1、水中藻類檢測的方法姓名：田家宇 專業：市政工程 學號：04s027026本文主要從以下三個方面闡述了水中藻類檢測的方法：1. 藻類檢測和計數新方法置式顯微鏡法；2. 改進的水中藻類檢測方法；3.藻類葉綠素及其降解產物的測定方法。一、藻類檢測和計數新方法置式顯微鏡法由于環境污染，一些湖泊富營養化程度不斷加劇，導致水中藻類的快速增長。大量藻類的存在，直接影響了自來水的生產和供應。為了了解藻類對水廠各工藝環節的影響，以湖泊水為水源的許多水廠都相繼開展了藻類計數檢測項目。國內普遍采用的方法是將1L水樣加魯戈試劑固定在一個容器中，自然沉降24h后，利用虹吸的方法吸去上清液，并濃縮定容到3050mL，然后

2、取1mL放入血球計數板，在正置式顯微鏡下進行鏡檢計數1。此方法由于所需的水樣較多（1L），在需要采集多個水樣時，采集和運送的工作量大;在沉樣時還要多次沖洗轉移，增加了產生誤差的機會，而且操作不便。昆明自來水總公司的水源之一是富化程度較高的滇池水，因而昆明水司較早開展了此項目，并得到了瑞士蘇黎世供水局的技術支持和大力幫助。我們所采用的藻類計數方法的特點是使用倒置式顯微鏡，藻樣通過沉樣板一步沉降到位，與國內普遍采用的方法相比具有準確快捷，水樣用量少，運送方便，無須多次沖洗轉移，操作簡單等優點，適用于生產和科研檢測。1.用品準備（1）沉樣板。由一個長12cm，寬4.1cm,中央有圓形凹槽（底面積為5

3、cm2）的長方形有機玻璃板和一個可滑動的、底部與凹槽形狀完全吻合的空心圓筒（容積為25mL）以及一塊圓形蓋玻片組成（見圖1），有機玻璃板的左側有一小孔，用于放掉上清液。（2）倒置式顯微鏡。與普通倒置式顯微鏡不同的是，它的載物臺經簡單改造，增加了一個長方形的金屬框，大小恰好可放置沉樣板。金屬框的作用是將沉樣板固定在載物臺上，使沉樣板可與載物臺同步移動，避免沉樣板發生偏移。兩個目鏡，一個裝有微型刻度尺，可直接測量藻類的大小和長度，另一個裝有“ ”形標尺，在訐數時用它界定訐數范圍。（3）250mL試劑瓶。用于盛裝水樣。（4）移液管（125mL）。2.藥品準備魯戈試劑（Lugols Solution）

4、;福爾馬林（40%）;灑精（50）。3.方法與步驟3.1取樣先在250mL試劑中加入67滴魯戈劑，再加入200mL，左右水樣，搖勻。如果水樣需保存較長時間，可加入適量福爾馬林（40）。3.2沉降用移液管取適量水樣加入沉樣板，再加入蒸餾水至滿，加蓋圓玻片，靜沉24h。取多少水樣，同藻類的多寡而定，藻類數量多可少取，數量少可多取，一般水樣體積在125mL之間。3.3計數將沉樣板上的圓筒用蓋玻片推開，放掉上清液，置于顯微鏡上，以目鏡上的“工工”形標尺為界線，隨機選取若干條帶計數。一般情況是這樣計數的；在10×16倍鏡頭下，計數全部視野（1cm2）內的大型藻類。在×25的倍鏡下，隨

5、機選取5條帶，計數基中的中型藻類。在10×40倍的鏡頭下，隨機選取1條帶，計數其中的微型藻類。在實際運用中，可根據當地的原水藻類情況，確定所選取的條帶數。3.4計算N=式中N 1mL; 5沉樣板板底部圓形凹槽的底面積，cm2;S每個計數條帶的面積，cm2;A選取的條帶數；V水樣體積；mL;N實際數的A個條帶的藻類個數。將上述三個放大倍數下計數得的藻類依上式分別計算，再相加，即得到藻類總數。3.5清洗計數完畢，用蒸留水沖洗沉樣板，浸泡于50的酒精中過認，再次用蒸留水沖洗后，晾干待用。4.注意事項（1）沉樣前，要將水樣搖勻（2）將沉樣板的圓筒推開時，要防止產生氣泡。（3）將沉樣板置于顯微

6、鏡上時，要盡量保持平衡，避免藻類向一側傾斜。（4）在選取計條帶時，既要注意隨機性，又要注意均勻性。5.實際樣品檢測取某水廠原水用上述方法（簡稱倒置法）和國內普遍采用的傳統方法（簡稱正置法）分別進行藻類檢測和計數，結果見表1。由表1可見，倒置法水樣用量少，并有較高的精密度；正置法水樣用量多，精密度較低，而且由于正置法使用的血球計數的容積所限（0.1m3），出現在計數框內的藻類種類也有限，如果需要分類計數，有一定局限性，不好操作。倒置法可以一邊分類鑒定，一邊分類計數，水樣中存在的種類在1cm2的計數范圍內基本都能看到，分類鑒定和計數的結果比較全面，操作也方便。另外，倒置法將水樣一步沉降到位，省略了

7、許多中間環節，減少了多次沖洗 轉移帶來的操作誤差，從而提高了準確度。6結論利用倒置式顯微鏡進行藻類檢測和計數的方法，比使用正置式顯微鏡的血球計數板法水樣用量少，中間環節少，準確快捷，精密度較高，在分類鑒定和計數時，操作較為方便。但該方法使用的沉樣板國內尚無廠家生產，需要從國外購買。二、改進的水中藻類檢測方法水中藻類傳統的測定方法是將一定量的水樣加魯哥試劑因定，在筒型分液漏斗中進行自然沉淀，48h后，借助虹吸方法吸去上層清液，按要求濃縮定容到3050ml，然后在鏡下計數，由于固定沉降時間較長，檢測結果常滯后于生產和研究，影響了及時分析和解決問題。為了解決這一問題，下文對傳統的檢測蚊法中的沉淀濃縮

8、進行了改進，摸索出一種快速測定藻類的方法，測定時間縮至當天即可出結果，而且準確、可靠，適用于生產和科研檢測。1測定原理利用測大腸菌的抽濾裝置，對檢測水樣進行抽濾，藻類被截留在濾膜（0.350.65m）上，利用濾膜對藻細胞的吸附力并不強，用少量純水在HJ-3型電磁攪拌器上萃取4、5次就能將全部的藻細胞洗回水中。濾膜的主要成分是硝化纖維素（CN）,可深于丙酮，而丙酮對藻細胞形狀基本沒影響，當濾膜遇到丙酮后會變成透明膠液，不影響鏡下觀察檢測。由于丙酮易揮發，濾膜變干會恢復原型，為了保證藻細胞和濾膜的濕度，考慮到丙酮和甘油的相容性，甘油的吸潮性及本身的油脂性，能使藻細胞和濾膜在較長的時間內保持濕潤透明

9、，因此，在丙酮溶劑中加了一定比例的甘油，但甘油太多，會影響濾膜的溶解。2.實驗方法2.1抽濾萃取法取適量水樣，按100：1的量加魯哥試劑固定，在裝有濾膜的抽濾器上進行抽濾。取下濾膜，放到100ml的小燒杯里，有藻細胞的一面朝上，加58ml純水；調好電磁攪拌器轉速，使液體攪拌時不會向上濺出，將小燒杯放到攪拌器上轉1mim左右，取洗液。加入純水58ml純水；重復上步聚；振洗5次，定空洗液至50ml，在顯微鏡下記數，計算公工：N=(A/Ac)×（Vs/V·Va）×n式中，N為每升原水樣中的浮游植物數量（個·J-1）；A為計數框的體積（ml）；n為計數所得藻類數

10、目（個）。2.2驗證法將上述實驗洗凈后的濾膜放入一平面皿，在空調下或熱源邊（不要超過40）使濾膜稍干燥，將濾膜放一載玻片上，加二至四滴濾膜透明液，使膜完全溶解成透明膠液，蓋上蓋玻片，在CHK型顯微鏡下觀察。此方法也可用來驗證傳統沉淀法中的棄液藻細胞流失情況。3 結果及分析 取已知數量的小球藻9.643×105·1-1，按上述方法進行回收實驗，結果見表1，兩種方法在實際水樣中的應用結果如表2所示。傳統沉淀方法精確度低，平行樣相對偏關在+15；測試時間較長，根據理論推算，最小的藻為沉時間需要60 ，我們實驗靜置學時間為43H,常有一些較小的藻細胞隨棄液流失，而且在南方地區氣溫較

11、高，藻細胞大都偏小，易發生流失現象，流失達30以上。抽濾萃取法能較好地阻止藻細胞流失，但由于濾敢太小，一般只能抽濾濁度10NTU以下的水，對于源水最多只能抽濾200ML左右的水量，太多則濾孔就會被堵 而難以達到抽濾效果，所以存在取水量較少，影響代表性，如有條件，濾膜孔徑可取在1.51.8M,對于低濁度的出廠水和濾后水，則不存在這個問題，可抽濾200300ml水量，而且能準確地反映水中殘存藻細胞的數量。傳統的沉淀方法中由于染色時間較長，藻細胞和雜質均被染成褐色，在鏡下觀察時，影響藻細胞的分 而抽濾萃取則沒有這種問題，因為藻細胞還保存著很好的原本色澤（絕大多數為綠色）和形狀，較容易與水中的細菌、真

12、菌以及低等浮游動物、顆粒、纖維等區分開來。三、藻類葉綠素及其降解產物的測定方法下文綜述了用分光光度法,熒光檢測法及高效液相色譜法測定藻類葉綠素及其降解產物的方法. 分別詳細介紹了各種方法的設備,程序,計算公式及特點.。此外,還介紹了藻類類胡蘿卜素的高效液相色譜測定方法。 按測定方法分為六個部分：(1) 葉綠素a , b 和c 的分光光度法測定(三色法) ; (2) 葉綠素a 的熒光檢測法; (3) 存在脫鎂葉綠素a 時葉綠素a 的分光光度法測定; (4) 存在脫鎂葉綠素a 時葉綠素a 的熒光法測定; (5) 高效液相色譜(HPLC) 測定藻類的葉綠素及它們的降解產物; (6) HPLC 測定藻

13、類葉綠素及類胡蘿卜素。藻類的特異性色素是葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素. 浮游藻類里常見的三種葉綠素是葉綠素a ,b 和c.葉綠素a 在一切浮游藻類里大約占有機物干重的12 % ,是估計藻類生物量的好指標. 細胞的葉綠素含量隨種類或類群而有所不同,同時還受年齡、生長率、光和營養條件的影響.脫鎂葉綠素a (一種葉綠素a 的普通降解產物) 能夠干擾葉綠素a 的測定,因為如果存在脫鎂葉綠素a ,它能在葉綠素a 的相同光譜區吸收光和熒光,造成葉綠素a 值的誤差. 當測定葉綠素a 的時候還要測定脫鎂葉綠素a. 葉綠素a 和脫鎂葉綠素a 之比可作為浮游植物生理條件的一個良好指標.下文綜述了用分光光度法,熒光檢測

14、法及高效液相色譜法測定藻類葉綠素及其降解產物的方法：(1) 葉綠素a , b 和c 的分光光度法測定(三色法) ;(2) 葉綠素a 的熒光檢測法; (3) 存在脫鎂葉綠素a時,葉綠素a 的分光光度法測定; (4) 存在脫鎂葉綠素a 時葉綠素a 的熒光法測定; (5) 高效液相色譜測定藻類的葉綠素及它們的降解產物; (6) HPLC 測定藻類葉綠素及類胡蘿卜素.1 葉綠素a , b 和c 的分光光度法測定(三色法)用丙酮水溶液自浮游生物濃縮樣萃取色素,用分光光度計測定萃取物的吸光度. 葉綠素自細胞內提出的難度,不同藻類差異相當大. 為了將色素完全萃出,通常需要用組織研磨器機械的破壞細胞.111

15、儀器和試劑(1) 分光光度計:用窄帶的(015210nm) .(2) 1cm ,4cm 和10cm 光程的比色池.(3) 醫用離心機.(4) 組織研磨器(最好使用圓底的研磨管和搗桿) .(5) 離心管:15ml ,有刻度和螺帽.(6) 過濾設備:過濾器,濾膜(0145m 孔徑,47mm 直徑) 或玻璃纖維過濾器(GFPC 或GFPA ,415cm 直徑) ,真空泵.(7)MgCO3 懸浮液:在100ml 蒸餾水中加入110g 細粉末MgCO3 .(8) 90 %(體積比) 丙酮水溶液.112 測定程序(1) 離心或過濾濃縮水樣. 在離心前或過濾的最后一步加入012ml MgCO3 懸浮液.(2

16、) 把樣品置入組織研磨器,用23ml 90 %丙酮水溶液覆蓋浸泡.(3) 把樣品移入一個有螺帽的離心管,用幾毫升90 %丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液中,用90 %丙酮水溶液調節體積到510ml .(4) 在蓋緊的離心管中于500g 離心20min 澄清萃取液,把澄清的萃取液傾入一支清潔的,標定過的15ml 有螺帽的離心管并測定萃取液的總體積.(5) 把萃取液移入1cm 的比色池,在750、663、645 和630nm 測定吸光度(OD) .113 計算葉綠素a ,b 和c 的測定分別使用663、645 和630nm 的吸光度. 750 nm 的讀數用來校正渾濁度. 將每個色素的OD

17、 值中減去這個渾濁度校正值后,帶入下列公式計算濃度:(1) 葉綠素a (mgPl) = 11164 (OD663 ) - 2116 (OD645 ) + 0110 (OD630 )葉綠素b (mgPl) = 20197 (OD645 ) - 3194 (OD663 ) - 3166 (OD630 )葉綠素c (mgPl ) = 54122 (OD630 ) - 14118 (OD645 ) - 5153 (OD663 )(2) 各單位體積色素量的計算如下:葉綠素a (mgPm3 ) = 葉綠素a (mgPl ) ×萃取液的總體積(l) / 水樣體積(m3 )2 葉綠素a 的熒光檢測法

18、葉綠素a 的熒光檢測法比分光光度法靈敏,需樣品較少. 而且不要求像分光光度法那樣的波長分辨率,在430nm 的激發波長和在663nm 的發射波長抽取在試管內測定葉綠素a 可過的最佳靈感度.211 儀器和試劑(1) 熒光計,備有高強度F4 T. 5 藍光燈,光電倍增管R - 136 (紅敏) ,可滑動窗孔,光發射(CS - 2 - 64)和光激發(CS - 5 - 60) 濾光片,以及一個高靈敏度門.(2) 其他設備和試劑同111212 測定程序(1) 用已知濃度的葉綠素溶液標定熒光計:用分光光度法測定濃度約為2、6、20 和60gPl 的葉綠素a 萃取液,再在每一靈敏度位置對每一溶液進行讀數,

19、導出標定系數FsFs = CaPRs式中Fs 靈敏度位置S 的標定系數Rs 靈敏度位置S 的熒光計讀數Ca 分光光度法測定的葉綠素a 濃度(gPl)(2) 在能夠取得適中讀數的各靈敏度位置測定樣品的熒光,將讀數乘以適當的標定系數,得到葉綠素a 濃度.3 存在脫鎂葉綠素a 時葉綠素a 的分光光度法測定由于脫鎂葉綠素在接近葉綠素a 相同的波長上有吸收,因而含有脫鎂葉綠素時葉綠素a 的測定值可能偏高. 葉綠素a 由于酸化作用變成脫鎂葉綠素a ,吸收峰的值比原來大約降低40 % ,并從663nm 移至665nm ,酸化前后產生的吸收峰之比為1170 ,可用來表觀葉綠素a 的濃度作脫鎂葉綠素a 的校正.

20、311 儀器和試劑(1) 同111(2) HCl 1mol·L - 1312 測定程序(1) 用90 %丙酮水溶液萃取色素,離心澄清,在750、663nm 讀取OD 值.(2) 在1cm 的比色池中用兩滴1mol·L - 1 HCl 酸化萃取液,輕輕攪拌12min 后在750、665nm 讀取OD 值.(3) 酸化前OD663和酸化后OD665值都減去OD750值.313 計算使用校正過的值計算葉綠素a 濃度(C) 與脫鎂葉綠素a 濃度(P)C(mgPm3 ) = 26173 (663b - 665a)V1PV2LP(mgPm3 ) = 26173117 (665a) -

21、663b V1PV2L式中V1 萃取液的體積(l)V2 水樣的體積(m3 )L 比色皿液層厚度(cm)663b ,665a 分別為酸化前后90 %丙酮水溶液萃取的吸光度.26173 是吸光度校正4 存在脫鎂葉綠素a 時葉綠素a 的熒光法測定用熒光法測定脫鎂葉綠素a 的濃度,需要測定酸化前后丙酮萃取液的熒光. 葉綠素a 由于酸化后變成脫鎂葉綠素a ,致使熒光降低,利用這一原理進行測定萃取液的脫鎂葉綠素a 濃度.411 儀器和試劑(1) 同21a(2) HCl 1mol·L - 1(3) 純葉綠素a412 測定程序校準熒光計,在每一靈敏度位置測定酸化前后萃取液的熒光. 計算校準系數(Fs

22、 ) ,用酸化前的熒光讀數除以酸化后的熒光讀數,算出酸化前后的熒光比.413 計算葉綠素a (mgPm3 ) = Fs (Rb - Ra) rP(r - 1)脫鎂葉綠素a (mgPm3 ) = Fs (rRa - Rb) rP(r - 1)式中Fs 靈敏度位置S 的換算系數Rb 萃取液酸化前的熒光Ra 萃取液酸化后的熒光7 7 第1 期戴榮繼等:藻類葉綠素及其降解產物的測定方法© 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.r RbPRa5 高效液相色譜測定藻類的葉綠素及它們的降解產物5

23、11 儀器和試劑除色素提取物外還包括:(1) 高效液相色譜儀,流速為210mlPm.(2) 裝有100 微升進樣環管的高壓進樣閥.(3) 保護柱(410 3 015cm , C18 , 3m)(4) 反相HPLC 柱(C18 , 10cm , 3m)(5) 熒光檢測器,波長為430 ±30nm ,可發射超過600nm 熒光.(6) 數據紀錄裝置,長條紙記錄器或電子積分儀.(7) 注射器,玻璃,250L(8) HPLC 洗脫劑:洗脫劑A(80155 ;甲醇型試劑離子對溶液) ,洗脫劑B(8020 ;甲醇丙酮) .(9) 校準標準物:分別將1ml 純葉綠素a 和b 溶于100ml 90

24、%丙酮中,用分光光度法測定其準確濃度. 用上述葉綠素a 和b 標準物經鹽酸酸化后制得脫鎂葉綠素a + a和b + b標準物;從硅藻中萃取葉綠素c 和脫植基葉綠素a ,酸化脫植基葉綠素a 制得脫鎂葉綠素酸a ,分別用薄層色譜法(TLC) 純化,分光光度法校準,作為標準物.512 測定程序(1) 用洗脫劑A ,流速為210mlPm ,建立和平衡HPLC 系統;校準熒光計的感光度,用葉綠素a 標樣的濃度最大值作為滿刻度.(2) 通過先前制備的標準物校準HPLC 系統的工作標準. 分別混合葉綠素與脫植基葉綠素a ,脫鎂葉綠素a 和脫鎂葉綠素酸a ,作為混合標準物. 混合1ml 標準液與300L 離子對

25、溶液,平衡5 分鐘后進樣. 混合1ml 90 %丙酮與300L 離子對溶液作為空白液. 用150L 標準液漂洗注射器2 次,注射器中吸入250L 標準液用于進樣,將注射器插入進樣閥,充滿100L 的進樣環管. 建立標準色素濃度與熒光峰面積(或高) 的標準曲線.(3) 混合1ml 90 %丙酮色素提取物與300L 離子對溶液,作為進樣樣品.(4) 使用兩步溶劑程序,用于優化葉綠素及其降解產物的分離. 進樣后,5 分鐘內將洗脫劑A 轉變為洗脫劑B ,維持B15 分鐘,流速為210mlPm. 在下一次進樣前,需用洗脫劑A 重新平衡色譜柱5 分鐘. 總分析時間約為25 分鐘.(5) 用下列公式計算各色

26、素的濃度Ci = AsFiVePVEVs式中Ci = 各色素的濃度mgPlAs = 各次進樣的色素峰面積Fi = 標準響應因子Ve = 進樣體積(011ml)VE = 萃取體積(ml)Vs = 樣品體積(l)(6) 這種方法僅用于葉綠素及其降解產物的定量.(7) 檢測限隨熒光計結構與流速而變,但對于大多數葉綠素與它們的降解產物來說,每次進樣檢測限范圍在10100pg. HPLC 法的精確度主要取決于色素標準樣的純度. 更理想的方法是測定標準樣的吸收光譜(350750nm) 并與文獻數據相比較. 色素的純度也可用HPLC 法來測定,條件是不存在能與標準物的吸收和熒光譜帶相重疊的共洗脫污染物. 如果分光光度法測得的數據經脫鎂色素校正,HPLC 的結果表達為色素當量(例如:葉綠素a 當量= 脫植基葉綠素a + 葉綠素a + 葉綠素a,假定使用正確的分子量校正值) ,那么HPLC 法與分光光度法提供的色素濃度與提供的EPA 標準符合得很好. 因此如果明顯的存在色素衍生物,用分光光度法測得的數據會偏高. 要HPLC 法與熒光法測得的數據一致則取決于附加的葉綠素b ,c 和它們的衍生物.6 HPLC 測定藻類葉綠素及類胡蘿卜素611 儀器和試劑除色素提取物