.4.

46、加入加入8ml8ml水飽和的重蒸酚水飽和的重蒸酚,2ml,2ml含有五十分之一含有五十分之一異戊醇的氯仿，蓋上離心管蓋子，劇烈震蕩異戊醇的氯仿，蓋上離心管蓋子，劇烈震蕩1010分鐘。分鐘。 操作程序：操作程序： 5. 4 5. 4，12000Xg12000Xg離心離心1515分鐘，將上清液分鐘，將上清液（含有（含有RNA)RNA)轉入另一干凈離心管中，注意不要轉入另一干凈離心管中，注意不要將兩相間的沉淀攪混；將兩相間的沉淀攪混； 6. 6.向含有上清液的離心管中加入等體積的向含有上清液的離心管中加入等體積的冷異丙醇，蓋上蓋子，冷異丙醇，蓋上蓋子， 4 4，12000Xg12000Xg離心離心1

47、515分鐘；分鐘； 7. 7.去除上清，向沉淀中加入去除上清，向沉淀中加入2-3ml 75%2-3ml 75%冷冷乙醇，洗滌沉淀，離心后（同步驟乙醇，洗滌沉淀，離心后（同步驟5 5）去上清，）去上清，沉淀再用沉淀再用75%75%冷乙醇，洗滌沉淀，離心后（同冷乙醇，洗滌沉淀，離心后（同步驟步驟5 5）去上清；）去上清； 8. 8.向沉淀中加入向沉淀中加入500ul 500ul 無無RNase RNase 的純水，的純水，溶解沉淀，并轉入一干凈的溶解沉淀，并轉入一干凈的eppendorf eppendorf 離心管離心管中，中，-20-20長期保存。長期保存。用用Qiagen RNeasyQiag

48、en RNeasy提取試劑盒提取植物總提取試劑盒提取植物總RNARNA實驗步驟實驗步驟 （每一步均要求無（每一步均要求無RNaseRNase污染）污染） 稱取新鮮材料稱取新鮮材料100 mg100 mg，液氮速凍；，液氮速凍； 在預冷的研缽中并在液氮中將材料在預冷的研缽中并在液氮中將材料 研磨成細粉末，轉移到研磨成細粉末，轉移到2ml2ml或或1.5ml1.5ml 離心管中；離心管中； 待液氮揮發（但不能解凍）后，加入待液氮揮發（但不能解凍）后，加入 450 l450 l提取緩沖液提取緩沖液RLTRLT，混勻后在，混勻后在 5656下溫育下溫育1 13min3min； 將裂解液加到離心柱（淡紫

49、色）上將裂解液加到離心柱（淡紫色）上 下接一個下接一個2ml收集管，最大轉速離心收集管，最大轉速離心 2min。裂解液通過柱子時被均質化。裂解液通過柱子時被均質化 小心吸取上清液，轉移到另一新離小心吸取上清液，轉移到另一新離 心管；心管； 加入加入0.5倍體積（倍體積（225 l）96100% 乙醇，混合均勻。加入乙醇后，可能乙醇，混合均勻。加入乙醇后，可能 會出現沉淀，無影響；會出現沉淀，無影響； 將混合液全部（包括沉淀將混合液全部（包括沉淀675 l675 l） 轉移到吸附離心柱（粉紅色）內，轉移到吸附離心柱（粉紅色）內， 下接下接2 ml2 ml的收集管，的收集管，10000 rpm10

50、000 rpm離心離心 1515秒。棄去管內液體；秒。棄去管內液體； 加入加入700l RW1700l RW1緩沖液，緩沖液，10000rpm10000rpm轉速下離心轉速下離心2525秒，棄去收集管；秒，棄去收集管； 將離心柱轉移到一個新的將離心柱轉移到一個新的2ml2ml收集收集 管上，加入管上，加入500l RPE500l RPE緩沖液，緩沖液， 10000 rpm10000 rpm離心離心1515秒，棄去管內液體秒，棄去管內液體 重復使用收集管；重復使用收集管； 加入加入500l RPE到離心柱內，最大轉速到離心柱內，最大轉速離心離心2min，干燥離心柱，棄去收集管；，干燥離心柱，棄去

51、收集管； 把離心柱接在一個新的把離心柱接在一個新的1.5 ml Eppen管上，加入管上，加入3050l 無無RNase水水（0.1%DEPC處理），處理），10000 rpm離心離心 1min，洗出，洗出RNA。若。若RNA產量在產量在20g以上，用以上，用3050 l無無RNase水再洗脫水再洗脫1次。次。RNA樣品保存于樣品保存于-20備用。備用。 凝膠制備（凝膠制備（1.21.2）：用）：用11凝膠緩沖液配凝膠緩沖液配制制1.21.2的凝膠，至少使其凝固的凝膠，至少使其凝固3030分鐘后分鐘后進行上樣；進行上樣； 樣品制備：在離心管中，將樣品制備：在離心管中，將RNARNA樣品與樣品與

52、1010上樣緩沖液以上樣緩沖液以9:19:1比例混勻，迅速在比例混勻，迅速在冰上冷浴冰上冷浴5 5分鐘，瞬時離心數秒。分鐘，瞬時離心數秒。RNARNA上樣上樣量為量為2-302-30 g g，本次實驗為，本次實驗為1010 g g； 上樣前凝膠須預電泳上樣前凝膠須預電泳5min5min，隨后將樣品加，隨后將樣品加入加樣孔，以入加樣孔，以5V/cm5V/cm的電壓電泳的電壓電泳1h1h1.5h1.5h；電泳檢測電泳檢測RNARNA： 4. 4.待溴酚藍遷移至凝待溴酚藍遷移至凝膠長度的膠長度的4/54/5處結束電處結束電泳。將凝膠置于溴化泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液中染色約乙錠溶液中染色約30min

53、30min； 5.5.在紫外燈下觀察結在紫外燈下觀察結果。果。上樣孔28S rRNA23s葉綠體rRNA18s rRNA16s 葉綠體rRNAmRNA isolation Only about 3% of total RNA is specific message (mRNA). Most is 28S and 18S eg in 5mg of tissue about 10ug of RNA is present of which 0.3 ug is mRNA, a rare message accounts for 10fg-10pg in total, and a moderately

54、abundant message 300pg How can we isolate such small amounts of message?mRNA isolation We utilise the feature of mRNA, ie the poly A tail Using a column containing a synthetic oligonucleotide oligo(dT) attached hybridise the mRNA to the oligo(dT) and wash away the remainder Elute the mRNA by hot buf

55、fer Usually we do two rounds of purification二、電泳技術二、電泳技術 electrophoresiselectrophoresis Definition Electro = Charge + Phorsesis= Carry Electrophoresis = Separation of charged molecules by differences in their rate of migration in an electric field.The Components of The System Molecules to be separat

56、ed Proteins Nucleic Acids Support medium Gel (Starch, Polyacrylamide or Agarose) Buffer System High Buffer Capacity DC Power Source 50 1000 VCommon Support Media for Biological Molecules ProteinsNative Gel (Acrylamide or Starch)Denaturing (SDS) Gel (Acrylamide) Nucleic Acids DNA & RNAAgarose Gel

57、Acrylamide GelDNA/Agarose Gel ElectrophoresisHorizontal submarine electrophoresis most common; simplest separation by sizeAgarose concentration 0.3-3%Buffer most often Tris-Borate-EDTA (TBE) at 1X or 0.5X; sometimes Tris-Acetate-EDTA (TAE) at 1XTris is the stronger bufferDetection of DNA is generall

58、y by ethidium bromide intercalation (dye in gel, in buffer, in sample, or in immersion solution after run)AgaroseGood separation of all but smallest DNAs- mid-range to large pore size provides sieving effect; relatively inertLinear polysaccharide derived from seaweed extract; composed of repeating u

59、nits of agarobioseWhen dissolved by heat in aqueous solution, then cooled, agarose solution gels due to formation of inter- and intra-chain H bonds= The higher the concentration, the smaller the pore size 橋式水平電泳槽用于對用于對DNA、蛋白的鑒定、分離、制備及、蛋白的鑒定、分離、制備及分子量測定分子量測定 Preparing and running an agarose gelSuspen

60、d agarose in running buffer (NOT H2O) to desired concentrationHeat to boiling; once dissolved, cool to 65oC; add EtBr if desired to 1 g/ml; pour into gel tray with comb to form wells; let set completelyPrepare DNA samples- add loading dye to 1X (provides high density to allow sample to sink, and provide