1、 質量管理 ZLJGF-046-00 共12頁 第12頁湖南湘大獸藥有限公司工作標準文件題 目非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法標準操作規程編 號ZLJGF-046-00修 定質檢部審 核批 準修定日期2016.12審核日期批準日期頒發部門GMP辦公室頒發數量2 份生效日期分發部門質檢部、檔案室文件頁數共11頁一、目的：為規定非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法的檢測方法和操作要求，特制定本操作規程。二、引用標準：中華人民共和國獸藥典（2015年版 一部 附錄P179）。三、適用范圍：適用于本公司檢品采用非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法的質量檢測。四、責任者：理化分析員對本標準的實

2、施負責。五、正文：1簡述：微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規定的微生物限度標準時，應按下述規定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。微生物計數試驗環境應符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期進行監測。如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性

3、以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。2.計數方法計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法（Most-Probable-Number Method，簡稱MPN 法）。MPN 法用于微生物計數時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。供試品檢查時,應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數方法，檢測的樣品量應能保證所獲得的試驗結果能夠判斷供試品是否符合規定。所選方法的適用性須經確認。3.計數培養基適用性檢查和供試品計數方法適用性試驗供試品微生物計數中所使用的培養基應進行適用性檢查。供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該

4、產品的微生物計數。若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，計數方法應重新進行適用性試驗。表 1 試驗菌液的制備和使用試驗菌株試驗菌液的制備計數培養基適用性檢查計數方法適用性試驗需氧菌總數計數霉菌和酵母菌總數計數需氧菌總數計數霉菌和酵母菌總數計數金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003)胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30 35，培養時間1824 小時胰酪大豆胨瓊脂培養基和胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30 35，培養時間不超過3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基 （ MPN法），培養溫度

5、30 35，培養時間不超過3 天，接種量不大于100cfu銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） CMCC（B）10 104胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30 35，培養時間1824 小時胰酪大豆胨瓊脂培養基和胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30 35，培養時間不超過3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基 （ MPN法），培養溫度30 35，培養時間不超過3 天，接種量不大于100cfu枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B) 63 501胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度3

6、0 35，培養時間1824 小時胰酪大豆胨瓊脂培養基和胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30 35，培養時間不超過3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基 （ MPN法），培養溫度30 35，培養時間不超過3 天，接種量不大于100cfu白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養基或沙氏葡萄糖液體培養基，培養溫度20 25，培養時間23天胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養溫度30 35，培養時間不超過5 天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度 2025，培養時間不超過5 天，接種量不大于100cfu胰酪

7、大豆胨瓊脂培養基（ MPN 法不適用），培養溫度3035，培養時間不超過5 天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度 2025，培養時間不超過5 天，接種量不大于100cfu黑曲霉(Aspergillusniger)CMCC(F) 98 003沙氏葡萄糖瓊脂培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度2025，培養時間57天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養溫度30 35，培養時間不超過5天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度 2025，培養時間不超過5天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養基（ MPN 法不適用），培養溫度3035，培養

8、時間不超過5天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度 2025，培養時間不超過5天，接種量不大于100cfu注：當需用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌和酵母菌總數時，應進行培養基適用性檢查，檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養基。3.1.菌種及菌液制備3.1.1菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。計數培養基適用性檢查和計數方法適用性試驗用菌株見表1。3.1.2菌液制備 按表1 規定程序培養各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用pH7.0

9、無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養物加入35ml 含0.05聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時內使用；若保存在28，可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內使用。3.1.3 陰性對照為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗， 陰性對照試驗應無菌生長。如陰性

10、對照有菌生長，應進行偏差調查。3.1.4 培養基適用性檢查微生物計數用的成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基適用性檢查。按表1規定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養基管或胰酪大豆胨瓊脂培養基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板，置表1 規定條件下培養。每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值應在0.5-2 范圍內，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致；被檢液體培養基管與對照培養基管比較，試驗菌應生長良好。3.2計數方法適用性試驗3.2.1試液制備根

11、據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45。供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經確認均不適用，應建立其他適宜的方法。3.2.1.1水溶性供試品 取供試品，用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基溶解或稀釋制成1:10 供試液。若需要，調節供試液pH 值至68。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。3.2.1.2 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用pH7.

12、0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基制備成1:10 供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調節供試液pH 值至68。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10 倍系列稀釋。3.1.2.3 油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80 或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40（特殊情況下，最多不超過45），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的稀釋液使成110 供試液，保溫，混合，并在最短時間內形成

13、乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10 倍系列稀釋。3.1.2.4 需用特殊方法制備供試液的供試品腸溶及結腸溶制劑供試品 取供試品，加入pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑），置45水浴中,振搖,使溶解,制成110 的供試液。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10 倍系列稀釋。氣霧劑、噴霧劑供試品 取供試品,置-20或其它適宜溫度冷凍約1 小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。供試品亦可采用其它適宜的方法取出。用無菌注射器從每一容器中吸出全部藥液

14、于無菌容器中混合，然后取樣檢查。3.2 接種和稀釋按下列要求進行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。3.2.1 試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。3.2.2 供試品對照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。3.2.3 菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因導致

15、無法選擇最低稀釋級的供試液進行方法適用性試驗時，應采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適用性試驗。3.3 菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規定的方法進行微生物計數。若試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值小于菌液對照組菌落數值的 50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。3.3.1 增加稀釋液或培養基體積。3.3.2 加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應設

16、中和劑或滅活劑對照組，即取相應量稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數的比值應在0.52范圍內。表2 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑 亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對羥基苯甲酸、雙胍類化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對羥基苯甲酸聚山梨醇酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA、喹喏酮類抗生素鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸-內酰胺類抗生素-內酰胺酶3.3.3 用薄膜過濾法。3.3.4上述幾種方法的聯合使用。若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特

17、定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該試驗菌具有較強抗菌活性，同時也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢查。3.4 試品中微生物的回收表1所列的計數方法適用性試驗用的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN 法。3.4.1 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1 中每株

18、試驗菌每種培養基至少制備2 個平皿，以算術均值作為計數結果。3.4.1.1 傾注法 取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中, 注入1520ml 溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。若使用直徑較大的平皿，培養基的用量應相應增加。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。3.4.1.2 涂布法 取1520ml 溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，注入直徑90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養基表面

19、干燥。若使用直徑較大的平皿，培養基用量也應相應增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。3.4.2 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。供試品及其溶劑應不影響濾膜材質對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應充分干燥

20、。為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述 “供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當于1g、1ml 或10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌數較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上；若測定霉菌和酵母總數，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上。按表1 規定

21、條件培養、計數。每株試驗菌每種培養基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。3.4.3 MPN 法 MPN 法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數法，僅在供試品需氧菌總數沒有適宜計數方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數。若使用MPN 法，按下列步驟進行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3 個連續稀釋級，每一稀釋級取3 份1ml 分別接種至3 管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養基中，同法測定菌液對照組菌數。必要時可在培養基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035培養3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的

22、原因使得結果難以判斷，可將該管培養物轉種至胰酪大豆胨液體培養基或胰酪大豆胨瓊脂培養基，在相同條件下培養12 天，觀察是否有微生物生長。根據微生物生長的管數從表3 查被測供試品每1g 或每1ml 中需氧菌總數的最可能數。表3 微生物最可能數檢索表生長管數需氧菌總數最可能數95%置信限每管含樣品的g或ml數MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000 309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.3201111143512011435121155

23、38130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100注：表內所列檢驗量如改用1g（或ml）、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）時，表內

24、數字應相應降低10 倍；如改用0.01 g（或ml）、0.001 g（或ml）和0.0001 g（或ml）時，表內數字應相應增加10 倍，其余類推。3.5 結果判斷計數方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.52 范圍內；采用MPN法時，試驗組菌數應在菌液對照組菌數的95%置信限內。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。方法適用性確認時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。4

25、 供試品檢查4.1 檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）。一般應隨機抽取不少于 2 個最小包裝的供試品，混合，取規定量供試品進行檢驗。除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。4.2 供試品的檢查按計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基用于測定需氧菌總數；沙氏葡萄糖瓊脂培養基用于測定霉菌和酵母菌總數。4.3 陰性對照試驗 以稀

26、釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。4.3.1 平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規定外，取規定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數測定，每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。4.3.1.2培養和計數 除另有規定外，胰酪大豆胨瓊脂培養基平板在3035培養35 天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板在2025培養57 天，觀察菌落生長情況,點計平板上生長的所有菌落數，計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落數平均值不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1 倍或以上。4.3.1.3菌數報告規則 需氧菌總數測定宜選取平均菌落數小于300cfu 的稀釋級、霉菌和酵母菌總數測定宜選取平均菌落數小于100cfu 的稀釋級，作為菌數報告的依據。取最高的平均菌落數，計算1g、1ml 或10cm2供試品中所含的微生物數，取兩位有效數字報告。如各稀釋級的平板