1、2 一類由細胞分泌，具有多種功能的高活性小分子一類由細胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調節和多種生理病理過程等。蛋白，參與免疫調節和多種生理病理過程等。 v白細胞介素白細胞介素(interleukin, IL)v干擾素干擾素(interferon, IFN)v腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)v集落刺激因子集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)v生長因子生長因子(growth factor, GF)v趨化因子趨化因子(chemokine)3優點：優點：敏感、可靠；敏感、可靠；缺點：缺點：需長期飼

2、養細需長期飼養細胞、檢測耗時長、步胞、檢測耗時長、步驟繁雜。驟繁雜。1不同的不同的CK具有不同的具有不同的生物學活性，選擇生物學活性，選擇CK獨特的生物學活性，即獨特的生物學活性，即可檢測。可檢測。細胞增殖細胞增殖/抑制實驗抑制實驗細胞病變抑制實驗細胞病變抑制實驗細胞毒實驗細胞毒實驗細胞趨化實驗細胞趨化實驗生物學檢測法生物學檢測法2利用抗體對抗原表位的利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性識別，測定的是可溶性細胞因子的抗原性。細胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。免疫學檢測法免疫學檢測法優點：優點：方便、迅速方便、迅速缺點：缺點：價格昂貴，結價格昂貴，結果僅代表果僅代表CK

3、的量而非的量而非活性，敏感性較低?；钚裕舾行暂^低。3利用基因探針，檢測特利用基因探針，檢測特定細胞因子基因表達，定細胞因子基因表達，即即mRNA水平。水平。斑點雜交斑點雜交Northern印跡印跡細胞和組織原位雜交細胞和組織原位雜交RT-PCR。分子生物學檢測法分子生物學檢測法局限性：局限性：僅能檢測基因表僅能檢測基因表達情況，不能直接提供有達情況，不能直接提供有關細胞因子的濃度和活性，關細胞因子的濃度和活性，只用于機制探討。只用于機制探討。4待檢樣品待檢樣品( (細胞上清細胞上清) ) 指示細胞（指示細胞（CTLL-2CTLL-2）IL-2IL-2依賴細胞系依賴細胞系按不同稀按不同稀釋度加

4、入釋度加入3737C C，16-2016-20小時小時加入加入3 3HTdRHTdR（1-51-5 CiCi）3737C C，4-64-6小時小時收集細胞收集細胞測定測定5待檢樣品（細胞上清）待檢樣品（細胞上清） IFN-IFN- 指示細胞（指示細胞（wishwish）按不同稀按不同稀釋度加入釋度加入3737C C，4 4小時小時3737C C，24-4824-48小時小時棄取上清，加入棄取上清，加入VSVVSV( (水泡性口炎病毒水泡性口炎病毒) )觀察細胞病變（鏡檢或比色）觀察細胞病變（鏡檢或比色）6Using CFSE to track CML progenitor proliferat

5、ionSDMSDM + Glivec7Calculation of Proliferative Index (P.I.)CFSE -4 3 2 1 0The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells.It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing d

6、ifferent treatments.8Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)9Chromium-51 (51Cr) release assays 10計數受趨化細胞計數受趨化細胞趨化因子趨化因子細胞細胞趨化實驗示意圖趨化實驗示意圖微孔微孔濾膜濾膜11 用示蹤物質標記抗體或抗原，使其與相應的用示蹤物質標記抗體或抗原，使其與相應的抗原或抗體反應，使微量的、不可見的反應成為抗原或抗體反應，使微量的、不可見的反應成為可見的或可測定的?？梢姷幕蚩蓽y定的。免疫標記技術免疫標記技術12 高通量細胞因子檢測高通量細胞因子檢測vCBA (Cytom

7、etric Bead Array)是一種微珠多是一種微珠多用途檢測分析技術，它由一系列的微珠組合用途檢測分析技術，它由一系列的微珠組合來捕獲并結合流式細胞儀技術檢測細胞培養來捕獲并結合流式細胞儀技術檢測細胞培養液、液、EDTAEDTA血漿、血清樣本中被檢測物質的量。血漿、血清樣本中被檢測物質的量。其采用夾心法分析策略，與傳統的其采用夾心法分析策略，與傳統的ELISAELISA分分析技術相比，此方法可以同時檢測多項指標。析技術相比，此方法可以同時檢測多項指標。用已知的標準品和對照標準曲線就可以得出用已知的標準品和對照標準曲線就可以得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的被測樣本的濃度。此分析方

8、法不受樣本量的限制，而且可以得到一個樣本的多個數據。限制，而且可以得到一個樣本的多個數據。13Cytokine network141516CBA原理示意圖原理示意圖1718v Lab Invest 2003, 83:11311146 cytokine bead arrays(CBA)19ELISPOT(酶聯免疫斑點實驗酶聯免疫斑點實驗) )vELISPOTELISPOT技術利用結合在固相載體上的抗細胞因子技術利用結合在固相載體上的抗細胞因子的特異性抗體，在分泌細胞周圍直接撲獲待檢細胞的特異性抗體，在分泌細胞周圍直接撲獲待檢細胞因子。實驗中每個斑點（因子。實驗中每個斑點（spotspot）是激活

9、的淋巴細胞）是激活的淋巴細胞分泌的細胞因子區域，代表一個活性淋巴細胞。它分泌的細胞因子區域，代表一個活性淋巴細胞。它可在單細胞水平檢測淋巴細胞對特異性抗原的反應可在單細胞水平檢測淋巴細胞對特異性抗原的反應能力。能力。v優點：優點：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測技術。靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測技術?？蓹z測到百萬分之一陽性細胞率可檢測到百萬分之一陽性細胞率; ; 單細胞水平、活單細胞水平、活細胞功能檢測細胞功能檢測; ; 操作簡便，可進行高通量篩選。操作簡便，可進行高通量篩選。1.特異性單抗包被在培養板孔底部；特異性單抗包被在培養板孔底部；2.封閉能結合單抗的其他部位；封閉能結合單抗的其他

10、部位；3.加入細胞及刺激物培養，陽性細胞加入細胞及刺激物培養，陽性細胞分泌的細胞因子被單抗捕獲；分泌的細胞因子被單抗捕獲；4.移出細胞，洗滌；移出細胞，洗滌；5.加入生物素標記的二抗；加入生物素標記的二抗；6.加入酶標鏈霉親和素；加入酶標鏈霉親和素；7.加入顯色底物，在酶的催化分解下，加入顯色底物，在酶的催化分解下，產生不可溶的色素，就近沉淀在局產生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點；部的膜上形成斑點；8.斑點計數（可人工計數，也可用自斑點計數（可人工計數，也可用自動讀板儀計數），數據處理，結果動讀板儀計數），數據處理，結果分析。分析。ELISPOT2122應應 用用v 移植研究移植研

11、究-allograft rejection -allograft rejection v 疫苗開發疫苗開發- -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響 v Th0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2細胞轉換分析細胞轉換分析 v 自體免疫研究自體免疫研究- -免疫調節及免疫治療研究免疫調節及免疫治療研究 v 癌癥研究癌癥研究- -腫瘤反應腫瘤反應T T細胞作用細胞作用 v 過敏機制探討過敏機制探討-IL-4-IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉換，其它參誘導免疫球蛋白亞型轉換，其它參與過敏機制之細胞因子的研究與過敏機制之細胞因子的研究 v 傳染疾病研究傳染疾病研究

12、-Lyme disease, Chlamydia infections, -Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, sclerosis, 等等 MediumPHAPeptide 1Peptide 21Peptide 47GzBHIV- peptide recall patient BIFN- HIV-peptide

13、specific recall response shows dissociated production of IFN- and GzBKleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-39224ELISPOT 和和 ELISA的區別的區別ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破傳統，又突破傳統 ELISA ELISA 法，是定量法，是定量 ELISA ELISA 技術的延伸和新的發展，它們最大的不同技術的延伸和新的發展，它們最大的不同: : 1.ELISA 1.ELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可通過顯

14、色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量溶性蛋白總量( (整體水平整體水平);ELISPOT);ELISPOT也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過斑點或通過ELISPOTELISPOT分析系統對斑點進行計數，分析系統對斑點進行計數，1 1個斑點代表個斑點代表1 1個細胞，從個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率（而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率（單細胞水平單細胞水平）；）；2.ELISPOT2.ELISP

15、OT比比ELISAELISA更敏感。更敏感。ELISPOTELISPOT技術應用領域：自身免疫診斷和預后分析、器官技術應用領域：自身免疫診斷和預后分析、器官移植后排斥反應的預測、過敏性疾病脫敏治療的監測、疫移植后排斥反應的預測、過敏性疾病脫敏治療的監測、疫苗和藥品的研發與檢測等。苗和藥品的研發與檢測等。25胞內細胞因子的檢測胞內細胞因子的檢測LPS活化單核細胞內活化單核細胞內TNF-的測定的測定R1：淋巴細胞；：淋巴細胞；R2：單核細胞：單核細胞26TNF- 的誘生和檢測的誘生和檢測v主要由主要由單核單核/ /巨噬細胞巨噬細胞及其他多種細胞產生，能及其他多種細胞產生，能使殺傷腫瘤細胞使殺傷腫瘤細胞; ;vTHP-1THP-1( (人單核細胞系人單核細胞系) )在在LPSLPS( (脂多糖脂多糖) )刺激下可刺激下可分泌分泌TNF-TNF- ; ;vL929L929( (小鼠成纖維細胞小鼠成纖維細胞) )可被可被THP-1THP-1分泌的分泌的TNF-TNF- 殺傷，且細胞的死亡率與殺傷，且細胞的死亡率與TNF-TNF- 活性成正比活性成正比; ;v四甲基偶氮唑鹽四甲基偶氮唑鹽( (MTTMTT) )在活細胞線粒體的琥珀酸在活細