1、1第五章第五章 分子熒光光譜分析分子熒光光譜分析第一節第一節 熒光光譜法的基本原理熒光光譜法的基本原理日常生活中的熒光現象日常生活中的熒光現象:印染廠的廢水在陽光下發印染廠的廢水在陽光下發 光、公路上的各種標志等。光、公路上的各種標志等。分子熒光光譜法分子熒光光譜法(Molecular fluorescence (Molecular fluorescence spectroscopyspectroscopy ) )又稱為熒光光譜法或熒光分析又稱為熒光光譜法或熒光分析法是以物質所發射的熒光強度與濃度之間的線法是以物質所發射的熒光強度與濃度之間的線性關系為依據進行的定量分析，以熒光光譜的形性關系為

2、依據進行的定量分析，以熒光光譜的形狀和熒光峰對應的波長進行行的定性分析狀和熒光峰對應的波長進行行的定性分析2光致發光光致發光（PhotoluminescencePhotoluminescence）: : 熒光和磷光是分子吸光成為激發態分子，在返熒光和磷光是分子吸光成為激發態分子，在返回基態時的發光現象回基態時的發光現象. . 熒光熒光：受光激發的分子從第一激發單重態的最：受光激發的分子從第一激發單重態的最 低振動能級回到基態所發出的輻射。低振動能級回到基態所發出的輻射。 磷光：磷光：從第一激發三重態的最低振動能級回到從第一激發三重態的最低振動能級回到 基態所發出的輻射。基態所發出的輻射。3分子

3、的多重態分子的多重態單重態單重態 一個所有電子自旋都配對的分子的電子一個所有電子自旋都配對的分子的電子 狀態。大多數有機物分子的基態是單重態。狀態。大多數有機物分子的基態是單重態。 當基態一對電子中的一個被激發到較高能當基態一對電子中的一個被激發到較高能 級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于 單重態。單重態。三重態三重態 有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態。有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態。 激發三重態能量較激發單重態低。激發三重態能量較激發單重態低。45一、分子退激發的過程一、分子退激發的過程激發態分子回基態的途徑很多，速度最快的途徑占激發態分子回基

4、態的途徑很多，速度最快的途徑占優勢。優勢。1、振動馳豫、振動馳豫 1）分子吸收光子后，可能被激發到激發態的各個）分子吸收光子后，可能被激發到激發態的各個 振動能級振動能級 2）通過碰撞（非輻射躍遷）到達同一激發態的最）通過碰撞（非輻射躍遷）到達同一激發態的最 低振動能級低振動能級 需時間需時間10-1310-11sec，效率較高，效率較高2、熒光發射、熒光發射6 分子從單重激發態的最低振動能級發射光子回分子從單重激發態的最低振動能級發射光子回到基態到基態熒光發射。熒光發射。 熒光光譜的波長比吸收光的波長大（長），這熒光光譜的波長比吸收光的波長大（長），這種現象叫作種現象叫作紅移或斯托克斯位移。

5、紅移或斯托克斯位移。3、內部轉換、內部轉換 1）分子內過程，熱退激）分子內過程，熱退激 2）兩個激發態重疊的能級發生內轉換，因此吸）兩個激發態重疊的能級發生內轉換，因此吸收收1、 2 兩種波長的光后，都產生兩種波長的光后，都產生 2 的熒光。的熒光。4、外轉換、外轉換 激發態分子與溶劑或其它溶質間相互作用和能量激發態分子與溶劑或其它溶質間相互作用和能量轉換。轉換。75、能系間交叉躍遷、能系間交叉躍遷 電子自旋被反轉，使分子的多重性發生變化電子自旋被反轉，使分子的多重性發生變化6、磷光、磷光從三重態最低振動能級回到基態，放出磷光。從三重態最低振動能級回到基態，放出磷光。二、影響熒光強度的因素二、

6、影響熒光強度的因素1、熒光效率（、熒光效率（熒光量子產率熒光量子產率）物質分子發射熒光的能力用熒光量子產率（物質分子發射熒光的能力用熒光量子產率（）表）表示：示：89吸收的光子數吸收的光子數發射的光子數發射的光子數激發態的分子數激發態的分子數發射熒光的分子數發射熒光的分子數=Fff f與退激發過程的速率常數與退激發過程的速率常數k k有關有關icececiffkkkkk+ + + +=Ff 凡是使熒光速率常數凡是使熒光速率常數k kf f增大而使其他退激發過程增大而使其他退激發過程（能系間交叉、外轉換、內轉換的速率常數減小的（能系間交叉、外轉換、內轉換的速率常數減小的因素都可使熒光增強。因素都

7、可使熒光增強。K Kf f、K Ki i與分子結構有關，與分子結構有關，K Kecec、K Kicic與分子所處的環與分子所處的環境有關境有關10高熒光分子高熒光分子f 1 1，無熒光分子，無熒光分子f 0 02 2、影響熒光強度的因素、影響熒光強度的因素 1 1）熒光與分子結構的關系）熒光與分子結構的關系 a a、能吸收紫外可見光，有共軛雙鍵，分子呈剛、能吸收紫外可見光，有共軛雙鍵，分子呈剛性、平面、多環結構，而且共軛平面越大、性、平面、多環結構，而且共軛平面越大、電子共電子共軛度越大，軛度越大， f越高。越高。 b b、取代基的影響、取代基的影響 給電子基團使給電子基團使f增強，如增強，如

8、-NH-NH2 2、-OH-OH 與與電子體系相互作用小的取代基對熒光影響小電子體系相互作用小的取代基對熒光影響小11 高原子序數的原子引入高原子序數的原子引入電子體系，使熒光減弱電子體系，使熒光減弱 吸電子基團，如：吸電子基團，如：-COOH -COOH 、NONO2 2 、N=ON=O2 2、 鹵鹵素素使熒光熄滅。使熒光熄滅。 剛性平面結構有利于熒光，因為剛性結構可以剛性平面結構有利于熒光，因為剛性結構可以減少分子振動，減少能系交叉和碰撞退激。減少分子振動，減少能系交叉和碰撞退激。 2 2）溫度和溶劑效應）溫度和溶劑效應 溫度升高，溫度升高， f下降下降 溶液黏度下降，溶液黏度下降， f下

9、降下降 不能使用含有重原子的溶劑不能使用含有重原子的溶劑12 溶劑極性增加有時會使熒光強度增加，熒溶劑極性增加有時會使熒光強度增加，熒光波長紅移；若溶劑和熒光物質形成氫鍵或光波長紅移；若溶劑和熒光物質形成氫鍵或使熒光物質電離狀態改變，會使熒光強度、使熒光物質電離狀態改變，會使熒光強度、熒光波長改變。熒光波長改變。13 3）pH值的影響值的影響 熒光物質的電離與非電離形式的熒光物質的電離與非電離形式的f有差別，有差別，帶帶有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pHpH關；關； 4）溶解氧的影響）溶解氧的影響 溶解氧的存在使溶解氧的存在使f下降下降14第二節第

10、二節 熒光分光光度計熒光分光光度計一、基本構造一、基本構造 1 1、光源、光源 強度較高的氙燈或氙汞燈，要求有穩定的供電源。強度較高的氙燈或氙汞燈，要求有穩定的供電源。 2 2、單色器、單色器 兩個，互成直角兩個，互成直角 3 3、樣品池、樣品池 四通杯四通杯 4 4、檢測器、檢測器 光電倍增管光電倍增管15二、儀器光路二、儀器光路光源光源激發單色器激發單色器樣品池樣品池發射單色器發射單色器檢測器檢測器16第三節第三節 熒光光譜法的基本參數及測量熒光光譜法的基本參數及測量一、熒光強度一、熒光強度根據朗伯根據朗伯- -比爾定律比爾定律Ia=IIa=I0 0-I=I-I=I0 0(1-10(1-1

11、0-bc-bc) ) 則則I If f=f fI I0 0（1-101-10-kbc-kbc)=I)=I0 0(1-e(1-e-2.303k=bc-2.303k=bc) ) 對于稀溶液，對于稀溶液，kbc=A A0.05 I If f= 2.303 = 2.303 f f I I0 0 kbkbc c當當I I0 0一定并且濃度一定并且濃度C C很小時很小時, ,熒光強度與熒光物質濃度成正比熒光強度與熒光物質濃度成正比 I If f= KC K = 2.303 I= KC K = 2.303 I0 0 kb)kb)17Cmax0.05/kb當當C超過超過Cmax 時，時，IfC偏離線性偏離線性

12、溶液濃度太大，熒光分子之間及熒光分子與溶劑分溶液濃度太大，熒光分子之間及熒光分子與溶劑分子之間碰撞，發生非輻射躍遷，使熒光強度下降。子之間碰撞，發生非輻射躍遷，使熒光強度下降。熒光自熄滅：熒光自熄滅：C增大到一定程度，就會發生熒光自熄滅現象增大到一定程度，就會發生熒光自熄滅現象熒光自吸收：熒光自吸收：熒光熒光波長與激發光波長重疊時，熒光被吸收熒光熒光波長與激發光波長重疊時，熒光被吸收18二、激發光譜與發射光譜二、激發光譜與發射光譜激發光譜激發光譜:固定發射波長固定發射波長(EM),一般在最大發射位置一般在最大發射位置 做做If EX的光譜，既不同波長激發光所的光譜，既不同波長激發光所 產生熒光

13、的相對效率。產生熒光的相對效率。發射光譜發射光譜:固定激發波長固定激發波長(Ex),一般在最大吸收位置一般在最大吸收位置 做做If EM的光譜，既最大吸收波長下產的光譜，既最大吸收波長下產 生熒光的相對強度。生熒光的相對強度。目的目的:找到找到EXmax 和和EMmax19三、熒光分析法三、熒光分析法直接熒光法：樣品本身發熒光，直接測定其熒光強直接熒光法：樣品本身發熒光，直接測定其熒光強 度，按吸收定律計算樣品濃度。度，按吸收定律計算樣品濃度。間接熒光法：樣品本身不發熒光，通過探測劑（強間接熒光法：樣品本身不發熒光，通過探測劑（強 熒光物質）間接測定。熒光物質）間接測定。 探測劑稱為熒光探針探測劑稱為熒光探針樣品濃度的定量計算采用標準曲線法樣品濃度的定量計算采用標準曲線法20四、熒光分析法的應用四、熒光分析法的應用無機物分析無機物分析 無機離子中除少數例外一般不發熒光無機離子中除少數例外一般不發熒光. .但很多無但很多無機離子能與一些有機試劑形成熒光絡合物機離子能與一些有機試劑形成熒光絡合物, ,而進行定量測定而進行定量測定. .生物化學及生理醫學方面的應用生物化學及生理醫學方面的應用 熒光法對于生物中許多重熒光法對于生物中許多重要的化合物具有很多的靈敏度和較好的物效性要的化合物具有很多的靈敏度和較好的物效性, ,故廣用于生故廣用于生物