1、5.1 TEM對樣品的基本要求制備 根據樣品的種類、性質和分析要求選用不同的制備方法，有以下三種方法： 支支 持持 膜膜 法法 復復 型型 法法 薄薄 膜膜 法法5.2 TEM樣品的制備方法5.2.1支持膜法支持膜法 懸浮液、粉體等細小試樣懸浮液、粉體等細小試樣需要撈在覆有薄膜的金屬載網上。經干燥后進行觀察。具體操作在銅網上覆蓋支持膜，將經過超聲波分散超聲波分散的顆粒懸浮液滴在支持膜上，靜置干燥，或用紅外燈烘烤干燥。 制作載網的材料大多是銅，因此習慣上將載網稱為銅網，不過制作載網的材料還可以是金、銀、鎳、鋁、鉑及尼龍。載網的大小隨電鏡的需要而不同，一般直徑為3mm。網孔的形狀有圓形、方形、單孔

2、形等，網孔有50、100、200、300及400目等多種規格。常用一般普通組織超薄切片選用200-300目的載網，對于過小的和過碎的樣品，可選用400目的載網；對于不易查找的樣品，可選用帶字母標記的載網。載網類型載網類型 帶字母的載網 400目平行載網 載網的數目再高也是有空隙的，為了防止極微小的樣品在撈片時漏掉；或切片時在電子束的轟擊下卷曲；或為了加強空隙大的載網的支持作用等，需要在載網上覆蓋上一層支持膜。制作支持膜所選的材料要求透透明明、本身在電鏡下無可見的結構本身在電鏡下無可見的結構以及在電子束轟擊下電子束轟擊下有高度的機械穩定性有高度的機械穩定性3個基本的條件。 有多種支持膜，較常用的

3、有孚爾瓦膜、碳膜、火棉膠膜等。孚爾瓦膜一般制成20nm左右，它的支持力較強，但制備較復雜。碳膜只需幾個納米厚，它的特點是分辨力高，化學性能穩定，機械強度也高，常用于加固其它膜?；鹈弈z膜的機械強度較孚爾瓦膜小，但容易制備，所以也較常用。 介紹一下Formvar膜的制法：該膜的化學成分為聚乙烯醇縮甲醛（Polyvinyl formal，簡稱PVF）。 首先制備02.-0.5%的氯仿（或二氯乙烯）溶液，然后用洗凈的干燥的載玻片伸入到該溶液中停留片刻，平穩取出，自然干燥后玻片上形成一層薄膜。 再用刀片沿玻片邊緣將膜劃破，繼將該玻片的一端垂直浸入玻璃平皿的蒸餾水中，待玻片上的薄膜完全漂在水面，把玻片輕輕

4、下壓取出。 再將銅網排列在膜上，用濾紙與銅網完全貼附后，用鑷子夾住濾紙的一角輕輕將其取出放于培養皿中，待自然干燥后就使用了 。Formvar支持膜的制備支持膜的制備 在使用之前，新網和舊網都需要進行清洗，清洗的目的除了使載網清潔之外，還有除去載網的靜電以便撈片的作用。對于新的載網，直接用95的乙醇浸泡一下，再用重蒸水沖洗后自然晾干即可。舊載網的清洗方法有以下兩種： 氯仿法：把舊網放入錐形瓶中，用氯仿浸泡若干天，經常晃動幫助殘存的樣品從載網上脫落，接著用重蒸水沖洗數次，再用100乙醇洗一次后，放在墊有濾紙的培養皿中自然晾干。 燒灼法：用95的乙醇燒灼片刻后放入其中，最后用重蒸水沖洗數次，最后一次

5、用100乙醇，撈出后自然晾干。 由于電子束穿透能力很低，因此要求所觀察的樣品很薄，對于常用的75-200kv加速電壓來說，樣品厚度控制在100-200nm為宜。對于那些易起變化或難以制成電子束對于那些易起變化或難以制成電子束透明的薄膜試樣采用復型法制備樣品透明的薄膜試樣采用復型法制備樣品。復型法是用中間媒介物（碳、塑料薄膜）把固體樣品表面微觀形貌浮雕復制到薄膜上，利用透射電子的質厚襯度效應，通過對浮雕的觀察，間接地得到材料表面組織形貌。復型法得到的樣品是一種間接試樣。 它只能用于試樣表面形貌的觀察和研究，而不能用來觀察試樣的內部結構。5.2.2 復型法 對復型材料的主要要求： 復型材料本身必須

6、是“無結構”或非晶態的； 有足夠的強度和剛度，良好的導電、導熱和耐電子束轟擊性能。復型的種類復型的種類 按復型的制備方法，復型主要分為： 一級復型 二級復型 萃取復型（半直接樣品） 碳一級復型 （1）用常規方法將試樣的表面拋光、腐蝕，其腐蝕深度較一般金相腐蝕略深。斷口最好為新鮮斷口。 （2）在真空鍍膜儀中將試樣表面噴鍍一層碳膜，厚度控制在1020nm。 （3）用刀片或針尖將碳膜表面劃成33mm的小方塊。 （4）將試樣在專用的電解液中進行電解。當碳膜的邊角翹起或有個別碳膜脫落時，取出試樣并放到無水乙醇溶液中輕輕晃動，使碳膜脫落。 （5）再用無水乙醇或水將碳膜輕輕漂洗23次，再在溶液中停留幾分鐘，

7、將電解液徹底清除干凈。 （6）用銅網撈出晾干即可。碳一級復型示意圖二級復型（1）用常規方法將試樣表面拋光、腐蝕，其腐蝕深度較一般金相腐蝕略深。（2）配制好0.5%、1%、2%、5%幾種不同濃度的火棉膠醋酸異戊脂溶液。（3）取0.5%的火棉膠溶液均勻地涂于試樣表面，用紅外燈烤干，依次用同樣的方法將1%、2%或5%的火棉膠溶液涂于試樣表面，并烤干。（4）用透明膠帶緊貼火棉膠面，不能有氣泡，小心地將膠帶與復型膜一同揭下來，讓復型膜面朝上，將膠帶固定在載玻片上，做好標記。（5）用真空鍍膜儀在復型膜面上蒸發上1020nm厚的碳膜。（6）用尖刀將想要觀察部分剪成略小于3mm銅網的小方塊，放入二甲苯溶液中，

8、浸泡1小時使膠帶與復型膜分離。（7）用銅網將與膠帶分離的復型膜撈到醋酸異戊脂溶液中溶掉火棉膠。（8）待火棉膠完全溶解后，用3mm銅網撈出，晾干。萃取復型 定義：萃取復型是樣品制備中最重要的進展之一，其目的在于如實地復制樣品表面的形貌，同時又把細小的第二相顆粒（如金屬間化合物、碳化物和非金屬夾雜物等）從腐蝕的金屬表面萃取出來，嵌在復型中，被萃取的細小顆粒的分布與它們原來在樣品中的分布完全相同，因而復型材料就提供了一個與基體結構一樣的復制品。萃取出來的顆粒具有相當好的襯度，而且可以在電鏡下做電子衍射分析。 萃取復型選擇的腐蝕劑要求能夠腐蝕并顯示基體組織形貌，但不能與萃取相發生化學反應，其腐蝕深度也

9、較普通復型樣品的腐蝕深度要深些。碳萃取復型方法 按照一般金相試樣的要求對試樣磨削、拋光。 選擇適當的浸蝕劑進行深腐蝕，這種浸蝕劑既能溶去基體而又不會腐蝕第二相顆粒。 將試樣認真清洗以除去腐蝕產物。 將試樣放入真空鍍膜機中噴碳，噴碳時轉動試樣以使碳復型致密地包住析出物或夾雜物。 選擇適當的電解液進行電解脫膜，電解脫膜時電流密度要適當，電流過大形成大量的氣泡會使碳復型膜碎裂，電流過小則長時間脫不掉碳膜，適當的電流要通過試驗確定。 將脫下的碳膜撈入新鮮電解液中停留10min左右，以溶掉帖在碳膜上的腐蝕產物。 將碳膜撈入酒精中清洗，最后用銅網撈起放到濾紙上干燥待觀察。萃取復型示意圖5.2.3薄 膜 法

10、 薄薄 膜膜 法法：不僅可得到高分辨率圖像，顯示試樣內部十分細小的組織形貌襯度，還可以獲得許多與試樣晶體結構有關的信息（如點陣類型、位向關系、缺陷組態等）。A 金屬樣品：雙噴電解減薄法、離子減薄法B 無機非金屬材料和導體礦物質：離子減薄法C 高分子材料和生物試樣：超薄切片法5.2.3.1 金屬薄膜樣品的制備 目前較普遍地被采用的金屬薄膜制備過程大體是： 線切割-機械研磨（或化學拋光）-化學拋光-電解拋光。具體方法如下：1.線切割線切割：用線切割機床從大塊樣品上切下0.2-0.3mm厚的薄片，一般多切幾片備用。2.機械研磨預減薄機械研磨預減?。簷C械研磨方法與金相試樣拋光過程基本一致，其目的是將線

11、切割留下的凹凸不平的表面拋光并預減薄至100m左右。機械研磨具有快速和易于控制厚度的優點，但難免產生應變損傷和樣品升溫，因此，減薄厚度不應小于100m，否則其損傷層將貫穿薄片的全部深度。 簡單的機械研磨可以產生大面積的薄區，但卻使樣品過于脆弱，很容易損壞，以我們的經驗，一般Si材料可以平磨到50m左右，對于脆性材料可適當增加厚度。手工平磨時，應采用不斷變換樣品角度，或者沿“8”字軌跡的手法可以避免過早出現樣品邊緣傾角。 如圖示： P1500P20001m金剛石膏金剛石膏 3.化學拋光預減薄化學拋光預減薄 化學拋光是一種快速的減薄過程。拋光液一般包括三個基本成分，即硝酸或雙氧水等強氧化劑用以氧化

12、樣品表面。又以另一種酸溶解產生的氧化物層，此外還應含有粘滯劑以作為溶解下來的原子進行擴散的介質。 4.雙噴電解最終減薄雙噴電解最終減薄 經過化學拋光預減薄的薄片可以沖成3mm的小試樣，剪成小塊試樣，然后將樣品放入雙噴電解拋光裝置的噴嘴之間進行最終的減薄處理。最后得到的是中心帶有穿透小孔的薄片樣品，將樣品清洗干燥即可以直接在透射電鏡下觀察小孔周圍的透明區域。電解拋光的拋光液配法很多，最常用的是10高氯酸酒精溶液. 雙噴電解減薄工作原理雙噴電解減薄工作原理：試樣與鉑絲導線保持接觸作為陽極，電解液噴管中的一對鉑絲作為陰極，噴管對準試樣的中心。電解液通過耐酸泵加壓循環。樣品中心逐漸減薄，直至穿透。洞口

13、的邊緣為透射電鏡觀察的區域，厚度小于200nm。一般采用雙噴或者離子減薄。 這種方法主要用于金屬和合金樣品。 離子減薄儀的工作原理離子減薄儀的工作原理：在電場作用下氬氣被電離成帶Ar+的氬離子，帶著一定能量的氬離子從陽極飛向陰極，通過陰極孔，打在接地的樣品表面，使樣品表面濺射，這就是氬離子轟擊的基本原理。 這種方法對于陶瓷、金屬等試樣都可以適用，是一種普適的減薄方法 。雙噴電解拋光裝置原理圖雙噴電解減薄儀離子減薄裝置原理示意圖金屬與非金屬薄膜制備工藝圖金屬與非金屬薄膜制備工藝圖500m80m3mm5m2.5mm5.3 超薄切片的基本操作程序 超薄切片是生物樣品制備方法中最基本、最常用的技術。制

14、備超薄切片的過程包括兩個大的步驟： 第一步是制備組織包埋塊；第一步是制備組織包埋塊； 第二步是切塊。第二步是切塊。 高分子生物醫學材料超薄切片流程圖5.3.1 取材 取材-按“快、冷、小、凈、準”的原則，在盡可能短的時間內將1mm3的樣品放入 固定液。 快快 為了能觀察到盡量接近生活狀態時的生物組織或細胞結構，取材越快越好。 冷冷 盡量保持低溫下操作，使酶作用降低，減小對微細結構的影響。 小小 取材時，動作要輕巧，刀片要鋒利，組織塊要 1mm3 。否則固定液穿透不良。 凈凈 盡量少帶血液或組織液進入固定液。但切忌用水沖洗，可用緩沖液把表面血液或組織液沖掉。 準準 取材的部位要準確。電子顯微鏡的

15、放大倍率很高，觀察到的視野很小。為了避免由于取材不準確而造成的一孔之見，要求取材要有一定的形態學實驗基礎。 定義定義：指用物理的或化學的方法手段迅速地殺死細胞，使組織細胞的形態盡可能地保存在接近其生活時的狀態。 目的：目的： 1.防止組織細胞離體后變化，防止自溶，以保持組織細胞的成分和結構與其生活狀態盡量一致。 2.在固定以后的漂洗、脫水和包埋等樣品處理過程中，保護樣品使其物質不致溶解和流失。 3.使組織適當的硬化為樣品以后的處理做好準備。 方法：方法： 有物理的和化學的固定法。其中化學的方法是最常用的固定方法。對于不同的樣品材料，以及不同的實驗目的應采取不同的固定方法。5.3.2固定 化學固

16、定，化學固定，是用化學試劑使各種結構成分形成不溶物，以免被水溶液與酯溶劑所提取。組織塊切小后，立即浸到大量固定液中。一般使用青霉素小瓶，每瓶放10-20塊組織，固定液2-4ml，置于4攝氏度固定2-4h或更長時間常用雙重固定或多重固定。一般常用的固定劑是戊二醛和鋨酸。一般常用醛類固定液做預固定，經過漂洗后再用四氧化鋨固定液后固定，以提高固定效果。 物理的方法物理的方法指用冷、熱或微波等物理方法對生物組織進行固定，是化學固定的輔助方法。冷凍固定和微波固定是較為常用的方法。 1.四氧化鋨和四氧化鋨固定液四氧化鋨和四氧化鋨固定液 四氧化鋨也被稱為鋨酸。實際上它既非電解質，也不生成鹽，是強氧化劑。市售

17、為安瓿狀的微黃色結晶，揮發性強，有強烈的刺激性氣味。該試劑較貴重，0.5g或1g包裝。四氧化鋨的毒性很強，它的蒸汽對眼角膜及鼻、喉粘膜具有毒性作用，使用時要注意防護作用，最好在通風櫥內操作。 四氧化鋨固定液一般配置成2%的水溶液保存，臨用時加等量的緩沖液稀釋，使最終濃度為1%，鋨酸不易溶解，配后要1-2天才能使用，而且應該避光，貯存在冰箱內。水溶液應呈無色或淡黃色透明，若變成棕色則不能使用。優點優點： 它能與不飽和脂肪酸結合形成脂肪-鋨復合物固定脂類，與蛋白質發生交聯穩定蛋白質，因此能較好的保存組織細胞的微細結構；雖然四氧化鋨不和單獨的核酸及糖類起反應，但當核酸糖類與蛋白質結合在一起時也能被固

18、定，因此它幾乎能和所有的細胞成分結合；四氧化鋨電子密度高，能使被固定的組織產生良好的反差，本身起到染色的作用。而其它對緩沖液的要求不高。缺點缺點:1.它不能保護糖原不能固定核酸，對微管固定較差；2.四氧化鋨滲透組織很慢，所以組織塊要切的很小。當組織塊大于1mm以上時，不能得到完全固定。3.四氧化鋨不能保存酶的活性，因此不能用作細胞化學的固定劑。 2.戊二醛和戊二醛固定液戊二醛和戊二醛固定液戊二醛含有兩個醛基，30以上濃度的戊二醛易聚合，一般商品濃度在25以下，含有較多雜質。新處理過的戊二醛為無色或很淡的黃色，貯存久時顏色會變深。由于戊二醛中的醛基易氧化為有機酸，使PH值下降。當PH值下降到3.

19、5以下時，就失去固定能力，需要純化。純化的方法有蒸餾及用活性炭處理等方法。醛類固定劑固定后，一般需要四氧化鋨進行二次固定，這就是廣泛應用的雙固定方法。戊二醛固定劑具有下列優點：1.它與蛋白質交聯的能力是固定劑中最好的，也能固定糖原和核酸，對細胞內結構如微管等保存也較好，并能保存細胞內一些酶的活性，因此是保存精細結構最有效的醛；2.戊二醛的滲透速度比四氧化鋨要快些，且反應快；3.戊二醛能夠彌補四氧化鋨固定劑的不足，對微管、內質網和細胞基質有較好的固定作用，可以避免四氧化鋨做原始固定劑可能產生的抽提作用；戊二醛較適用于進行超微細細胞化學研究工作。 戊二醛固定的主要缺點為： 1.它不能固定脂質，致使

20、其在以后的脫水過程中被有機溶劑溶去，因而不適于作為單獨的電鏡固定劑； 2.戊二醛不像四氧化鋨那樣能提供高反差，因此與四氧化鋨復合使用，則可發揮兩種固定劑的長處，互相彌補不足之處； 3.戊二醛固定不影響細胞的滲透性，因此它對緩沖液及其滲透壓要求較高。 戊二醛通過交聯作用穩定細胞的結構，對細胞膜系統、糖原、核蛋白和細胞基質的固定效果好。固定時溫度允許在4度至10度之間，固定的時間根據樣品而定。濃度一般用緩沖液配制成2-3%。 3.多聚甲醛和多聚甲醛固定液多聚甲醛和多聚甲醛固定液 多聚甲醛：電鏡樣品固定多用純化的多聚甲醛，為白色粉末。多聚甲醛經水解后，解聚為甲醛溶液。多聚甲醛的優點是能和蛋白質、脂類

21、、核酸等起反應，并能保存部分細胞內酶的活性；多聚甲醛的分子很小，因此穿透組織的能力很強，對固定致密的組織以及較大的組織尤其合適。此外，多聚甲醛價格便宜、使用方便。但甲醛只有一個醛基，反應速度慢，與組織形成的交聯數目比戊二醛固定液少，導致甲醛固定液的微細結構的保存和組織反差不如戊二醛固定液。所以，多聚甲醛固定液一般多用于組織化學或快速固定。在樣品前處理中，一般用多聚甲醛固定液作為前固定，以后再用四氧化鋨做后固定，能取長補短，效果好。也可與戊二醛同時進行混合固定，效果更好。 化學固定劑通常需用一定的緩沖液配制，緩沖介質在固定時所起的作用為：使固定液維持穩定的PH，使固定液有適當的滲透壓，不使細胞收

22、縮或腫脹；提供適當的離子成分，使細胞成分不被抽提或成點。用于電鏡固定液的緩沖介質有多種，如磷酸緩沖液、二甲砷酸鹽緩沖液等。由于大多數動物組織的PH值為7.4，因此緩沖液的PH值選擇在7.4左右。緩沖液及其配制 磷酸緩沖液 它的優點是便宜，無毒但缺點是久放易產生沉淀易遭到細菌的污染。磷酸緩沖液的PH會隨溫度的變化而稍有變化，在PH7.5以下，它的緩沖能力很強，控制固定液的PH值比較有效。磷酸緩沖液常用于配制戊二醛固定液。 二甲砷酸鹽緩沖液 此溶液配制比較簡單，也比較穩定，能保存，不易被細菌污染；但有一定毒性，配制時要小心，應在防護罩內進行配制。盡量不使試劑與皮膚直接接觸，避免呼吸道吸入。常用濃度

23、為0.1mol/L。 醋酸巴比妥緩沖液 醋酸巴比妥液在電鏡技術的早期用來配制四氧化鋨，固定效果比磷酸緩沖液的效果好。此緩沖液緩沖能力較差，和醛產生作用后減弱緩沖能力，因此不能用來配制醛類固定液。此外，該緩沖液易于被細菌污染，不能長期保存。 4.影響固定效果的因素：影響固定效果的因素： 固定是一種復雜的化學過程。固定液的PH、濃度、離子組成與滲透壓、固定時的溫度、時間與方式以及組織塊的大小等因素都能影響固定的效果。至今還沒發現一種固定液適合任何一種組織，因此在實際工作中就需要根據不同的組織選用恰當的固定液和固定條件。 固定液的固定液的PH 蛋白質是一種兩性化合物，其相對分子質量以及其它理化性質與

24、溶液的PH密切相關。固定液的PH將影響細胞中原生質的組成、膜的選擇性及酶的活性。固定液的PH必須接近固定組織的PH，這樣可以使細胞避免由固定液所造成的蛋白質結構和性質的變化。固定液的濃度固定液的濃度 一般來說，較低的濃度需要較長的固定時間，這樣就容易引起酶的擴散、細胞物質的抽提及組織的腫脹。過高的固定濃度液是不合適的，因為濃的溶液毀壞酶的活性和細胞的精細結構。尤其是氧化固定劑，如鋨酸和高錳酸鉀，只有在適當的濃度下，才是有效的交聯劑，較高的濃度就會造成蛋白質分子的斷裂。含水較多的組織，一般需要較高的固定濃度。固定液滲透壓及離子組成固定液滲透壓及離子組成。 一般來說，低滲的固定液容易引起組織膨脹，

25、而高滲的固定液容易造成組織的收縮。為了調節固定液與組織的滲透壓平衡，固定液中常加入鉀、鈉、鈣鹽等電解質或葡萄糖、蔗糖等非電解質。固定的溫度和時間固定的溫度和時間 為了降低酶的活性、減少細胞自溶及胞內物質的抽提，大部分組織通常是在0-4攝氏度下固定1-4h，但細胞中的微管與微絲應在室溫下固定。由于化學固定所引起的物質的抽提是隨時間逐漸進行的，因此，過度的固定可能丟失更多的物質。組織塊的大小組織塊的大小 固定作用通常是不均勻的，從組織塊的表層到深部，存在著固定梯度。表層有高濃度的鋨的沉積，但這一層的機械損傷較大；中心部位無機械損傷但往往固定不足。因此，在這兩層之間的那一部分組織是比較理想的。一般來

26、說，鋨酸的均勻固定大約在0.25mm的深度，因此組織塊的大小最好在0.5mm3左右。固定是標本制備過程中及其關鍵的一步，也是復雜的化學過程。其中的每個因素都會影響固定的效果。5.3.3 漂洗與脫水 組織固定后，應用漂洗液洗去殘留的固定液，尤其是醛類固定液固定后，一定要充分漂洗干凈，一般需漂洗5次以上，漂洗時間為2h或過夜。這是因為醛會和鋨酸起反應，產生細而致密的顆粒沉淀在樣品中，既影響鋨酸的固定作用，又會造成樣品污染。此外，由于鋨酸亦和乙醇作用，產生沉淀，因而用鋨酸固定后，也應把多余的鋨酸固定液漂洗掉，但洗的時間可以短些，10-15min即可。常規電鏡樣品中所用的漂洗液一般是0.1mol/l磷

27、酸緩沖液，其溫度與固定液溫度一致，為4度。 大多數生物樣品中水分的比例很高，達70-80%以上，而水中又有85-90%為游離態水，再加上包埋劑多為水不溶性物質，因此，如果包埋前不徹底除去樣品中的游離態水將影響包埋塊的質量。單純的烘干會使樣品收縮變形，并破壞其超微空間結構，所以要進行脫水。 脫水劑包括甲醇、乙醇、丙酮、乙二醇等，最常用的為乙醇。一般用乙醇脫水時，其梯度濃度為30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%兩次，每部10-15min。另外，70%以前需要在4度操作，80%以后轉至室溫。 如果選用環氧樹脂包埋，用乙醇脫水后，最好再用環氧丙烷處理20-30分鐘，以置換出樣品中的

28、乙醇。因為乙醇與環氧樹脂不能很好的混溶，可能會影響包埋塊的質量。 脫水l脫水劑的梯度幅度和每步脫水的時間都有講究，梯度過大，速度過快會使樣品樣品收縮收縮，而脫水劑的濃度在70%以前時，每步脫水的時間過長會使樣品膨脹過長會使樣品膨脹；在95%以后每步脫水的時間過長會使樣品收縮；只有在70%時，因為與生物樣品的滲透壓相似，可停留較長時間。l脫水過程中應注意兩點：一是脫水要充分，脫水不完全會導致滲透不完全，造成切片困難，還會引起組織和細胞受損；二是更換脫水劑是動作要快，尤其是換無水乙醇時，不要使樣品干燥，否則樣品內易產生小氣泡而影響包埋劑的浸透。 組織塊在脫完水后，要用一種常溫下為液態、經過加溫聚合

29、后有一定硬度的介質對其進行處理，使處理后的組織有適當的硬度和良好的切割性能。這種介質就稱為包埋劑。通過脫水劑稀釋包埋劑，并最終以包埋劑完全取代脫水劑，使其滲透到組織塊中的過程就是浸透。而將浸透好的組織塊放在適當磨具中并灌入包埋劑，再加溫聚合成硬塊的過程就是包埋。5.3.4浸透與包埋 浸透的目的和方法：浸透的目的是用包埋劑逐步替代浸入樣品內部的脫水劑，以填充樣品超微結構的各個空間。 包埋的目的： 經過脫水和浸透的樣品還不能直接進行超薄切片，還需要用某種在一定條件下能聚合成硬塊的單體樹脂，來填充樣品的各個空間，把這一過程稱為包埋。 聚合：有加溫聚合、降溫聚合、快速聚合、或慢速聚合、普通光照聚合或紫

30、外光照聚合。 理想的包埋劑應具備以下特征：理想的包埋劑應具備以下特征： 處于液態時粘度小、易滲透； 固化后既不膨脹也不收縮，并有一定的機械強度，有助于保存樣品的超微結構和制備超薄切片。并在電子束的轟擊下性能穩定，不升華、變形和斷裂，并且不干擾樣品本身的而超微結構有良好的電子透過性。 常用的包埋劑有環氧樹脂包埋劑、聚酯樹脂包埋劑和甲基丙烯酸脂包埋劑。國內常用的為國產環氧樹脂618、Epon812及低粘度Spurr環氧樹脂。 環氧樹脂為熱塑性樹脂，是淡黃色或蜜黃色的液體。分子中有兩種化學反應基團，即環氧基和羥基。末端環氧基易打開，與其它含有活性氫原子的化合物如胺類形成首尾相接的長鏈狀聚合物。 能夠

31、促進末端相接的交聯劑叫做催化劑或加速劑催化劑或加速劑，它們能催化聚合反應，而本身并不加入到樹脂鏈中。 此外，單體中的羥基能和酸酐結合形成分子間的橫橋連接。這種起橫橋式連接作用的交聯劑叫做硬化劑或固化硬化劑或固化劑，它們參與交聯反應并被吸收到樹脂鏈中。因此，環氧樹脂單體、胺類、和酸酐三者按照一定的比例混合，在一定溫度下可形成具有三維空間結構、穩定的抗熱和抗溶的交聯狀聚合物。浸透和包埋的具體操作(一) 浸透組織塊在用乙醇和無水丙酮或環氧丙烷脫水后，用包埋劑與與環氧丙烷按照一定比例混合，逐漸滲透入組織塊，取代乙醇。因為包埋劑的黏度要比脫水劑大得多，所以要用環氧丙烷與包埋劑配制不同比例的浸透液，使浸透

32、液的粘度逐漸增加，以提高樣品的質量。環氧丙烷和環氧樹脂類的包埋劑較好的混溶，也有助于達到逐級浸透的目的。浸透液的配置和使用方法如下：環氧丙烷：包埋劑=3：1 （V/V） 3060分鐘環氧丙烷：包埋劑=1：1 （V/V） 3060分鐘環氧丙烷：包埋劑=1：3 （V/V） 3060分鐘100%包埋劑 1-2h注：在室溫或是30-35度下浸透，必要時用慢搖床提高浸透的效果。浸透的時間可以靈活的掌握。 浸透完成后就要進行包埋。操作：取要用空心膠囊或特制的錐形塑料囊或多孔橡膠模板作包埋塊的模子。包埋前先將膠囊或模板置于60度溫箱中1-3h烘干；包埋時，先在膠囊中滴一滴包埋劑，再將組織塊用牙簽挑至膠囊中，

33、然后注入包埋劑。或先將膠囊注滿包埋劑，再用牙簽挑起組織塊放在膠囊的液面中心，讓組織塊自然沉淀，然后進行聚合。 使用不同的包埋劑，制備不同的樣品，需要的聚合條件不同。有加溫聚合、降溫聚合、快速聚合或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合。環氧樹脂618、Epon812可置于37度烤箱中12h或過夜，60度36-48h，亦可直接放入60度溫箱中聚合，時間為1-2d；Spurr樹脂放在70度溫箱8h即可?？傊?，要使包埋劑完全聚合，才能有均勻的硬度否則會到導致切片困難。5.3.5包埋及聚合硬化包埋操作中應注意以下幾點：(1)所有試劑要防潮，最好存放在干燥器中；(2)所用器皿應烘干；(3)配包埋劑時，每加

34、入一種試劑要攪拌均勻；(4)包埋時動作要輕巧，防止產生氣泡；(5)皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；(6)盛放過包埋劑的容器要及時用丙酮清洗干凈。 常用包埋模具常用包埋模具5.3.6修塊與半薄切片定位 修塊：是成功切出理想連續切片的關鍵。通常采用手工修塊，將已聚合的環氧樹脂包埋塊放入專用的樣品夾中，在解剖鏡下用單面刀片修去其頂端和組織周圍多余的包埋介質，暴露出的表面積小于0.1mm2和低于0.2mm的小方臺，修完后呈金字塔形。 定位:由于超薄切片的面積極小，為了在電鏡觀察時容易找到所希望觀察的部位，進行超薄切片前必須進行定位。半薄切片定位利用超薄切片機切厚度為1m-10m的切片，稱厚切片或

35、半薄切片。將切下的片子用鑷子或吸管轉移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經甲苯 胺 藍 染 色 ， 光 學 顯 微 鏡 觀 察 定 位。標本修塊標本修塊 半薄切片進行光學顯微鏡觀察的目的：(1) 定位：通過光學顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要用電鏡觀察的部分，修去其余部分。(2)便于對同一組織的同一部位進行光學顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以后，要對包埋塊作進一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形，每邊的長度為0.2mm0.3mm。5.3.7超薄切片 包埋塊修整好后就進入超薄切片階段了。要獲得高質量的電鏡照片，切片必須是超薄的，厚度

36、均勻，表面平整，無震顫、無皺褶和破裂，且能耐受高真空和電子束的轟擊。 超薄切片機是用來將已包埋在環氧樹脂中或已冷凍固定的生物樣品制成納米級厚度薄樣品的專業機器。超薄切片機從進刀原理構成上可以分為兩大類：一類是以熱膨脹為主的切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產生的微小長度變化來提供推進。一類是以機械推進式為主的切片機，用微動螺旋和微動杠桿微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進。 70年代前生產的為熱膨脹式，80年代開始向機械推進式過度，目前的超薄切片機大多數為機械推進式。1.熱膨脹式超薄切片機 ：以LKB的系列產品為代表，該類超薄切片機的進刀控制由對熱極為敏感的金屬材料控制，當對其進行加熱時，該金屬規則膨

37、脹，使切片機刀口緩緩向前推進，由于該種超薄切片機對溫度極為敏感，所以在超薄切片的時候，對切片室的溫度穩定性要求極高，溫度變化大，易造成切片不穩定，切片厚度不易控制。因此在切制50nm以下的生物樣品及用鉆石刀切片時，最好不用。2.機械推進式超薄切片機：以萊卡系列產品為代表，該類型超薄切片機的進刀以機械推進機械推進的方式進行。由于采用了高精度的機械推進裝置，使進刀的穩定性大大提高，摒棄了熱膨脹式超薄切片機由于溫度不穩定而帶來的切片質量不易控制的缺點，如再配合使用鉆石刀，則超薄切片的質量能夠達到理想的程度。目前超薄切片機的類型基本上以機械推進式為主流。Leica EM FC6 冷凍超薄切片機 超薄切

38、片使用的刀有兩種，可選用鉆石刀或玻璃刀。鉆石刀的質量好，不用特意制備，市售有多種型號供選擇，經久耐用，切片時容易對刀和切出優良的連續切片，特別適宜質地硬的樣品。但其價格昂貴。玻璃刀臨用之前制作，刀刃易脆裂，通常一把刀切一個樣品就得廢棄，且適宜質地較軟的樣品，但價格相對便宜的得多。這里講的制刀指的是用制刀機制備玻璃刀的方法。制刀用的玻璃為硬質玻璃，厚度為5mm6.5mm。制刀制刀 玻璃刀用制刀機制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水槽和膠布水槽兩種。塑料水槽有固定的形狀，可反復使用。膠布水槽是臨時用膠布或專用塑料條制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固

39、接口，防止漏水。刀槽刀槽刀的檢查和保護刀的檢查和保護：明顯的劣質刀是出現雙刀跟（即無刀鋒）、刀緣突起、刀緣凹陷或刀緣上有明顯的裂損等，這樣的刀不能用。為了減少切片時的麻煩，有必要先檢查刀緣是否有用肉眼不易看出的微小的損傷，及時淘汰劣質玻璃刀。方法是把刀安放在切片機的刀架上，打開白熾燈，在顯微鏡下觀察刀緣，如果刀緣成一條暗線（尤其是在刀緣的左側1/3段內），說明其鋒利無損。如果刀緣上有許多反光的亮點，說明有小的裂損。用這樣的刀切片，k肯定有劃痕，因此棄之不用。為了保護刀緣，制刀和切片過程中絕對不能用任何異物去碰，并且最好現做現用，以免因放置過久，空氣的氧化作用使刀緣失去鋒利。玻璃刀玻璃刀超薄切片

40、的步驟包括：超薄切片的步驟包括：(1)安裝包埋塊；(2)安裝玻璃刀；(3)調節刀與組織塊的距離；(4)預切片；(5)換切片刀重新調節刀與組織塊的距離；(6)調節切片厚度及切片速度，切片；(7)將切片撈在有支持膜的載網上。 由于超薄切片切下的片子很薄，很難測量其厚度，因此，一般利用切片表面反射的光和從切片下面反射光所產生的干涉色來判斷切片厚度，厚度不同的切片在顯微鏡下呈現的干涉色也不同。用樹脂包埋的切片，其干涉色與厚度的關系如下： 灰色：40-50nm；銀白色：50-70nm；金黃色：70-90nm；紫色：90nm以上。切片中可能出現的問題和解決的方法 產生問題的原因：切片的質量往往受到諸多因素

41、的影響，切片中很可能會出現各種各樣的問題，特別是有關切片質量的問題。如：切片開裂、切片過厚（表面的干涉光五顏六色）、切片上有一行行的平行排列的條紋或縱行的劃痕、切片不能連續成串等。原因有以下幾種，應具體分析： A影響包埋塊質量的因素-包埋劑是否混合均勻，聚合的時間溫度是否合適、樣品滲透是否充分等 B 切片準備工作方面的因素-修快是否規范，刀口是否鋒利，水槽的制作是否規范等 C 切片過程中的某些因素-刀角的選擇，可能過大或過小，刀和樣品的安裝是否牢固和標準，切速過快過慢，對刀是否規范等 D 其它方面的因素-附近是否有大型機械振動源，電壓是否穩定，室溫是否過高或過低等。 可能出現的問題和相應的措施

42、： A 切片上有顫紋：這是切片時最常出現的問題之一，其表現為切片上布滿平行于刀緣的條紋，或粗或細，疏密不一。這是在切片過程中有震顫引起的。下表介紹了產生震顫的原因和解決的辦法。B 切片破碎：切片破碎是不宜撈取的，不完整的片子在電鏡觀察時往往也得不到良好的圖像。其原因和解決的辦法如下：切片表面凹凸不平-用手動切片重新修塊，直到切下完整的片子為止包埋塊脆-重新包埋，嚴格按照配方比例，并充分攪拌包埋劑和適當延長滲透時間。另外，脫水不徹底也會使包埋塊脆并有許多小空洞，有時甚至在修塊時就能看到大大小小的空洞。一般對于這樣的包埋塊就廢棄了，并在重新包埋時注意嚴格脫水，在攪拌包埋劑時應盡量減少氣泡的產生，并

43、靜置一段時間，使氣泡排掉之后再用。C切片不能連成帶：有的研究工作需要觀察連續 切片，如果切下的片一個一個都散開就無法撈片，其原因可能如下：D切片厚薄不勻：同一張切片有厚有薄的表現是切片的干涉色不一致，即有深有淺或五顏六色，這將直接影響成像的質量。切片上有空脂-重新修塊；立體鏡下示透亮的區域為空脂，即指沒有樣品結構的區域?？瞻装窠橘|與有樣品結構的區域的硬度是不一致的，因此用同一硬度的刀切片時，會導致切片的厚薄不均，解決的辦法是在重新修塊時去掉空白區。刀緣的銳度不一致-調整刀緣或換刀。當刀緣的不同區域的銳度不一致時，刀緣銳利的部分切出的片子薄，反之則厚。E其它：切片帶水-指樣品塊頭部和刀背上沾水

44、，使無法正常切片。解決的辦法是用干凈的濾紙條吸掉，但要注意操作時切勿碰刀緣，如果是水槽液面太高引起的，就需要重新調整一下液面。空切-切片時只有樣品臂上下運動，卻見不到有片下來的情況稱為空切。引起空切的原因可能是對刀不準，距樣品太遠或樣品面與刀緣不平行。也可能是加熱不足或切速過快等。水面干涉色消失-有時在切片過程中，本來已經調好的乳白的干涉色水面會緩緩消失，變成一片片黑影，使無法觀察切片。其原因是水槽的液面下降了，這可能使由于切片過程太長、水分揮發和連續撈片損失引起的；也可能使由于水槽漏水引起的。5.3.8 電子染色 生物樣品的化學成分主要是C、H、O、N等原子序數低的元素，再加上透射電鏡要求樣

45、品先制成超薄切片（100nm左右），所以生物樣品對電子的散射能力很小，圖像反差很低。為了提高生物樣品的反差，首先要設法增加其對電子的散射能力。選用重金屬鹽類進行電子染色可以達到這一目的。 超薄切片的染色指的是用重金屬鹽溶液處理樣品使其與細胞中某些特定成份結合或吸附在某些特定的結構上。常用的重金屬：鋨、鎢、鉛、錳等。因它們對生物樣品中的不同組分有不同程度的結合力，因此樣品中結合重金屬鹽的區域對電子的散射能力也會不同程度的增強，使電子圖像顯示深淺不一的黑白色。這樣既增強生物樣品的反差，又增加了成像的層次，從而大大提高了電子顯微圖像質量。 鈾鹽：常用醋酸雙氧鈾配制電子染色劑。醋酸雙氧鈾為熒光黃色粉末

46、，再15度時飽和溶液的的濃度為7.7，用50或70的乙醇配制可提高溶解度。它能發射熒光，有微量放射性，所以應用時應格外小心。染色時需避免強光照射，并且用棕色瓶子壁光保存。它的染色效應是通過雙氧鈾離子與樣品中的生物分子基團結合而實現的。生物分子基團能夠提供一對電子，因而能于金屬離子相結合，形成金屬復合物。一個雙氧鈾離子能與一個或多個生物分子基團相結合，形成不同的金屬復合物。而雙氧鈾離子與羧基和磷酸基的親和性較強，對富含這樣結構的物質有廣泛而明顯的染色效果，如：脫氧核糖核酸、蛋白質和結締組織等。 鉛鹽：常用檸檬酸鉛（枸櫞酸鉛）配制電子染色劑。 其染色原理：與樣品中不同的活性基團的反應機制不同，但鉛

47、鹽的染色效應是一種離子結合反應，即鉛離子與活性基團的反應。染液中的檸檬酸鈉的作用是螯合溶液中的鉛離子，并形成穩定的絡合物。這樣既減少碳酸鉛沉淀的形成，又能將鉛離子帶入樣品。在樣品中鉛與某些陰離子活性基團相結合，達到染色的目的。細胞核與核蛋白顆粒對鉛離子的親和力強，而糖原較差。 染色方法：常規超薄切片中常用的是醋酸鈾枸櫞酸鉛雙染法。 將1片潔凈的牙科蠟片放在培養皿中，滴一滴過濾的醋酸鈾染液到蠟片上，再將帶有切片的載網覆蓋在染液上，使有切片的一面與染液接觸，染色時間30min，染好后用水將切片洗凈洗干，再覆蓋在用同樣方法的在另一潔凈蠟片上的鉛染液上，有切片的那一面與染液接觸。鉛染色時應嚴格控制染色

48、時間5-7min即可，防止過染。同時應盡量減少暴露愛空氣中的時間，并可在培養皿的周圍放些氫氧化鈉結晶，以免鉛染液與空氣中的二氧化碳形成沉淀，污染切片。超薄切片染色步驟超薄切片染色步驟超薄切片法流程 取材-按“快、小、輕、準、冷”的原則，在盡可能短 的時 間內將1mm3的樣品放入 固定液。 前固定-2 % -5%戊二醛，1小時 4冰箱保存 清洗（1）-磷酸緩沖液 10-15分鐘，3次。 后固定-1%鋨酸1-2小時, 4冰箱保存。 清洗（2）-同清洗（1） 脫水-酒精/丙酮梯度脫水：50%、70%、80%、90%，各10-15分鐘/次，100%，10-15分鐘/2次 。 浸透-包埋劑浸透3小時（可

49、過夜）； 包埋-用包埋劑將樣品包埋在膠囊或包埋板里； 聚合-置烤箱：37，24小時；45，24小時； 60，24小時； 超薄切片-用超薄切片機將樣品切成厚約50nm 的超薄切片； 電子染色-醋酸鈾30-40分鐘，檸檬酸鉛30分鐘； 電鏡觀察透射電鏡樣品制備程序透射電鏡樣品制備程序5.4 冷凍超薄切片冷凍超薄切片技術是在光學顯微冷凍切片和電鏡超薄切片的基礎上發展起來的。由于常規超薄切片技術中應用化學固定、有機溶劑脫水、樹脂包埋等一系列處理，均可使生物樣品受到物理和化學性損傷，引起組織和細胞內蛋白質分子變性，大部分可溶性成分及某些生物大分子物質被抽提或發生移位。為了彌補這些缺陷，人們創造了冷凍超薄

50、切片技術。70年代后，出現商品冷凍超薄切片裝置，使該技術有了更大發展。與普通的切片機相比，冷凍超薄切片的樣品更富有真實性，它不會因為脫水而損失某些成分；也不會與包埋劑發生某種化學反應；更不會因為熱聚合而使超微結構變形。目前，此技術可在分子水平上研究新鮮生物樣品的超微結構、各種生物大分子和某些元素在細胞內的分布狀態，并在細胞化學、免疫電鏡、X射線微區分析及可溶性物質放射自顯影研究等方面發揮巨大作用。 它的特點是用新鮮的材料直接冷凍固定，無需進行脫水、滲透、包埋與聚合等一系列繁瑣的程序。但要在冷凍之前進行預固定和冷凍保護處理，然后用冷凍超薄切片機進行切片。冷凍超薄技術的難點是在樣品制備過程中容易造

51、成冷凍損傷和干燥損傷等，大大降低樣品的價值。因此，人們先后研究了多種冷凍保護劑，如：甘油、二甲基亞砜、高濃度的蔗糖等。 一般冷凍超薄切片樣品的制備包括取材、冷凍保護、冷凍固定、冷凍超薄切片、冷凍干燥、染色等。 冰晶損傷是冷凍樣品制備技術最容易產生的缺陷。它是由樣品中的游離態水分凍結而造成的一種樣品結構的損傷，主要是由于冷凍速率不足引起的。一方面，冷凍速率不足時，細胞外的介質先結冰，形成冰晶（晶核），并以此為中心再吸收周圍的水分，使冰晶逐漸增多。這種吸收作用使細胞內游離態的水逸出，造成細胞受損，最終導致結構斷裂變形。另一方面，當冷凍速率比前者高些，但仍不足夠高，雖然細胞外介質中的水分與細胞內的游

52、離態的水都結冰了，細胞內的游離水不會逸出，但由于冷凍速度不足而形成了冰晶，從而導致細胞的精細結構斷裂變形。一般冷凍速率不足的主要原因是冷凍的溫度過高。當溫度在-140度-70度時，水結晶的形狀為立方形或六角形結晶，當樣品中存在結晶狀的冰時，必然導致樣品本身精細結構的損傷，冰晶損傷就是這樣形成的。解決的辦法是選擇優質冷凍劑和使用高效冷凍裝置。冷凍保護的意義冷凍保護的意義： 另一個原因是樣品過大，使深層區的細胞冷凍速率變慢，因而易遭受冰晶損傷。解決的辦法是盡量減小樣品的體積。最佳的冷凍效果是冷凍速率足夠大（大于冷凍速率足夠大（大于1000度度/秒），冷凍溫度足夠低（秒），冷凍溫度足夠低（-160度

53、以下），使細度以下），使細胞中游離態水迅速形成無定形水，而細胞中與蛋白質胞中游離態水迅速形成無定形水，而細胞中與蛋白質或脂肪結合的結合態的水卻不結冰?；蛑窘Y合的結合態的水卻不結冰。這樣的冷凍效果既可以保存樣品中超微結構，又可以保存樣品中的許多生物大分子和酶的活性，因而，對細胞化學、免疫電鏡、放射自顯影和X射線微區分析等方面的研究都非常有利。除了用優質冷凍劑和減小樣品體積之外，防止冰晶損傷的一個有效的方法是在冷凍之前對樣品進行冷凍保護。 用生物樣品做冷凍超薄切片的取材原則是快、準、小，樣品越新鮮越好。但生物樣品含水量高，如果不經冷凍保護，即使樣品塊已足夠小，在冷凍固定和冷凍超薄切片的過程中仍易

54、形成冰晶而破壞樣品的超微結構。有多種保護劑，如：甘油溶液、二甲基亞砜溶液、高濃度蔗糖溶液等，根據樣品的情況選擇冷凍保護劑。一般組織的含水量越高，所需冷凍保護劑的濃度也越高，因為這樣能保證冷凍固定時達到“玻璃化”而不產生冰晶。以達到冷凍保護的目的為前提，用冷凍保護劑處理的時間可依樣品的要求而定，一般從10min到幾個小時不等。其實，冷凍保護的原理是，用高濃度的冷凍保護劑處理生物樣品之后，樣品中所含的游離態的水與冷凍劑結合，使樣品中液體的濃度提高，與此同時就降低了樣品的冷凍點，這與鹽水不易凍結的道理是一樣的，其結果是防止樣品中形成冰晶。取材與冷凍保護 有時還可以在冷凍保護之前先對樣品進行預固定，以

55、提高樣品結構的穩定性。常用醛類做預固定劑。根據研究的目的和材料來選擇預固定劑和固定的條件。一般研究超微形態學可以選用2.5的戊二醛溶液，4攝氏度下固定1560分鐘。 直接冷凍固定含水分高的新鮮生物樣品時，即使選擇最佳固定條件，也難使樣品完全達到玻璃化而無冰晶損傷。一般固定效果理想的區域只是從樣品表面算起約10微米以內深度的那部分。因此，為了提高冷凍固定的質量，可先選用金屬鏡冷凍固定法，使樣品的內表面平整，再于低溫條件下，用預冷的修塊刀將樣品平面整修出一個小平面，面積約有0.2mm，然后再進一步冷凍固定。如果樣品需要預固定，則可以在預固定的過程中，用鋒利的刀片將樣品的頭部切成方形或梯形，冷凍固定

56、時注意把修好的那面調節到切片的位置上，使切片平整且大小適宜。快速冷凍固定 冷凍超薄切片質量的好壞直接決定于快速冷凍效果。常用的快速冷凍方式有二： 一是液氮直接冷凍； 二是金屬接觸冷凍。后一種方法較好，即將銅塊先置于液氮中，待溫度平衡后，將樣品與銅塊接觸510秒鐘，以達到快速傳導降溫的目的，然后再將樣品置于液氮中待用。 有很多冷凍固定裝置，目前常用的有KF80冷凍固定裝置、KF80.MM80金屬鏡冷凍固定裝置和MM80E金屬鏡冷凍固定裝置。 冷凍樣品的保存：當冷凍固定的樣品一時用不完時，可以保存一段時間，保存方法有以下幾種： 將樣品放在冷凍超薄切片機的樣品托上，一同進入液氮罐。 將樣品放入一個微

57、孔小金屬籠中，扣緊蓋，浸入液氮罐中。籠子上系上金屬絲，標上樣品名稱，并用蓋壓住金屬絲，需要樣品時提出來即可 將樣品暫存在緩沖液或醛類固定劑中。 用這些方法可以保存樣品若干星期或幾個月。 冷凍超薄切片(1)冷凍超薄切片機：該機是在固有型超薄切片機基礎上附加低溫操作裝置組成的。常用的機型是配以LKBCryoKit冷凍裝置的瑞典LKB型(或型)超薄切片機。該裝置包括：冷凍室、冷凍刀臺、冷凍樣品頭、存放液氮的杜瓦瓶及溫度和液氮水平控制器等。冷凍室是一個具有絕緣性能的塑料箱。它將冷凍刀臺和冷凍樣品頭罩在其內。刀臺、樣品頭分別有管道與杜瓦瓶相通，并通過管道不斷向它們輸送液氮；在刀臺和樣品頭內有溫度傳感器及

58、加熱裝置，有盛放致冷劑的容器，容器內還有致冷劑水平感受器。當用液氮作致冷劑時，其樣品頭溫度可控制在-70-170，刀溫控制在-70-150。溫度傳感器是由溫度及液氮水平控制裝置進行自動調節,其調節過程是向刀臺和樣品臺的致冷劑容器中灌滿液氮。若將控制裝置的溫度選擇在-100的位置，刀臺和樣品頭的溫度下降到-100以下，則傳感器即給控制裝置發出溫度下降的信息，控制裝置即可通過加熱器產生補償的加熱電流，使刀臺與樣品頭的溫度保持在-100的狀態。在切片過程中，由于液氮的不斷消耗，致使容器中的致冷劑不斷減少而液面下降，容器中的白金電阻器可感受液氮量的變化。當液面低于預定標準時，白金電阻器即可引起杜瓦瓶中

59、的加熱器工作以提高瓶中的壓力，使瓶中的液氮向致冷劑容器中流動，直至容器中的液面又恢復到原來的水平為止。 冷凍超薄切片的主要操作步驟完成冷凍固定后，就能把樣品裝入冷凍超薄切片機進行切片了。當然在轉運樣品的過程中要使其始終浸沒在液氮中。另外，還要事先打開冷凍超薄切片機，預冷到所需的溫度。冷凍超薄切片機主要有以下操作步驟。1.選擇切片的時樣品的溫度選擇切片的時樣品的溫度 因為溫度與生物樣品的超微結構有密切的關系，如：生物樣品在低于-35攝氏度時，形成冰晶的速度可減慢到忽略不記的程度。而細胞內的小分子物質和元素能穩定在原位的溫度的溫度條件是-80攝氏度以下。另外在-140度以下時樣品中的無定形固化水分

60、（玻璃態冰）才不會發生不可逆的變形等。所以樣品冷凍固定后為保證切片的質量在整個切片的過程中仍必須保持一定的低溫條件。當然在選擇切片過程中樣品的溫度時，還要考慮到研究的目的。選擇切片時刀的溫度選擇切片時刀的溫度：一般刀的溫度要比樣品的溫度高處10-20度為宜。理論上認為這樣利于切片，否則切下的片子粘在刀上不易沾取。選擇好所需的溫度之后，冷凍切片機可自動調控到位，并在這個切片過程中維持所設溫度。但如果操作不當，會引起樣品和刀的溫度過多的波動，嚴重時還會影響切片的質量，使切片厚薄不均勻等。避免的辦法是嚴格按照程序操作，以及切片時所用工具都要在液氮中預冷。選擇切片的厚度和速度：選擇切片的厚度和速度：切