1、質粒的鑒定、提取與純化一、菌落 PCR 法快速鑒定陽性克隆1、菌落 PCR 引物的設計、 為了最大程度避免菌落 PCR 出現假陽性結果, 原則上應將引物的一端設計在載體上, 另一端設計在插入片段上,長度 25堿基足矣;、 為減少非特異性片段的產生, 同時保證兩步法能夠有效擴增出目的片段, 建議將引 物的 Tm 值設計在 62-68之間;、引物設計時請適當考慮通用性,如插入片段為 RxR ,則可將引物設計在 DBD 區,相 比之下,對這一區域做缺失研究的人較少,載體以 PGL3系列載體為例,可將引物設計在熒 光素酶的基因序列上,保證對 PGL3-Basic 、 Promoter 和 Enhanc

2、er 均有效;、目的片段長度在 500 bp以上較為合適,一方面可以檢測兩段引物之間的序列是否 出現缺失或插入,另一方面跑膠時條帶也比較明顯(堿基數越多則結合的染料越多 。2、菌落 PCR 步驟、牙簽挑取單菌落后,浸泡于 200 µL無抗 LB 培養基中,旋渦混勻 5-10 s,使菌體 在培養基中均勻分布;注:挑選單菌落時請挑個頭中等,不大不小的菌落,這樣的菌落呈陽性的概率較高。一般情況 下,含有空載體的菌生長較快,故菌落大,不宜挑取,菌落太小則無法區分是空載體菌落還是還有目 的片段的菌落,亦不可取。此為經驗之談,具體原因不明。、吸取 1 µL菌液作為模板,進行 15 &#

3、181;L體系的兩步法 PCR (68延伸, 98解鏈 , 剩余菌液 4存放備用;注:預變性(94時間應延長至 10 min,使菌體破裂。目標片段為 1000 bp左右時, 20循環 已足夠,若目標片段為 500 bp 左右,則建議進行 25循環。菌液(尤其是 DH5在接種前不可進行 振蕩培養,否則容易導致小搖失敗(不長菌 ,經驗之談,原因不明。、 PCR 產物鑒定:方法一(推薦 :取 PCR 產物(10 µL左右 ,加 Loading Buffer后跑膠鑒定, 凡沒有特異性條帶或泳道中明顯的條帶不止 1條的, 均可判定為陰性菌落, 棄 之。方法二(不太推薦,趕時間的話可以試試 :在

4、 PCR 產物(10 µL左右中直接加入用 TAE 按 1/10稀釋后的“ UltraPower ”熒光染料 1 µL,混勻后等待 30 s,之后于 365 nm紫 外燈下觀察顏色變化, 溶液呈濃綠色的可認定為陽性菌落 (即 PCR 能夠擴增出產物, 但是不 是特異不好說,根據以往經驗,該法產生假陽性的概率 <10% ;、將陽性菌落所對應的菌液轉接于 20 mL 含抗培養基中,培養 15-16小時,保種后提 取質粒(如有必要,可送測序 。二、質粒的提取與內毒素的去除1、小提試劑盒提取質粒、取菌液 16 mL ,平均分到 4個離心管,離心后收集菌體,按小提試劑盒的說明書

5、操 作,提取質粒;注:16 mL菌液裂解后,以兩個吸附柱吸附即可(理論上可吸附 80 µg 質粒 ,使用更多的吸附 柱不會提高回收率(經驗 。另外,菌液多不代表質粒就提得多, 16 mL 與 20 mL ,在相同的裂解體系 下,其質粒提取總量相差不會超過 10%(經驗 。因此,使用過多的菌液除了增加產物中內毒素的含 量外,無實際意義。、最后一步洗脫時,建議每個吸附柱加洗脫液(水或 TE 100 µL ,洗脫一次后,再 將洗脫液吸回吸附柱中,重復洗脫一次,一般情況下可提高洗脫率 20%左右,同時建議暫時 保留吸附柱, 待檢測質粒含量后再決定是否進行第三次重復洗脫。 若菌體長勢

6、良好, 該步驟 可獲得質粒約 60-75 µg 。注:采用更多地洗脫液有助于提高回收率, 但過大的溶液體積將導致后續步驟 (異丙醇沉淀 DNA 中質粒的損失,故建議洗脫液用量為每柱 100-125 µL 。2、內毒素去除、取質粒溶液,加入 0.125倍體積的 3 mol/L乙酸鈉溶液(pH5.0 ,置于冰上預冷 5 min ;、 向預冷的溶液中添加 0.125倍體積的去內毒素試劑 (Endotoxin-Be-Gone , 混勻后 在冰上靜置 10 min;、將溶液轉移到 65水浴鍋中,放置 0.5-1 min,此時可見溶液變渾濁;、取出渾濁液于 12000 rpm下離心 2

7、 min,轉移上清液;注:天冷時,、兩步的間隔時間要短,動作要快,否則內毒素去除試劑將無法通過離心去 除。此外,室溫在 25以上時,內毒素去除效果較好,步驟 -做兩次即可,室溫較低時,應做三 次,以保證內毒素去除率。3、質粒回收方法一(沉淀法 :、 內毒素去除后,加入 1倍體積的異丙醇,于 12000 rpm 離心 20 min 左右(可在室溫下進行 或加入 2倍體積的無水乙醇,于 12000 rpm 冷凍 離心 20 min 左右,即可在離心管底部看見 DNA 沉淀; 、 若采用異丙醇沉淀,則用 75%乙醇清洗沉淀 2次(12000 rpm,離心 5 min除鹽;若采用 乙醇沉淀,則清洗 1次足夠;、 棄去上清液,空干乙醇,溶解質粒。方法二(吸附法 :內毒素去除后,加入 0.4倍體積的 3