1、 收稿日期 : 2006-09-17美 國 進 境 大 豆 北 方 莖 潰 瘍 病 菌 的 分 離 與 鑒 定張建成 , 顧建鋒 , 徐 瑛 , 陳先鋒(浙江寧波出入境檢驗檢疫局 315012摘要 在對美國進境大豆檢疫過程中 , 對大豆籽粒和夾帶莖稈進行病原真菌的分離培養 , 使用形態學和分子生物學 相結合的方法對可疑菌株進行鑒定 , 確定該菌為 Diaporthe p haseolorum (Cke. &Ell. Sacc. var. caulivora Athow&Caldwell 。 該病原菌是進境植物檢疫潛在危險性病原真菌 , 在國內屬首次截獲 。關鍵詞 大豆北方莖潰瘍病菌 ; 鑒定

2、; 分子生物學 中圖分類號 S 41-33Isolation and identif ication of soybean Gu Xu Y ing , Chen Xianfeng(it ry I ns and Quarantine B ureau , Zhej iang 315012, China Abstract isolated f rom soybean seeds and stems imported f rom USA was identified. Both morpho 2logical and molecular characteristics showed it was Di

3、aporthe phaseolorum (Cke. &Ell. Sacc. var. caulivora Athow &Caldwell. This is the first report on this f ungus in China and it is a potential dangerous f ungus of soybean. K ey w ords Diaporthe phaseolorum var. caulivora; identification ; molecular biology 大豆北方莖潰瘍病菌 (Di a port he p haseolorumvar. ca

4、uli vora , DPC 是我國進境植物檢疫潛在危 險性真菌 1, 且被列入新修訂的進境植物檢疫性病 蟲雜草 A1類檢疫名錄 (未公布 。最先于 20世紀 40年代后期在美國 Iowa 州發現 , 當時病原菌被命名為 D. p haseolorum var. bat at atis 。隨后 ,At how 和 Caldwell 將 它 改 名 為 D.p haseolorum var.cauli vora 。 20世紀 50年代 , 北方莖潰瘍病在美國中北部地區流行 , 引起產量損失高達 50%。目前分 布于美國北部地區 、 加拿大 、 意大利 、 巴西 、 阿根廷 、 前南斯拉夫 。 并

5、且疫區還在不斷擴大 , 是國外大豆 生產上的重要病害 , 經濟影響很大 2-3。該病菌可通過種子和病殘體遠距離傳播 , 并且 抗逆性很強 , 病殘體在 -18 -15 下可存活 14個月 。 目前 , 我國尚沒有 DPC 發生危害的報道 ,但是中國大豆生產從北到南在不同氣候帶都有分 布 , 其中有很多和疫區相似的氣候區 , 一旦該病害傳 入我國 , 在適宜的條件下定殖 , 將對我國的大豆生產 產生嚴重影響 。2004年以來 , 寧波口岸加大了對進境大豆下腳料的檢疫力度 , 有針對性地對間座殼屬 (Di a port he , 無性態為擬莖點霉屬 Pomosis 病原菌進行檢測 。 2005年

6、6月 , 在美國進境的大豆下腳料中截獲一病菌 , 通過形態學和分子生物學相結合的方法對其進 行了鑒定 , 確定其為 DPC , 初步建立了一套 DPC 的 鑒定方法 , 這是國內首次截獲并報道該病菌 , 并于 2006年初用此方法再次檢出該病菌 。1 材料與方法1. 1 材料美國進境大豆中夾帶的豆稈及干癟的大豆籽粒。 1. 2 分離培養 挑取有病斑或褐變等可疑癥狀的豆稈 , 使用 1%次氯酸鈉 (NaOCl 對其進行表面消毒 30s , 滅菌 水漂洗 3次 , 置于鋪好 3層濕潤吸水紙的培養皿中 , 12h 光照 ,12h 黑暗交替 ,25 恒溫保濕培養 ,5d后每天觀察 。 將選取的干癟的大

7、豆籽粒使用同莖稈 相同的表面消毒方法 , 在 PDA 培養基上 25 恒溫 培養 ,5d 后每天觀察 。 將上述方法培養出的真菌菌 絲或子實體在 PDA 平板上分離純化 。401 第 33卷第 2期 (2007 PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007調 查 研 究1. 3 形態鑒定在 L EICA S8APO 解剖鏡和 ZEISS Axioskop 40顯微鏡下觀察病原菌在豆稈上形成的子囊殼、 子囊和 子囊孢子 , 使用 L EICA DFC320數碼攝像頭配合 L EI 2 CA Qwin V3軟件記錄其形態并測量大小。并對 PDA 平板上的菌落形態 , 產

8、孢情況進行詳細記錄。 1. 4 致病性測定使用牙簽法 4, 在苗齡 14d 的大豆幼苗下胚軸 用牙簽劃一傷口 , 取菌齡 7d 的菌落邊緣菌塊 (直徑 約 4mm 覆蓋于傷口 , 用無菌凡士林封閉傷口 , 接種 4株 , 并用 PDA 培養基小塊作對照 。接種后的前 72h , 在氣候箱內保持相對濕度 90%以上 。1. 5 分子生物學鑒定1. 5. 1 總 DNA 提取采用易潤華等的方法 5。 1. 5. 2 Pomo sis/Diaport he 屬特異 PCR參照 A W ZHAN G 等方法 6, 對sis/Diaporthe I I I分 離 物 總 PhomI:5 -GA GCTC

9、GCCACT A GGG -3 , PhomII: 5 -GGCGGCCAACCAAACTCTTGT -3 。 引物由 上海博亞生物技術有限公司提供合成 。以本實驗室 分離保存的 Phomopsis lon gicoll a 做陽性對照 , 以 重蒸水做陰性對照 。 PCR 反應總體積 50L , 反應 體系中各試劑的終濃度為 :1buffer 、 2. 5mmol/L MgCl 2、 0. 2mmol/L dN TP 、 引物各 50p mol ,2. 5U Taq 聚合酶 (Takara , 大連 、 模板 DNA 25ng 、 用 dd H 2O 使終體積達到 50L 。使用 GeneA

10、mp PCR System 9700PCR 儀 (AB I 公司 進行 PCR 反應 , 反 應過程為 96 熱變性 3min ; 然后進行 40個循環 , 每個循環 95 變性 0. 5min 、 60 退火 0. 5min 、 72 延伸 1min ; 最后 72 延伸 7min 。1. 5. 3 ITS 區 PCR用真菌通用引物 ITS4和 ITS5擴增總 DNA , 由 上海博亞生物技術有限公司合成 (ITS4:5 -TC 2 CTCC GC T TA T T GA TA T GC -3 , ITS5:5 -GGAA GTAAAA GTC GTAACAA GG -3 。反應 體系同 P

11、homopsis 屬特異 PCR 體系 。使用 Gene 2 Amp PCR System 9700PCR 儀 (AB I 公 司 進 行 PCR 反應 , 反應過程為 96 熱變性 3min ; 然后進 行 35個循環 , 每個循環 94 變性 1min 、 55 退火 1min 、 72 延伸 2min ; 最后 72 延伸 7min 。 1. 5. 4 DNA 測序ITS 區 PCR 產物經純化后直接用于測序 ,DNA 測 序由上海生工生物工程科技有限公司完成 , 使用 ABI 3700測序儀 , 采用雙脫氧測序法 , 測序引物為 ITS4和 ITS5, 進行雙向測序。 校對測序結果并拼

12、接序列。 1. 5. 5 RFL P 分析ITS 區 PCR 產 物 使 用 限 制 性 內 切 酶 A l u I , Rsa I , H ha I , Mse I 和 S cr FI (Takara , 大連 進行酶 切 , 按照每種酶的說明書 , 將 1. 0L 限制性內切酶 , 1. 5L 10buffer ,6L PCR 產物 ,6. 5L dd H 2O 混合 , 在每種酶的適宜酶切溫度下孵育 3h 。 PCR 酶切產物在 2%的瓊脂糖凝膠上電泳 , 根據 Marker 判斷 DNA 片段大小 。1. 5. 6 數據分析(BL AST 搜索 , 比 。 GenBank 上選取同屬的

13、代表性菌株 , 并以 Gaeu 2 m annom yces g rami nis 做為序列分析的外群 7。利 用 ClustalX 1. 8. 1進行序列比對 , 通過 M EGA 3. 1軟件選用 K imura 22parameter 距離模型進行 U P G 2 MA 分析生成系統發 育樹 , 發育 樹用 自展 (Boot 2 st rap 分析法進行檢驗 , 循環 1000次 。2 結果與分析2. 1 形態描述保濕培養 14d 后 , 肉眼可見灰褐色豆稈上生出 大量黑色的突起 (圖 1a , 為病菌的子囊殼喙 。子囊 殼后期溢出一條條白色須狀的孢子角 。子囊殼黑 色 、 球形 , 單

14、生或 212個叢生 , 直徑 (165340 m (282412 m , 埋生于豆稈表皮中 。喙表面光 滑 , 喙長 180336m , 寬 75110m , 喙寬度均 勻 , 頂 部 鈍 圓 。子 囊 (5. 65. 8 m (25. 7 27. 8 m , 長棍棒狀 , 壁薄 , 易消解 , 頂部有清晰的折 光環 。 子囊孢子 (2. 32. 5 m (8. 18. 4 m , 透明 , 紡錘形 , 雙細胞 , 分隔處略縊縮 , 常含油球 。 同時 PDA 平板上培養的帶病種子生白色絮狀 霉層 , 挑取純培養 。兩種方法得到的純培養菌株都 性狀相似 , 在 PDA 培養基上 2025 下生

15、長良好 , 7d 后長滿培養皿 , 菌落白色 , 叢生絮狀長毛 , 后期菌 落顏色 無變 化 , 只 在 培 養 基 背 面 有 黃 色 素 產 生 。 28d 后 , 子囊殼在不發達的小子座上形成 。子囊形 狀大小與大豆莖稈 、 種子分離物相似 。未見分生孢 子器及分生孢子 。 5 01調 查 研 究 第 33卷第 2期 (2007 PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007 圖 1 大豆北方莖潰瘍病菌培養物形態2. 2 致病性測定兩種分離物分別接種大豆幼苗 。傷口接種 7d后可見創口邊緣呈褐色 , 且延伸狀擴展 , 整株枯萎 ,4株大豆幼苗都發病死亡 , 對照

16、僅在傷口處有破損 。剪取接種點上下部莖稈 , 經表面消毒后用 PDA 培養基分離 , 獲得純培養 , 其菌落特征 、 子囊孢子形態大小與豆稈及帶病種子原始分離物純培養一致 。2. 3 分子生物學鑒定使用 Phomopsis 屬 特 異 性 引 物 Phom 和Phom 擴增陽性對照 P. lon gicoll a 和待測菌株 ,得到 1條 300bp 左右的特異性條帶 , 如圖 2, 和報道的 337bp 條帶大小基本吻合 6。使用 5種限制性內切酶對 ITS 區擴增產物進行酶切 , 得到酶切圖譜如圖 3。 5種限制性內切酶有不同的酶切位點 , 根據 Marker 可以判斷出酶切片段的大小范圍

17、 。 文獻報道 ,DPC 的 PCR 產物長度 600bp左右 , 酶 RsaI 沒有酶切位點 , 其他 4種酶切產物的特征片段長度分別是 :A l u I ,281bp 、 176bp ; 第 3條為 145bp 或 146bp ; H ha I ,260bp 和 226bp ; 還有一類菌株是 228bp 和 134bp ; Mse I ,484bp ; S cr FI ,254bp 和 96bp 8。 對比研究菌株的酶切圖譜 , 可以初步判定與報道的 DPC 病菌酶切結果相似 。圖 2 Phomopsis 屬特異性引物擴增結果圖 3 大豆北方莖潰瘍病菌 PCR 2RF LP 酶切圖譜兩種

18、來源的分離物的 ITS 區 PCR 擴增產物經 測序比對 , 發現堿基序列完全相同 , 共有 601bp 。 序 列在 GenBank 上進行 BL AST 搜索 , 經比對分析 , 所 檢測的樣品的序列同 Zhang 等人報道的 D. p hase 2 olorum var. cauli vora 菌株 713的序列 (A F000567 完全 相 同 ; 與 其 他 兩 種 被 鑒 定 為 DPC 的 序 列 (A F000563,A F000212 都僅有 1個堿基的差異 , 相 似度也達到 99%。聚類樹說明測試菌株與其他兩 個 DPC 菌株成為一組的支持率相當高 。根據分離菌株的子囊

19、及子囊孢子的形態特征能 夠鑒定到 Diaporthe 屬 , 同時由該菌株能夠使大豆幼 苗致病 , 是大豆上的一種寄生菌 , 結合進境大豆常見 病原真菌的特征 , 可以初步判定該菌株屬于 Dia 2 porthe phaseolorum , 根據文獻報道 9, 由子囊著生特 征、 子囊孢子大小可以判斷接近于 DPC 。 分子生物學 方法 結 果 表 明 該 菌 株 屬 于 Pomosis/Diaporthe 屬。 PCR 2RFLP 分析表明與 DPC 酶切圖譜非常相似。 ITS 保守區的基因分析表明此種真菌在序列上與 DPC 的 一個菌株完全相同 , 與 Pomosis 屬其他種的遺傳距離

20、較遠 , 所以可以判定此種真菌是 DPC 的一個菌株。 6 1 第 33卷第 2期 (2007PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007調 查 研 究 Template. 本次研究的菌株 ; 其余序列左邊是 GenBank 中的登記號 , 右面對應其種類圖 4 基于 ITS rDNA 序列經 UPG MA 檢測的系統發育樹 (分支上的數字代表 1000次自舉檢測支持率 3 討論大豆北方莖潰瘍病病原菌屬于子囊菌門、 球殼目、間座殼科、 間座殼屬 , 無性階段為擬莖點霉屬。 在美國、阿根廷等國大豆生產上 , 能與大豆莖莢枯腐病菌 (黑點病菌 (D. phaseolor

21、um var. soj莖點種腐病菌 (病菌 (D. (DPM 共同引起間座殼 -Diaporthe 2Phomopsis com 2plex , 危害超過其中任何單一真菌病害 9。 除 DPS 外的其余 3種病菌在我國未見報道。近年來 , 從美國 、 巴西 、 阿根廷等國進境的大豆逐年增加 ,2005年海關統計數據達到 2659萬 t 。 本試驗證明不但大豆籽粒能夠攜帶病菌 , 大豆莖稈等大豆下腳料也可以成為帶菌載體 。而所有進境大豆中都攜帶著大量豆稈 、 豆莢 、 土塊 、 各類雜草籽等雜質 。 如果對進境大豆的檢測能力不足 , 對大豆加工廠的監管不嚴 , 很可能造成各類危險性有害生物的擴散

22、和危害 。 因此 , 必須加強對大豆危險性有害生物檢測和鑒定方法的研究 , 盡快在各口岸推廣 。另外還要進一步加強對各大豆加工廠的檢疫監管 , 對下腳料進行無害化處理 , 嚴防有害病菌入侵 。筆者曾于 2004年 3月從美國大豆稈中檢出 P.longicolla, 由于該病菌未發現有性階段 , 分生孢子器表面較粗糙 , 莖稈保濕培養分生孢子產生時期較早 ,較容易與其他 3種病菌區分。 DPS 的子囊和子囊孢子明顯較大 , 也較容易區分。 DPC 與 DPM 很接近 , 子囊和子囊孢子差異不大。 有報道稱 DPM 子囊殼散生 , 喙寬 100m 左右 , 菌落老熟后呈褐色 ; 而 DPC 子囊殼

23、叢生 , 喙寬 60m 左右 , 菌落老熟后仍呈白色 9。但在實際鑒定過程中 , 大豆莖稈上的 DPC 也有密集和散生的情況 , 喙的長寬也因不同菌株而有差異 , 子囊、 子囊孢子的大小也有不同。 近年來 , 利用病原菌核糖體 ITS (internal transcribed 區域進行病害診斷 區具有相對保守 性 , , 可以通過 PCR, 隨著 DNA 測序技術的不斷成熟 , , 而時間在不斷縮短。 病 原真菌通過在 G enbank 比對基因保守區測序結果 , 結 合形態學檢測結果和致病性鑒定結果 , 鑒定到菌株所 屬種的方法已經趨向成熟。通過大豆病原真菌的更多檢出與標準菌株的積 累 ,

24、 可以在 ITS 區序列基礎上設計特異性引物 , 直接 從大豆種子和豆稈上檢測區分大豆上的各種檢疫性 病原物 , 以滿足口岸檢測準確 、 快速的要求 。參考文獻1 吳品姍 , 嚴 進 . 值得關注的大豆新病害 J.植物檢疫 ,2003, 17(4 :226-228.2 BACKMAN P A , WEAV ER D B , MOR GAN 2J ON ES G. Soy 2 bean stem canker :anemerging disease problemJ.Plant Dis 2 ease ,1985,69(8 :641-647.3 PIOL I R N , MORANDI E N ,

25、 MAR TIN EZ M C ,et al. Mor 2 phologic , molecular and pat hogenic characterization of Dia 2 port he p haseolorum variability in t he core soybean producing area of ArgentinaJ.Phytopat hology ,2003,93:136-140. 4 KEEL IN G B L. A seeding test for resistance to soybean stem canker caused by Diaport he

26、 p haseolorum var. caulivora J. Phytopat hology , 1982,72:807-809.5 易潤華 , 朱西儒 , 周而勛 . 簡化 CTAB 法快速微量提取絲狀真菌 DNAJ.湛江海洋大學學報 ,2003,23(6 :72-73.6 ZHAN G A W , HAR TMAN G L , RICCIONI L ,et al. Using PCR to distinguish Di aport he p haseolorum and Phomopsis longicolla from other soybean fungal pathogens an

27、d to detect them in soybean tissuesJ.Plant Disease ,1997,81:1143-1149. 7 FARR D F ,CASTL EBU R Y L A , ROSSMAN A Y. Morpho 2 logical and molecular characterization of Phomopsis vacci nii and additional isolates of Phomopsis from blueberry and cranberry in the eastern United StatesJ.Mycologia ,2002,9

28、4:494-504. 7 0 1調 查 研 究 第 33卷第 2期 (2007PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007 8 ZHAN G A W ,RICCIONI L ,PEDERSEN W L ,et al. Molecu 2lar identification and phylogenetic grouping ofDiaport hephaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybeanJ.Phytopat hology ,1998,88:1306-1314.9 HARTMAN G L , S

29、INCLAIR J B , RUPE J C. Compendium ofS oybean Disease (4th Edition M.Minnesota :APSPress ,1999.收稿日期 : 2006-08-083致 謝 : 本文昆蟲學名由浙江大學徐志宏教授鑒定 。雙 斑 錦 天 牛 的 生 物 學 特 性 及 防 治3余黎紅 , 陳國利 , 劉國軍(浙江省常山縣林業局 324200摘要 雙斑錦天牛 A calole pta subl usca (Thomson 在常山縣危害大葉黃楊 ,1年發生 1代 , 以老熟幼蟲在受害植株 蛀道中越冬 ,4月上旬至 6月中旬化蛹 ,5月上旬至

30、7月上旬成蟲羽化 ,5,5月中旬幼蟲孵 化 ,11月幼蟲停止取食進入越冬 。 根據其生活習性提出了綜合防治措施 , 關鍵詞 雙斑錦天牛 ; 生物學特性 ; 防治措施 中圖分類號 S 433. 5pt a subl uscaYu , Chen Guoli , Liu Guojun(Forest ry B ureau of Zhej iang Province , 324200, China Abstract Only one generation of Acalolepta sublusca (Thomson occurred in a year in Changshan , Zhejiang

31、Province , and it overwintered as old larvae in the tunnels of the trunks. The overwintering larvae pupated from early April to mid 2J une. The adults emerged from early May to early J uly. The females began to lay eggs in early May. The larvae appeared in mid 2May. Integrated control measures were taken ag