1、第六章目的基因的分離 基因工程的上游工程是目的基因的基因工程的上游工程是目的基因的制取和無性繁殖。制取和無性繁殖。 具體地說是從生物體的組織、具體地說是從生物體的組織、 器官器官或細胞制取目的基因，或人工合成目的或細胞制取目的基因，或人工合成目的基因，使目的基因與載體連接，導入受基因，使目的基因與載體連接，導入受體細胞，篩選和進行無性繁殖。這個過體細胞，篩選和進行無性繁殖。這個過程稱為基因克隆（程稱為基因克隆（gene cloninggene cloning）。）。克隆的概念:個體水平上個體水平上: 表示由具有相同基因型的同一物種的兩個體或數個個體組成的群體,如雙胞胎.細胞水平上細胞水平上:由

2、同一個祖細胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體.分子水平上分子水平上:凡帶有一段DNA插入序列的,獨特的寄主/載體單元亦叫克隆.比如重組質粒載體 PCR或人工合成法 從基因組文庫或cDNA文庫中分離基因 差減雜交法、扣除雜交、差異顯示法 基因文庫：指某個生物的基因組 DNA 或 cDNA 片段與適當的載體在體外通過重組后，轉化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合 按照外源 DNA 片段的來源，可將基因文庫分為：基因組 DNA 文庫（genomic DNA library）和 cDNA 文庫（complementary DNA librar

3、y）。 從基因文庫中克隆目的基因從基因文庫中克隆目的基因(一) 概念： 將生物特定的組織器官或特定發育時期的全部mRNA反轉錄成 cDNA群體，并插入到適當的載體分子上，然后轉化給大腸桿菌寄主細胞，這個細胞群體內包含了所有基因編碼序列的cDNA分子，被稱為cDNA文庫。 只包括在特定的組織或細胞類型中已經被轉錄成mRNA的那些基因序列。由于不同的細胞類型、發育階段以及細胞所處的特定的狀態是由特定基因的表達所決定，因此各自的mRNA的種類不同，由此產生出獨特的cDNA文庫。任何一個cDNA文庫都不可能包含某一生物全部編碼基因。 以mRNA為材料,特別適用于某些RNA病毒 篩選比較簡單易行. 假陽

4、性概率低 cDNA克隆可進行原核表達 文庫的代表性:文庫中包含的重組cDNA分子反映來源細胞中表達信息的完整性. N=Ln(1-P)/Ln(1-n/T)P:文庫中篩選出某一確定克隆的置信度,一般情況下選擇0.99.N:文庫中以P概率出現細胞中任何一種mRNA序列理論上應具有的最少重組子克隆數;n:細胞中最低豐度的mRNA的拷貝數;T: 細胞中表達出的所有mRNA的總拷貝數 重組cDNA片段的序列完整性(二)、構建cDNA文庫的方法（1）分離細胞總RNA，從中分離出mRNA。（2）以mRNA為模板，逆轉錄合成第一條cDNA鏈。（3）將mRNA-DNA雜交分子轉變為雙鏈DNA分子。（4）將合成的雙

5、鏈cDNA重組到質粒載體或噬菌體載體上，導入大腸桿菌寄主細胞內增殖。 通常用gt10/gt11及與其相當的載體來組建非表達的cDNA文庫，而一般不用轉化效率較低的質粒作載體。 c cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成 5pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5dNTPs逆轉錄酶5pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈c cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 自身引導法：獲得的雙鏈自身引導法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失端會有幾對堿基缺失5pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTT

6、TTTTTTTTp 5NaOH煮沸煮沸TTTTTTTTTTTTTTp 5OH 3KlenowdNTPsTTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3S1AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTc cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5RNaesHDNApol dNTPs AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55AAAAAAAAAAAAAAp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3S1T4-DNA ligaseAAAA

7、AAAAAAAAAA55TTTTTTTTTTTTTT33cDNA第二鏈的合成引導合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列ppp5G AAAAAOH 3TTTTTp 5TdTdCTPppp5G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 5NaOH退火退火5 pGGGGGGG5 pGGGGGGGAAAAAOH 3KlenowdNTPsTTTTTp 5 雙鏈平頭的雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中克隆入載體中: :平頭末端直接與載體連接平頭末端直接

8、與載體連接,但插入的片段無法回收但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，重組分子可通過加熱局部變性平頭兩端分別接同聚物尾，重組分子可通過加熱局部變性和和S1核酸酶處理回收插入片段核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 核酸雜交 免疫學雜交檢測:通過重組克隆所表達的基因產物篩選目的克隆 如果雙鏈cDNA重組到表達載體上，則cDNA就能隨著表達載體而表達出融合蛋白質，這樣的文庫稱為cDNA表達文庫 PCR 并非所有的并非所有的mRNA分子都具有分子都具有polyA結構結構 細菌或原核生物的細菌或原核生物的mRNA半衰期很短半衰期

9、很短 mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難分離純化困難 僅限于克隆蛋白質編碼基因僅限于克隆蛋白質編碼基因 基因庫（基因庫（gene pool）:特定生物體全基因組的集合特定生物體全基因組的集合（天然存在）（天然存在） 基因組文庫（基因組文庫（gene library or gene bank） 將某種生物細胞的整個基因組將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當的載體連接，引入相應片斷，并將所有這些片斷都與適當的載體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增的宿主細胞中保存和擴增.理論上講，這些重

10、組載體上帶有理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因組文庫。了該生物體的全部基因，稱為基因組文庫。載體容量越大，所要求的載體容量越大，所要求的DNA片斷數目越少，片斷數目越少，所需的重組子越少所需的重組子越少目前常用的載體目前常用的載體 載體系列：載體系列： 容量為容量為 23 kb cosmid載體：載體： 容量為容量為 45kb YAC： 容量為容量為 450-1 Mb BAC: 容量為容量為 300 kb（1 1）文庫的完整性）文庫的完整性: : 在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數克

11、隆數N之間的關系可用下式表示：之間的關系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f = ;f = 克隆片段的平均大克隆片段的平均大小小 / / 生物基因組的大小生物基因組的大小 例如，人的單倍體例如，人的單倍體DNA總長為總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構建一個完備性為，則構建一個完備性為0.9的的基因文庫至少需要基因文庫至少需要45萬個克?。欢斖陚湫蕴岣叩饺f個克隆；而當完

12、備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要時，基因文庫至少需要180萬個克隆萬個克?。? 2） 基因組信息的可重建性基因組信息的可重建性 基因組基因組DNA的分離制備的分離制備 DNA大片段的制備大片段的制備 : 超聲波處理和超聲波處理和限制性內切酶部分酶切兩種方法限制性內切酶部分酶切兩種方法 載體載體DNA的制備的制備：常用噬菌體DNA或粘粒作為載體;雙臂的制備，除去非必要區段。 載體與基因組載體與基因組DNA大片段的連接大片段的連接 體外包裝及基因組文庫的擴增體外包裝及基因組文庫的擴增 重組重組DNA的篩選和鑒定的篩選和鑒定 鳥槍法：用生物化學方法，如用限制性內切酶將基因組DNA進行切割，

13、得到很多在長度上同一般基因大小相當的DNA片段，然后將這些片段混合物隨機重組入適當的載體，轉化后在受體菌中進行擴增，再用適當的方法篩選出目的基因。 噬菌體及其衍生載體構建的DNA文庫的保存:分裝,2%-3%氯仿4度保存數月.填加7%的二甲基亞砜,80度保存數年. 大片段的基因文庫: 含抗凍液和抗生素的96孔或384孔無菌培養板保存 7.5%的甘油可作為抗凍液. 使用使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據該序列化片段兩側的序列，根據該序列化學合成聚合反應必需的雙引物學合成聚合反應必需的雙引物 1 引物設

14、計:決定擴增效果的關鍵 可在5端添加限制性內切酶識別序列及保護堿基. 引物效果檢驗和PCR參數確定 退火溫度影響最大2 常規PCR反應的產物一般在3kb以下,主要是因為隨著擴增片段延長,擴增效率降低. 由由Taq DNA聚合酶擴增的聚合酶擴增的PCR產物中，其產物中，其3末端末端總是總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是總是A，因為因為Taq DNA聚合酶對聚合酶對dATP具有優先聚合活具有優先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末末端加同聚尾的方法與載體端加同聚尾

15、的方法與載體拼接，也可以使用專門的拼接，也可以使用專門的T載載體克隆體克隆 反向PCR 錨定PCR 逆轉錄PCR cDNA末端的快速擴增(RACE) 也是獲得已知DNA序列側翼未知序列的一種PCR方法 設計3個嵌套的特異性引物和一個短的隨機簡并引物,以DNA為模板,根據引物長度及特異性差異設計不對稱的溫度循環,通過分級反應擴增特異產物 一般分三輪反應: 第一次反應包括第一次反應包括5次高特異性、次高特異性、1次低特異、次低特異、10次較低特異性反應和次較低特異性反應和12個熱不對稱的超個熱不對稱的超級循環。級循環。5次高特異性反應，使次高特異性反應，使sp1與已知與已知的序列退火并延伸，增加了

16、目標序列的濃的序列退火并延伸，增加了目標序列的濃度；度；1次低特異性的反應使簡并引物結合到次低特異性的反應使簡并引物結合到較多的目標序列上；較多的目標序列上；10次較低特異性反應次較低特異性反應使使2種引物均與模板退火，隨后進行種引物均與模板退火，隨后進行12次超次超級循環。經上述反應得到了不同濃度的級循環。經上述反應得到了不同濃度的3種種類型產物：類型產物： 由特異性引物和簡并引物擴增出的產物；由特異性引物和簡并引物擴增出的產物；由同一特異性引物擴增出的產物；由同一特異性引物擴增出的產物；由同一簡并引物擴增出的產物。由同一簡并引物擴增出的產物。 第二次反應則將第一級反應的產物稀釋第二次反應則

17、將第一級反應的產物稀釋1000倍作為模板，通過倍作為模板，通過10次熱不對稱的超次熱不對稱的超級循環，使特異性產物被選擇地擴增，而級循環，使特異性產物被選擇地擴增，而非特異產物含量極低。第三次反應又將第非特異產物含量極低。第三次反應又將第二次反應的產物稀釋作模板，再設置普通二次反應的產物稀釋作模板，再設置普通的的PCR反應或熱不對稱超級循環，通過上反應或熱不對稱超級循環，通過上述述3次次PCR反應可獲得與已知序列鄰近的目反應可獲得與已知序列鄰近的目標序列。標序列。 化學合成目的基因的前提條件是基因編化學合成目的基因的前提條件是基因編碼的氨基酸序列或基因的碼的氨基酸序列或基因的DNA序列已知序列

18、已知化學合成化學合成DNA的實質是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上的實質是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環反應，包括：基團保護、分離、縮合、去，每接一個單體就是一個循環反應，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。分離、去保護五大操作單元。 從反應機理上來講，從反應機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種法、亞磷酸三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；

19、后者反應中間物的分離程序簡便，序簡便，DNA合成儀就是根據固相亞磷酸三酯法原理設計的合成儀就是根據固相亞磷酸三酯法原理設計的磷酸二酯法磷酸二酯法 :原理:將兩個分別在將兩個分別在55或或33末端帶有適當保末端帶有適當保護基的脫氧單核苷酸連接起來，形成一個護基的脫氧單核苷酸連接起來，形成一個帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸。為了保帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸。為了保證合成反應定向進行，以獲得特定序列和證合成反應定向進行，以獲得特定序列和形成形成3535磷酸二酯鍵，必須將不參加反磷酸二酯鍵，必須將不參加反應的基團用適當的保護基團選擇性的保護應的基團用適當的保護基團選擇性的保護起來。起來。 原理與磷酸二

20、酯法一樣。只是參加反應的原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸單核苷酸,是一種核苷是一種核苷3-單磷酸的衍生物單磷酸的衍生物,都都是在是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先連接了一個保上都先連接了一個保護基團，合成的二核苷酸連接處有三個酯護基團，合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵鍵 目前DNA自動合成儀采取的方法寡核苷酸連接法寡核苷酸連接法 化學合成的化學合成的DNA片斷一般在片斷一般在200bp以內以內1 互補連接法互補連接法2 互補延伸連接法互補延伸連接法 預先設計的片斷之間有局部互補區，可以相互作為預先設計的片斷之間有局部互補區，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用另一個片斷延長的引物，

21、用DNA聚合酶延伸成完整的聚合酶延伸成完整的雙鏈雙鏈用用T4多核苷酸激酶使各個片段的多核苷酸激酶使各個片段的5端帶上磷酸。端帶上磷酸。T4多核苷酸激酶，使多核苷酸激酶，使5-OH磷酸化磷酸化- T4 DNA連接酶連接酶-完整的完整的DNA雙鏈雙鏈 直接合成基因直接合成基因 合成引物（合成引物（20mer左右）左右） 合成探針序列，合成探針序列， 定點突變合成（定點突變合成（合成帶有定點突變的基因片斷），）， 合成人工接頭或銜接物（合成人工接頭或銜接物（含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列）。 差異顯示PCR 差別雜交 扣除雜交 RNA任意引物PCRmRNA差別

22、顯示技術差別顯示技術mRNA差示反轉錄PCR技術（mRNA differential display reverse transcription PCR ,DDRT-PCR）一種用于分離和克隆真核生物正常與異常細胞之間差異表達基因的PCR方法 。根據表達差異將高等真核生物基因分為兩大類:看家基因(house-keeping gene):以組成型表達模式維持細胞的基本代謝活動.發育調控基因(developmental regulated gene):以時空特異性表達模式完成個體的正常的生長,發育與分化.基因的差別表達:生物個體在發育的不同階段,或在不同組織或細胞中發生的不同基因按時間空間進行有序

23、的表達方式,叫- 真核基因真核基因mRNA分子的分子的3末端絕大多數都帶有一段末端絕大多數都帶有一段Poly(A)尾巴。在這段尾巴。在這段Poly(A)序列起點堿基之前序列起點堿基之前5上游的兩個堿基有上游的兩個堿基有12種組合（種組合（CG，GG，AG，TG，CT，GT，AT，TT，CC，GC，AC，TC）根據這）根據這種序列結構特征，按照堿基配對原則，人工合成種序列結構特征，按照堿基配對原則，人工合成Oligod(T)引物時，在其引物時，在其3端加上兩個堿基端加上兩個堿基（5T12MN，M為為A，G ，C中任一種，中任一種，N為為A，G，C，T中任一種）因此引物可將中任一種）因此引物可將1/12的的mRNA反轉錄反轉錄成成cDNA，并用此引物錨定，并用此引物錨定cDNA第二條鏈的第二條鏈的3端，端，用另一個隨機寡核苷酸引物組成的用另一個隨機寡核苷酸引物組成的5端引物與端引物與cDNA第一條鏈互補進行第一條鏈互補進行PCR擴增，由于擴增，由于5端隨機引物結端隨機引物結合在合在cDNA的互補靶點上，來自不同的互補靶點上，來自不同mRNA的擴增的擴增片段大小有差異，對片段大小有差異，對PCR產物進行電泳，染色或擴產物進行電泳，染色或擴增時用增時用32S標記的標記的dATP代替代替dATP在測序膠